Name: שיטות ספקטרופוטומטריות לחקר מטבוליזם גליקוגן אאוקריוטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: למד שיטות ספקטרופוטומטריות לחקר מטבוליזם גליקוגן אאוקריוטי ללא שימוש בייזוטופים רדיואקטיביים. השיטות מאפשרות למדוד פעילות אנזימים בבטיחות ובעלות נמוכה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר רוצה להודות לקרוליין דיטמר ואנדרו בריטינגהם על תובנותיהם ודיונים מועילים רבים. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מקרן החינוך והמחקר האוסטאופתית של איווה (IOER 03-17-05 ו- 03-20-04).

<ol><li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li>
<li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li>
<li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+and+its+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li>
<li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase%2C+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li>
<li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose%3A1%2C4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li>
<li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li>
<li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li>
<li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1%2C6-glucosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li>
<li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li>
<li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li>
<li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li>
<li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li>
<li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme%22%5BJournal%5D)">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li>
<li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose-1%2C+6-diphosphatase%2C+phosphofructokinase%2C+glycogen+synthetase%2C+phosphorylase%2C+and+protein+kinase+from+swine+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li>
<li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, Pt 2 129-132 (1990).</li>
<li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1%2C6-glucosidase-oligo-1%2C4-1%2C4-transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li>
<li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification%2C+properties+and+physiological+role%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li>
<li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain%3A+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li>
<li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+EYC+%22The+Enzymes+Vol.+5%22">The Enzymes Vol. 5</a>. Boyer, P. D. , Academic Press. 191-234 (1971).</li>
<li>Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+of+amylose+and+iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">The complex of amylose and iodine.</a> Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).</li>
<li>Boyer, C., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+b+alpha-1%2C4%2C-glucan%3A+alpha-1%2C4-glucan+6-glycosyltansferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li>
<li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li>
<li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li>
<li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li>
<li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li>
<li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li>
<li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+and+its+metabolism%3A+some+new+developments+and+old+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).</li>
<li>Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycosyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).</li>
<li>Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis%3A+An+unusual+member+of+the+starch%2Fglycogen+synthase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li>
<li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-1%2C4-glucan%3A+alpha-1%2C4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li>
<li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+oyster+glucogen%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li>
<li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li>
</ol>

לא ידוע על ניגודי עניינים הקשורים לעבודה זו ולא הייתה כל תמיכה כספית לעבודה זו שיכולה הייתה להשפיע על תוצאותיה.

באופן כללי, היתרונות העיקריים של כל השיטות המוצגות הם העלות הנמוכה, הקלות, המהירות וחוסר ההסתמכות על ציוד מיוחד. החיסרון העיקרי המשותף לכולם הוא רגישות בהשוואה לשיטות זמינות אחרות. קל להעריך את הרגישות של ההליכים הכרוכים בייצור או צריכה של NADH/NADPH. בהתחשב בכך שמקדם ההכחדה של NADH/NADPH הוא 6.22 M-1 cm-1, אריתמטיקה פשוטה מצביעה על כך שניתן לזהות בקלות שינויים של ~10-20 μM בריכוז. עם נפחי הבדיקה המתוארים במאמר הנוכחי, זה מתאים ליכולת למדוד כמויות בטווח של ~ 10-20 nmol. אפשר לטעון שזה די רגיש. עם זא...

