ממשקי הידרוג'ל הניתנים לצילום להקרנת חיידקים, בחירה ובידוד
November 4th, 2021
השימוש הידרוג'לים פוטו-הדרגתיים כדי לבודד תאים חיידקיים על ידי שימוש בכלי טפיחה אור ברזולוציה גבוהה מדווח. נהלים ניסיוניים חיוניים, תוצאות ויתרונות של התהליך נבדקים. השיטה מאפשרת בידוד מהיר וזול של חיידקים ממוקדים המציגים פונקציות נדירות או ייחודיות מקהילות או אוכלוסיות הטרוגניות.
פרוטוקול זה נועד לבודד במהירות תאים מממשקי סינון עבור אפיון גנומי ויכולת זו היא משמעותית מכיוון שהיא יכולה לשלב תכונות תאים הניתנות לצפייה מקרוסקופית עם מידע גנומי. ניתן לבודד את תאי החיידקים הממוקדים מממשקי ההקרנה עם מיקום מרחבי גבוה באופן פשוט מבחינה תפעולית באמצעות טכניקה זו. הידרוג'ל יכול להיות מיושם בממשקי הקרנה אחרים.
חומר הידרוג'ל יכול להיות משולב בקלות לתוך ערוצים microfluidic לאחזור לפי דרישה של תאים ממכשירים microfluidic. התחל על-ידי חנק המאגר המקשר באמצעות צפיפות התא הרצויה. הכן את פתרון המבשר הידרוג'ל בצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 מיליליטר על ידי הוספת 12.5 מיקרוליטרים של המאגר המקשר ו-5.6 מיקרוליטרים של פתרון ניקוד PEG ONB.
ולבסוף, להוסיף 6.9 microliters של תמיסת PEG תיול זרוע האמה לתערובת. לתמצית תאים בתמיסת המבשר ההידרוג'ל, הניחו את כיסויי הבסיס התיאולה על צלחת פטרי נקייה והצבנו שני מרווחים משני הצדדים המנוגדים של כיסוי הכיסוי. תקן את המרווחים על מכסה הבסיס על ידי הדבקת המרווחים לצלחת פטרי.
לאחר הוספת הנפח הרצוי של פתרון מבשר על שקופית זכוכית perfluoroalkated לא תגובתי, מניחים את השקופית על כיסוי הבסיס ומאפשרים להיווצרות הידרוג'ל להשלים בטמפרטורת החדר במשך 25 דקות. לאחר השלמת הג'ל, הסר בעדינות את שקופית הזכוכית perfluoroalkated. מניחים את המצע בצלחת פטרי 60 על 15 מ"מ המכילה מדיה ATGN בתוספת אנטיביוטיקה.
זרע 700 מיקרוליטרים של השעיות תאים חיידקיים עם OD 600 של 0.1 מעל מצע מערך microwell ולהפוך את פתרון הקדמה הידרוג'ל כפי שהודגם בעבר באמצעות 12.5 microliters של פוספט חוצץ ATGN של pH שמונה. Pipette 12.5 מיקרוליטרים של פתרון מבשר על שקופית זכוכית perfluoroalkated ללא תגובתי ומניחים שני מרווחי פלדה 38 מיקרומטר על שני צדדים מנוגדים של מערך microwell מצע innoculated עם תאים. לאחר מכן הפוך את שקופית הזכוכית perfluoroalkated עם טיפת פתרון מבשר ולהניח טיפה באמצע המצע microwell.
כאשר הידרוג'ל נוצר לאחר דגירה של 25 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר בעדינות את שקופית הזכוכית מן המצע microwell ומניחים את המצע בצלחת פטרי המכילה מדיה ATGN בתוספת אנטיביוטיקה. מקם את הדגימה במחזיק PDMS והוסף את המדיה המוגדרת מעל המדגם כדי למנוע התייבשות מדגם ולספק פתרון מוביל לתאים שפורסמו. לאחר הבאת מראה הכיול למיקום, להתאים את מיקוד המיקרוסקופ כדי לקבל תמונה חדה של המושבות בתוך מערך הידרוג'ל או microwell ולבדוק כדי לזהות מושבות או בארות עניין.
