שיטות ספקטרופוטומטריות לחקר מטבוליזם גליקוגן אאוקריוטי

הפרוטוקולים משמעותיים, משום שהם נמנעים משימוש באיזוטופים רדיואקטיביים ומסירים מחסום שעלול למנוע מעובדים רבים לחקור אנזימים של מטבוליזם של גליקוגן. ההליכים המתוארים אינם יקרים, ודורשים גישה בלבד לספקטרופוטומטר פשוט. כדי להתחיל עם קביעת פעילות גליקוגן סינתאז, להפשיר את פתרונות המלאי שהוכנו בעבר של גלוקוז UDP, ATP, phosphoenolpyruvate ו- NDP קינאז על קרח.

מחממים מראש אמבט מים ל-30 מעלות צלזיוס. כאשר פתרונות המלאי מוכנים, הכינו תערובת בדיקה מספקת בהתאם למספר מבחני הגליקוגן סינתאז על ידי הוספת הריאגנטים לצינור של 15 מיליליטר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכינו תגובה ריקה על ידי החלפת ה-NADH מתערובת התגובה במים, והעבירו את התגובה לקובט מתקרילט חד פעמי.

השתמש בתגובה הריקה כדי להגדיר אפס על הספקטרופוטומטר באורך גל של 340 ננומטר. קח אחד 770 microliters aliquot של תערובת התגובה בצינור 1.5 מיליליטר, ולהוסיף ברצף שני microliters כל אחד של NDP קינאז ו pyruvate קינאז לקטט דהידרוגנאז תערובת לצינור. לאחר הערבוב, דגירה עדינה של הצינור ב 30 מעלות צלזיוס באמבט המים במשך שלוש דקות כדי לחמם את תערובת התגובה.

לאחר מכן הוסיפו 30 מיקרוליטרים של הדגימה המכילה גליקוגן סינתאז בחיץ Tris של 20 מילימולר ב-pH 7.8, וערבבו בעדינות לפני העברת תערובת התגובה ל-methacrylate cuvette לסילוק. הכניסו את הקובט לספקטרופוטומטר, ותעדו את הספיגה ב-340 ננומטר במרווחים מתוזמנים למשך 10 עד 20 דקות. לאחר מכן, התווה את הספיגה שהושגה כנגד הזמן.

כדי למדוד את הגלוקוז המשתחרר, העבירו 40 מיקרוליטרים של הסופר-נטנט מדגימות הגליקוגן המחוממות לקוביות המתקרילט החד-פעמיות. והוסף את הכמויות הנמדדות של טריאתנולמין, מאגר מגנזיום סולפט הידרוכלוריד, תערובת NADP ATP ומים כמתואר בכתב היד. מערבבים את התערובת על ידי ניפוח מעלה ומטה בעדינות מבלי ליצור בועות אוויר.

הוסיפו 0.5 מיקרוליטרים של גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז לכל קובט. לאחר ערבוב על ידי pipetting, לדגור את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ולאחר מכן להקליט את הספיגה ב 340 ננומטר. לאחר מכן, ערבבו 0.5 מיקרוליטרים של הקסוקינאז לכל קובט כפי שתואר קודם לכן, ודגרו במשך 15 דקות לפני רישום ערכת הספיגה של 340 ננומטר.

לאחר מכן המשיכו את הדגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, ולאחר מכן רשמו את הספיגה. אם הספיגה עלתה מזו שתועדה ב-15 דקות, המשיכו את הדגירה במשך חמש דקות לפני רישום הספיגה הסופית ב-340 ננומטר. כדי לקבוע את הסתעפות הגליקוגן, שלבו 650 מיקרוליטרים של מלאי מגיבי צבע סידן כלוריד עם 100 מיקרוליטר מים בצינור של 1.5 מיליליטר, וערבבו היטב את התמיסה לפני המעבר לקובט מתקרילט חד פעמי.

מקם את הקובט בספקטרופוטומטר כדי לבצע ריצה במצב סריקת אורך גל לאיסוף ספקטרום הרקע מ-330 עד 800 ננומטר. בצינור נפרד של 1.5 מיליליטר לשלב 650 מיקרוליטר של ריאגנט צבע סידן כלורי יוד עובד עם 50 מיקרוגרם של גליקוגן צדפות, ולהרכיב את הנפח הסופי ל 750 מיקרוליטר עם מים. לאחר ערבוב יסודי של התערובת, העבירו את התמיסה לקובט מתקרילט חד פעמי כדי לאסוף ספקטרום ספיגה של 330 עד 800 ננומטר.

באופן דומה, קבל ספקטרום ספיגה עם 50 מיקרוגרם של עמילופקטין ו -30 מיקרוגרם של עמילוז כפי שתואר קודם. כדי לקבל אינדיקציה למבנה המסועף של דגימת גליקוגן לא מאופיינת, שלב 25 עד 50 מיקרוגרם של הגליקוגן עם 650 מיקרוליטר של מגיב צבע היוד העובד קלציום כלוריד, והמשך כפי שהוסבר קודם לכן כדי לרכוש את ספקטרום הספיגה. במבחני גליקוגן סינתאז נצפתה ירידה ליניארית בספיגה של 340 ננומטר לאורך זמן.

הוספת כמות גדולה מדי של גליקוגן סינתאז לבדיקה גרמה לתגובה להגיע להשלמה תוך שתי הדקות הראשונות. תגובת הבקרה, שלא הכילה גליקוגן סינתאז, לא הראתה ירידה ניתנת למדידה בספיגה. הנתונים מבדיקת גליקוגן פוספורילאז באמצעות אנזים מטוהר היו בעלי פאזה ליניארית שנמשכה שלוש דקות.

קצב עלייה בספיגה של כ-0.01 עד 0.04 יחידות לדקה הוא אופטימלי. בבדיקת האנזים גליקוגן דה-הסתעפות, התגובה הראתה פאזה ליניארית שנמשכה לפחות 10 דקות. הנתונים המייצגים ממבחני אנזים הסתעפות הגליקוגן הראו את ההבדל בספיגה בין דגימות הביקורת שלא היו אנזים מסתעף, לבין התגובות שהכילו אנזים מסתעף.

הטווח הדינמי הצר של הבדיקה מומחש. השינוי המרבי בספיגה שניתן לייצר הוא 0.4 יחידות ספיגה, והלינאריות אובדת כאשר השינוי בספיגה הוא כ-0.2 יחידות ספיגה. המסות של גליקוגן, עמילופקטין ועמילוז ששימשו בהערכת הסתעפות הגליקוגן הציגו קריאת ספיגה מרבית של כ-0.7 עד 0.8, כל אחד במקסימום ספיגה שונה.

דגימת הגליקוגן הניבה שתי פסגות של כ-400 ננומטר ו-460 ננומטר. מגיב צבע הסידן כלורי של היוד צפוף מאוד. חשוב לוודא שדגימות הגליקוגן מעורבבות באופן מלא עם המגיב לפני איסוף ספקטרום הספיגה.