גליקוגן מופץ באופן נרחב בטבע, כאשר התרכובת נמצאת בחיידקים, פרוטיסטים רבים, פטריות ובעלי חיים. במיקרואורגניזמים, גליקוגן חשוב להישרדות התאים כאשר חומרי המזון מגבילים, ובאורגניזמים גבוהים יותר כמו יונקים, סינתזה ופירוק של גליקוגן משמשים למאגר רמות הגלוקוז בדם 1,2,3. חקר חילוף החומרים של גליקוגן הוא, אם כן, בעל חשיבות לתחומים מגוונים כגון מיקרוביולוגיה ופיזיולוגיה של יונקים. הבנת חילוף החומרים של גליקוגן דורשת לחקור את האנזימים העיקריים של סינתזת גליקוגן (גליקוגן סינתאז ואנזים המסתעף) ופירוק גליקוגן (גליקוגן פוספורילאז ואנזים מסתעף). מבחני תקן הזהב של גליקוגן סינתאז, פוספורילאז, הסתעפות ופירוק פעילויות אנזימים משתמשים באיזוטופים רדיואקטיביים. לדוגמה, גליקוגן סינתאז נמדד בדרך כלל בבדיקה רדיוכימית עצורה על ידי שילוב של גלוקוז מ-UDP-[14 C]גלוקוז (במקרה של אנזימים מן החי והפטריות) או ADP-[14C]גלוקוז (במקרה של אנזימים חיידקיים) לתוך גליקוגן 4,5. באופן דומה, גליקוגן פוספורילאז נמדד בכיוון של סינתזת גליקוגן, בעקבות שילוב גלוקוז מ[14C]גלוקוז-1-פוספט לתוך גליקוגן6. אנזים ההסתעפות נבדק על ידי מדידת יכולתו של אנזים זה לעורר שילוב של [14 C]גלוקוז מגלוקוז-1-פוספט לשרשראות α1,4 מקושרות על ידי גליקוגן פוספורילאז7, ופעילות האנזים המתפרק נקבעת על ידי מעקב אחר יכולתו של האנזים לשלב [14C]גלוקוז בגליקוגן8 . למרות שהם רגישים מאוד, ומאפשרים את השימוש בהם בתמציות תאים גולמיים עם רמות נמוכות של פעילות אנזימים, הסובסטרטים הרדיואקטיביים יקרים וכפופים לדרישות הרגולטוריות הנלוות לשימוש ברדיואיזוטופים. חסמים אלה מציבים את השימוש במבחנים מסוימים מחוץ להישג ידם של עובדים רבים. עם זאת, במשך שנים רבות תואר מגוון מרשים של גישות ספקטרופוטומטריות למדידת אנזימים אלה. באופן כללי, גישות אלה מסתמכות בסופו של דבר על מדידת הייצור או הצריכה של NADH/NADPH, או על יצירת קומפלקסים צבעוניים בין גליקוגן ליוד. לפיכך, הם פשוטים וניתן לבצע אותם באמצעות ספקטרופוטומטרים פשוטים המצוידים רק במנורות הבזק טונגסטן או קסנון.
בדיקות ספקטרופוטומטריות של גליקוגן סינתאז מסתמכות על מדידת הנוקלאוזיד דיפוספט המשתחרר מתורם נוקלאוטיד הסוכר, כאשר גלוקוז מתווסף לשרשרת הגליקוגןההולכת וגדלה 9,10. הנוהל למדידת פעילות גליקוגן סינתאז המתואר בסעיף 1 לפרוטוקול, להלן, הוא שינוי של זה שתואר על ידי Wayllace et al.11, וסכמת הצימוד מוצגת להלן:
(גלוקוז) n + UPD-גלוקוז → (גלוקוז)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + פוספונולפירובט → פירובט + ATP
פירובט + NADH + H+ → לקטט + NAD+
גליקוגן סינתאז מוסיף גלוקוז מ-UDP-גלוקוז על גליקוגן. ה-UDP שנוצר בתהליך זה מומר ל-UTP על ידי נוקלאוזיד דיפוספט קינאז (NDP kinase), בתגובה שיוצרת ADP. ה- ADP, בתורו, משמש כמצע לפירובט קינאז, אשר פוספורילטים את ה- ADP באמצעות פוספונולפירובט כתורם פוספט. הפירובט המתקבל מומר ללקטט על ידי האנזים לקטט דהידרוגנאז בתגובה הצורכת NADH. הבדיקה יכולה, אם כן, להתבצע באופן רציף, תוך מעקב אחר הירידה בספיגה ב 340 ננומטר כמו NADH נצרך. הוא מותאם בקלות לשימוש עם אנזימים הדורשים ADP-גלוקוז כתורם גלוקוז. כאן, שלבי הצימוד פשוטים יותר מכיוון שה-ADP המשתחרר על ידי פעולת הגליקוגן סינתאז מופעל ישירות על ידי פירובט קינאז.
קיימים מגוון מבחנים ספקטרופוטומטריים לקביעת פעילות גליקוגן פוספורילאז. בגרסה הקלאסית, האנזים מונע לאחור, בכיוון של סינתזת גליקוגן, כפי שמוצג להלן:
(גלוקוז) n + גלוקוז-1-פוספט → (גלוקוז)n+1 + Pi
במרווחי זמן מתוזמנים מוסרים אליקוטים של תערובת התגובה, וכמות הפוספט המשוחררת מכמתת12,13. בידינו, בדיקה זו הייתה בשימוש מוגבל בשל נוכחותו של פוספט חופשי הניתן למדידה בקלות בתכשירים מסחריים רבים של גלוקוז-1-פוספט, בשילוב עם הריכוזים הגבוהים של גלוקוז-1-פוספט הדרושים לפעולת פוספורילאז. במקום זאת, השתמשנו באופן שגרתי בבדיקה חלופית המודדת את הגלוקוז-1-פוספט המשתחרר כאשר הגליקוגן מתפרק על-ידי זרחן13. נעשה שימוש בסכמת תגובה מצומדת, המומחשת להלן.
(גלוקוז) n + Pi → (גלוקוז)n-1 + גלוקוז-1-פוספט
גלוקוז-1-פוספט → גלוקוז-6-פוספט
גלוקוז-6-פוספט + NADP + → 6-פוספוגלוקונולקטון + NADPH + H+