כאן, עצב את דפוסי האור בזמן שתצוגת המצלמה מציגה את המושבות בתוך המדגם כדי לבדוק דפוסים שונים להפקת תאים ולשמור את התבנית המוגדרת. לאחר מכן בחר את מקטע בקרת ההפעלה, הוסף את הרצף השמור תחת הכרטיסיה שכותרתה בשם המוצר של כלי התאורה בדוגמת המילוי. בחר באפשרות לגרות את התבנית כדי להציג ולהתאים את מיקום החשיפה הרצוי.
לאחר מכן, התאם את עוצמת האור ל- 60% ואת זמן החשיפה ל- 40 שניות תחת הכרטיסיה בקרת LED והתחל את תהליך החשיפה. נטר את השפלת ההידרוג'ל בזמן אמת ומצב ברייטפילד כדי להבטיח את שחרור התא. כדי לאסוף את התא ששוחרר, שנה את מסנן המיקרוסקופ מברייטפילד ל- TRITC כדי לדמיין את האזור החשוף של המדגם בעין בלתי.
לאחר שהאזור החשוף ממוקם, הנח את קצה הצינורות על הנקודה המוקרנת, ולאחר מכן שנה את מסנן המיקרוסקופ בחזרה לברייטפילד כדי לפקח על אחזור התא בזמן אמת. השתמש במזרק המחובר לקצה השני של הצינורות כדי למשוך בזהירות 200 מיקרוליטרים של פתרון המכיל את התאים המשוחררים ולהעביר את הפתרון לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"מ לניתוח DNA או ציפוי. דפוסי מיקרו אור UV שונים שימשו להפקת תאים הידרוג'ל בתפזורת, אשר השפיעו על המורפולוגיה של התאים ששוחררו.
החשיפה לקרינת UV בתבנית טבעת הביאה לשחרור המושבה כולה עטופה בהידרוג'ל PEG מגן. לעומת זאת, על ידי חשיפת חלק או כל המושבה לאור UV, תאים יכולים להיות מופקים או כצביר תאים מצטברים או כתאים בודדים חופשיים. צפיפות זריעת התא ועובי ההידרוג'ל חשובים לתמצית תאים.
ההידרוגלים הדקים יותר גרמו למושבות מיקרו עם חפיפה מינימלית של המושבה, בעוד ההידרוג'לים בעובי מוגבר גרמו למושבות חופפות, מה שעלול לגרום להפקת מושבות מרובות. מושבות חופפות יכולות לגרום לזיהום צולב במהלך החילוץ בשל האופי הדו מימדי של תבנית האור. כאשר מושבה עליונה סומנה כמטרה, המושבה הבסיסית חולצה גם איתה.
ההשפעה של דפוסי מיקרו אור UV מגוונים על הכדאיות התא הוערך גם. כאשר מושבות מיקרו נחשפו למינונים מבוקרים של אור UV בתבנית מעגלית או צולבת, התאוששות התאים וטוהר ה- DNA לא הושפעו. התאים אוחזרו בהצלחה מערכי מיקרווול באמצעות גישה זו, אשר ניכרה מתמונות המיקרוסקופיה הקונפוקלית הייצוגית, שם לאחר ההקרנה בתבנית המעגלית והטבעת, התאים הוסרו בתבנית המתאימה.
לאחר החילוץ מערכי microwell, הכדאיות התא וכמות ה- DNA הוערכו. דפוסי החשיפה לא השפיעו על ספירת התאים בת קיימא ולא על איכות הדנ"א, מה שמצביע על כך שניתן לאחזר באופן סלקטיבי תאי חיידקים בני קיימא ממיקרווולים עם נזק מינימלי, והדנ"א שלהם יכול להיות מבודד בטוהר גבוה לניתוח גנומי במורד הזרם. תמיד לבדוק כי הידרוג'ל נוצר לפני הסרת כיסוי perfluoroalkated.
דיוק וטיפול נדרשים להצבת המרווחים לתצהיר הידרוג'ל ושימוש בצינורות להפקת תאים.