הגלוקוז-1-פוספט מומר לגלוקוז-6-פוספט על-ידי פוספוגלוקוטאז, והגלוקוז-6-פוספט מתחמצן ל-6-פוספוקונולקטון, עם הפחתה מקבילה של NADP+ ל-NADPH. הנוהל המפורט בסעיף 2 לפרוטוקול, להלן, נגזר משיטות שתוארו על ידי Mendicino et al.14 ו- Schreiber & Bowling 15. הבדיקה יכולה להתבצע בקלות באופן רציף, עם עלייה בספיגה ב 340 ננומטר לאורך זמן, המאפשר את קביעת קצב התגובה.
קביעה ספקטרופוטומטרית של פעילות אנזים מתפרקת מסתמכת על מדידת הגלוקוז המשתחרר על ידי פעולת האנזים על גבול הזרחן דקסטרין16. תרכובת זו מיוצרת על ידי טיפול ממצה בגליקוגן פוספורילאז. מאחר שפעולת הגליקוגן פוספורילאז עוצרת 4 שאריות גלוקוז מנקודת ענף α1,6, דקסטרין הגבול מכיל גליקוגן, שהשרשראות החיצוניות שלו קוצרו ל~4 שאריות גלוקוז. הכנת דקסטרין גבול הפוספורילאז מתוארת כאן, באמצעות הליך הנגזר מאלו שפותחו על ידי Taylor et al.17 ו- Makino & Omichi 18.
פירוק הוא תהליך בן שני שלבים. פעילות 4-α-glucanotransferase של אנזים הפירוק הדו-כיווני מעבירה תחילה שלוש שאריות גלוקוז מנקודת הענף לקצה הלא-מצמצם של שרשרת גלוקוז סמוכה α1,4 המקושרת. שאריות הגלוקוז הבודדות המקושרות α1,6 שנותרו בנקודת הענף עוברות הידרוליזה על-ידי פעילות α1,6-גלוקוזידאז19. הבדיקה מבוצעת בדרך כלל בצורה עצורה, כאשר הגלוקוז משתחרר לאחר זמן נתון (או סדרה של פעמים) נמדד במבחן אנזים מצומד כפי שמוצג להלן:
(גלוקוז) n → (גלוקוז)n-1 + גלוקוז 
גלוקוז + ATP → גלוקוז-6-פוספט + ADP
גלוקוז-6-פוספט + NADP + → 6-פוספוגלוקונולקטון + NADPH + H+
קביעת NADPH המיוצר נותן מדד לייצור גלוקוז. הנוהל המתואר בסעיף 3 לפרוטוקול, להלן, מבוסס על הליך שתואר על ידי Nelson et al.16. כמו השיטות האחרות המסתמכות על צריכה או ייצור של NADH/NADPH, הבדיקה רגישה למדי. עם זאת, נוכחות של עמילאזות או גלוקוזידאזות אחרות, שיכולות גם לשחרר גלוקוז חופשי מפוספורילאז המגבילות את הדקסטרין, תגרום להפרעות משמעותיות (ראו דיון).
הקביעה הצבעונית של פעילות אנזימי הסתעפות מסתמכת על העובדה ששרשראות α1,4 של גלוקוז מאמצות מבנים סליליים הנקשרים ליוד, ויוצרים קומפלקסים צבעוניים20. צבע הקומפלקס שנוצר תלוי באורך השרשראות המקושרות α1,4. לפיכך, עמילוז, המורכב משרשראות ארוכות, ברובן לא מסותתות, של גלוקוז α1,4 המקושר, יוצר קומפלקס כחול עמוק עם יוד. לעומת זאת, גליקוגנים, שהשרשראות החיצוניות שלהם הן בדרך כלל בסדר גודל של 6 עד 8 שאריות גלוקוז בלבד, יוצרים קומפלקסים כתומים-אדומים. אם תמיסה של עמילוז מודגרת באנזים מסתעף, הכנסת הענפים לתוך העמילוז גורמת ליצירת שרשראות סוכר קצרות יותר α1,4 המקושרות זו לזו. לפיכך, מקסימום הספיגה של קומפלקסי העמילוז/יוד נע לעבר אורכי גל קצרים יותר. ההליך הנדון כאן נגזר מזה שפורט על ידי Boyer & Preiss21 ופעילות האנזים המסתעף מכמתת כהפחתה בספיגת קומפלקס העמילוז/יוד ב-660 ננומטר לאורך זמן.
כפי שניתן לראות בקלות מהדיון לעיל, העובדה שצבעי הקומפלקסים הנוצרים בין שרשראות יוד ו-α1,4-גלוקוז משתנים עם אורך השרשרת פירושה שספקטרום הספיגה של קומפלקסים של גליקוגן/יוד צריך להשתנות עם מידת הסתעפות הגליקוגן. זה אכן המקרה, וגליקוגנים/גליקוגנים פחות מסועפים עם שרשראות חיצוניות ארוכות יותר בולעים אור באורך גל ארוך יותר מאשר גליקוגנים מסועפים יותר / בעלי שרשראות חיצוניות קצרות יותר. לפיכך, ניתן להשתמש בתגובת צביעת היוד כדי לקבל נתונים מהירים ואיכותיים על מידת הסתעפות הגליקוגן22. הצבע הכתום-חום נוצר כאשר קומפלקסים גליקוגן עם יוד אינו אינטנסיבי במיוחד. עם זאת, ניתן לשפר את התפתחות הצבע על ידי הכללת תמיסת קלציום כלוריד רוויה22. זה מגביר את הרגישות של השיטה פי 10 ומאפשר ניתוח מוכן של כמויות מיקרוגרם של גליקוגן. הבדיקה לקביעת ההסתעפות המתוארת בסעיף 4 לפרוטוקול, להלן, מותאמת מתוך נוהל שפותח על ידי קריסמן22. הוא מתבצע פשוט על ידי שילוב דגימת הגליקוגן עם תמיסת יוד וסידן כלורי בקובט ואיסוף ספקטרום הספיגה מ 330 ננומטר ל 800 ננומטר. מקסימום הספיגה משתנה לכיוון אורכי גל ארוכים יותר ככל שמידת ההסתעפות יורדת.
באופן קולקטיבי, השיטות המתוארות כאן מספקות אמצעים פשוטים ואמינים להערכת פעילותם של האנזימים המרכזיים של חילוף החומרים של גליקוגן, ולהשגת נתונים איכותיים על היקף הסתעפות הגליקוגן.

<table><tbody><tr><td>עמילופקטין (ללא עמילוז) מתירס שעווה,</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A0456</td><td></td></tr>, <tr><td>עמילוז</td><td>ביוסינת', קרבוסינת</td><td>YA10257</td><td></td></tr><tr><td>ATP, מלח דיסודיום</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3377</td><td></td></tr>, <tr><td>D-גלוקוז-1,6-ביספוספט, מלח אשלגן,</td><td>MilliporeSigma</td><td>G6893</td><td></td></tr>, <tr><td>D-גלוקוז-6-פוספט, מלח נתרן</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז, דרגה I, משמרים</td><td>MilliporeSigma</td><td>10127655001</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen, סוג II מצדפה</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8751</td><td></td></tr><tr><td>Hexokinase</td><td>MilliporeSigma</td><td>11426362001</td><td></td></tr><tr><td>Methacrylate cuvettes, 1.5 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-128</td><td>Methacrylate נדרש מכיוון שחלק מההליכים הם נערך ב-340 ננומטר ומטה</td></tr><tr><td>&בטא;-ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד פוספט מלח נתרן</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0505</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד, מלח דיסודיום מופחת</td><td>MilliporeSigma</td><td>43420</td><td></td></tr><tr><td>נוקלאוזיד 5'-דיפוספט קינאז</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0379</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoenolpyruvate, מלח</td> <td>מונופוטסיוםMilliporeSigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>פוספוגלוקומוטאז משריר הארנב</td><td>MilliporeSigma</td><td>P3397</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorylase A משריר הארנב</td><td>MilliporeSigma</td><td>P1261</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase אנזימים משריר הארנב</td><td>MilliporeSigma</td><td>P0294</td><td></td></tr><tr><td>UDP-glucose, מלח דיסודיום</td><td>MilliporeSigma</td><td>U4625</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטות ספקטרופוטומטריות לחקר מטבוליזם גליקוגן אאוקריוטי