סקירה
מאמר זה דן בפרוטוקול לבידוד תאים חיידקיים באמצעות הידרוג'לים פוטו-מפורקים ודפוסי אור ברזולוציה גבוהה. השיטה מאפשרת מיצוי מהיר וחסכוני של חיידקים ספציפיים מקהילות מורכבות, ומקלה על ניתוח גנומי.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- ביולוגיה של תאים
- גנומיקה
רקע
- בידוד של תאים חיידקיים ספציפיים חיוני לאופיון גנומי.
- הידרוג'לים פוטו-מפורקים מספקים גישה חדשנית לכליאה ושחרור תאים.
- השיטה משלבת תכונות תא נצפות עם נתונים גנומיים.
- ניתן לשלב הידרוג'לים בממשקי סינון שונות.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לבידוד מהיר של תאים חיידקיים ממוקדים.
- להעריך את האפקטיביות של דפוסי אור במיצוי תאים.
- להעריך את ההשפעה של עובי ההידרוג'ל על חיוניות התאים ויעילות המיצוי.
שיטות בשימוש
- הכנת פתרונות מקדימים של הידרוג'ל לכליאת תאים.
- שימוש בכלי דפוסי אור לפירוק ההידרוג'לים ושחרור תאים.
- מעקב אחר מיצוי תאים באמצעות מיקרוסקופיה.
- הערכת חיוניות התאים ואיכות ה-DNA לאחר המיצוי.
תוצאות עיקריות
- התאים בוודלו בהצלחה ממערכי מיקרו-בארות עם נזק מינימלי.
- דפוסי אור UV שונים השפיעו על המורפולוגיה של התאים המשוחררים.
- עובי ההידרוג'ל השפיע על חפיפת המושבות ותוצאות המיצוי.
- חיוניות התאים וטוהר ה-DNA נשמרו במהלך תהליך המיצוי.
מסקנות
- השיטה מאפשרת שחרור סלקטיבי של תאים חיידקיים ברי חיים.
- ניתן להשתמש בהידרוג'לים באופן יעיל במחקרים גנומיים של חיידקים.
- גישה זו משפרת את יעילות בידוד התאים ליישומים נוספים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-resolution photodegradable hydrogel interfaces enable precise screening and isolation of bacterial phenotypes, directly linking observable traits to downstream genomic analysis. This capability addresses a critical bottleneck in early discovery by allowing rapid, high-purity retrieval of rare or emergent bacterial strains from heterogeneous populations. The approach supports portfolio-wide efforts to de-risk target selection and accelerate functional validation in microbiology-driven R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct correlation of phenotypic screening with genotypic analysis for functional target validation.
- Supports biological de-risking by isolating rare or emergent bacterial phenotypes from complex libraries.
- Facilitates predictive confidence in target selection by ensuring high-purity retrieval of candidate strains.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream workflows through precise, contamination-minimized isolation.
- Standardizes assay outputs by enabling reproducible, spatially controlled cell retrieval.
- Enhances screening readiness and scalability for mutant libraries and consortia studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling genomic characterization of phenotypically distinct isolates.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving cell viability and DNA integrity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing high-quality isolates for further functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
This photodegradable hydrogel method integrates at the interface of phenotypic screening and genomic analysis, bridging early discovery and preclinical research stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling isolation of functionally relevant bacterial strains.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs through controlled cell encapsulation and release.
- Analytics: Provides high-purity samples for comparative genomic and phenotypic analyses.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by linking phenotype to genotype in isolated strains.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for diverse microbiology screening and isolation needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling high-fidelity downstream analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of microbial targets and consortia.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel chemistry, microscopy, and light patterning instrumentation.
- Needs access to high-resolution light patterning tools and compatible microfluidic or microwell platforms.
- Demands cross-team standardization for hydrogel preparation and cell retrieval protocols.
- Adaptable to various bacterial models but sensitive to hydrogel thickness and colony overlap.
- Careful handling is essential to prevent cross-contamination and ensure high-purity isolation.