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

גליקוגן מסונתז כצורת אחסון של גלוקוז על ידי מגוון רחב של אורגניזמים, החל מחיידקים וכלה בבעלי חיים. המולקולה מורכבת משרשראות ליניאריות של שאריות גלוקוז מקושרות α1,4 עם ענפים המוחדרים באמצעות תוספת של α1,6-linkages. הבנת האופן שבו סינתזה ופירוק של גליקוגן מוסדרים וכיצד גליקוגן משיג את המבנה המסועף האופייני שלו דורשת מחקר של האנזימים של אחסון גליקוגן. עם זאת, השיטות הנפוצות ביותר לחקר פעילויות אנזימים אלה משתמשות בדרך כלל בריאגנטים או בטכניקות שאינן זמינות לכל החוקרים. במאמר זה נדון בסוללה של הליכים שהם פשוטים מבחינה טכנית, חסכוניים ועדיין מסוגלים לספק תובנות חשובות לגבי השליטה באחסון גליקוגן. הטכניקות דורשות גישה לספקטרופוטומטר, הפועל בטווח של 330 עד 800 ננומטר, ומתוארות בהנחה שהמשתמשים ישתמשו בחלוקי פלסטיק חד פעמיים. עם זאת, ההליכים ניתנים להרחבה בקלות וניתן לשנות אותם לשימוש בקורא microplate, מה שמאפשר ניתוח מקביל מאוד.

קביעת פעילות גליקוגן סינתאז איור 1 מראה תוצאות מייצגות של מבחני גליקוגן סינתאז באמצעות אנזימים מטוהרים. בלוח A, לאחר השהיה קלה, חלה ירידה ליניארית בספיגה של 340 ננומטר לאורך זמן לתקופה של כ-12 דקות. קצב השינוי בספיגה באיור 1A היה ~0.12 יחידות ספיגה לדקה. קצב השינוי בספיגה בין ~0.010 ל-~0.20 יחידות ספיגה לדקה הוא אופטימלי ויש להתאים את כמות הגליקוגן סינתאז שנוסף לשיעורי התשואה בטווח זה. בלוח B מוצגת התוצאה של הוספת כמות גדולה מדי של גליקוגן סי...

טכניקות למדידת הפעילות של אנזימי מפתח של מטבוליזם גליקוגן מוצגות, באמצעות ספקטרופוטומטר פשוט הפועל בטווח הנראה לעין.

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

הפרוטוקולים משמעותיים, משום שהם נמנעים משימוש באיזוטופים רדיואקטיביים ומסירים מחסום שעלול למנוע מעובדים רבים לחקור אנזימים של מטבוליזם של גליקוגן. ההליכים המתוארים אינם יקרים, ודורשים גישה בלבד לספקטרופוטומטר פשוט. כדי להתחיל עם קביעת פעילות גליקוגן סינתאז, להפשיר את פתרונות המלאי שהוכנו בעבר של גלוקוז UDP, ATP, phosphoenolpyruvate ו- NDP קינאז על קרח.מחממים מראש אמבט מים ל-30 מעלות צלזיוס. כאשר פתרונות המלאי מוכנים, הכינו תערובת בדיקה מספקת בהתאם למספר מבחני הגליקוגן סינתאז על ידי הוספת הריאגנטים לצינור של 15 מיליליטר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכינו תגובה ריקה על ידי החלפת ה-NADH מתערובת התגובה במים, והעבירו את התגובה לקובט מתקרילט חד פעמי.השתמש בתגובה הריקה כדי להגדיר אפס על הספקטרופוטומטר באורך גל של 340 ננומטר. קח אחד 770 microliters aliquot של תערובת התגובה בצינור 1.5 מיליליטר, ולהוסיף ברצף שני microliters כל אחד של NDP קינאז ו pyruvate קינאז לקטט דהידרוגנאז תערובת לצינור. לאחר הערבוב, דגירה עדינה של הצינור ב 30 מעלות צלזיוס באמבט המים במשך שלוש דקות כדי לחמם את תערובת התגובה.לאחר מכן הוסיפו 30 מיקרוליטרים של הדגימה המכילה גליקוגן סינתאז בחיץ Tris של 20 מילימולר ב-pH 7.8, וערבבו בעדינות לפני העברת תערובת התגובה ל-methacrylate cuvette לסילוק. הכניסו את הקובט לספקטרופוטומטר, ותעד

spectrophotometric-methods-for-study-eukaryotic-glycogen

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מתאר בדיקה ספקטרופוטומטרית להערכת פעילות גליקוגן סינתאז. השיטה מסתמכת על ירידה בספיגת NADH עם הזמן ומצביעה על פעילות גליקוגן סינתאז.

בדיקה ספקטרופוטומטרית לקביעת פעילות גליקוגן סינתאז

בסרטון זה אנו מתארים בדיקה ספקטרופוטומטרית איכותית כדי לקבוע את מידת ההסתעפות בדגימת גליקוגן בעלת מבנה לא מאופיין. השוואת מקסימום הספיגה של המדגם הלא מאופיין לזה של פוליסכרידים עם מבנים מסועפים ידועים מצביעה על נוכחות של הסתעפות במדגם הלא מאופיין.

בדיקת הסתעפות גליקוגן למדידת מידת הסתעפות הגליקוגן

אנו מתארים כאן שיטה ביוכימית מדויקת, לשחזור ונוחה לטיטרציה של גליקוגן במבחנה. טכניקה זו משתמשת בערכת assay Abcam גליקוגן והוא מבוסס על הידרוליזה רצופה של הגליקוגן לגלוקוז וגלוקוז טיטרציה על ידי הקרינה.

כותרות ביוכימית של גליקוגן<em&gt; במבחנה</em

צביעת חומצה שיף תקופתית היא טכניקה המדמה את תכולת הפוליסכריד של רקמות. מאמר זה מדגים פרוטוקול צביעת חומצה שיף תקופתי המותאם לשימוש בתאים חד-גרעיניים בדם היקפי מטוהרים מדם ורידי אנושי. דגימות כאלה מועשרות עבור לימפוציטים ותאי דם לבנים אחרים של מערכת החיסון.

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

כאן, אנו מציגים assay אמין וקל למדידת תוכן הגליקוגן בתאי cyanobacterial. ההליך כרוך משקעים, דה פולימריזציה לבחירה, ואיתור של שאריות גלוקוז. שיטה זו מתאימה הן wildtype והן זנים מהונדסים גנטית והוא יכול להקל על ההנדסה המטבולית של cyanobacteria.

קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

ריכוז סוכרוז אופטימלי נקבע למיצוי גליקוגן בכבד באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז. תוספת של שלב רתיחה של 10 דקות לעיכוב אנזימים מפרקים גליקוגן הוכחה כמועילה.

מיצוי מולקולות גליקוגן בכבד לקביעת מבנה הגליקוגן

הליך שלאחר קיבוע שונה מגביר את הניגודיות של חלקיקי גליקוגן ברקמה. מאמר זה מספק פרוטוקול שלב אחר שלב המתאר כיצד לטפל ברקמה, לבצע את ההדמיה ולהשתמש בשיטות סטרולוגיות כדי להשיג נתונים משוחדים וכמותיים על התפלגות גליקוגן תת-תאי ספציפית לסוג סיבים בשריר השלד.

כימות של התפלגות גליקוגן תת-תאית בסיבי שריר השלד באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

בדיקת רקמת בעלי החיים משתמשת בזיהוי נצנוץ גרעיני כדי לקבוע את הפעילות האנזימטית של גליקוגן סינתאז על ידי מדידת השילוב של גלוקוז מסומן רדיו בגליקוגן.

הערכה רדיוכימית של פעילות אנזים גליקוגן סינתאז ברקמות בעלי חיים

אנו מתארים כאן שיטה חדשנית, חזקה ויעילה לטיהור זיקה טנדם (TAP) לביטוי, בידוד ואפיון של קומפלקסים של חלבונים מתאים אוקריוטיים. פרוטוקול זה יכול לשמש לאפיון ביוכימי של קומפלקסים בדידים כמו גם לזיהוי אינטראקטורים חדשים ושינויים לאחר תרגום המווסתים את תפקודם.

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

נתאר החילוץ בקנה מידה קטן שונה ואת מבחני ערכי צבע מוחלטים של ו לקטט פירובט ב תולעים נימיות C. elegans. כאשר ניצול מסחרי assay ערכות, פיתוח טכני של הרגישות והדיוק שלהם חשובה. חלבון משקעים החילוץ הוא השלב הקריטי ביותר של הקביעה כמותית של מטבוליטים תאיים.

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

למד שיטות ספקטרופוטומטריות לחקר מטבוליזם גליקוגן אאוקריוטי ללא שימוש בייזוטופים רדיואקטיביים. השיטות מאפשרות למדוד פעילות אנזימים בבטיחות ובעלות נמוכה.

שיטות ספקטרופוטומטריות לחקר מטבוליזם גליקוגן אאוקריוטי

גלה סרטונים נוספים