Name: הזרקה נגיפית סטריאוטקסית והשתלת עדשה בעלת אינדקס שיפוע להדמיית סידן עמוקה במוח In Vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: למד הדמיית סידן עמוקה במוח in vivo באמצעות מיניסקופ ועדשת GRIN בעכברים חופשיים. פרוטוקול זה מאפשר מעקב אחר פעילות מאות נוירונים במעגלים עצביים חיים לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 ו- UG3NS115608.

<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li>
<li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li>
<li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+corticospinal+output+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reorganization of corticospinal output during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).</li>
<li>Barbera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+compact+neural+clusters+in+the+dorsal+striatum+encode+locomotion+relevant+information%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information.</a> Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NINscope%2C+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987(2020).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li>
<li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li>
<li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li>
<li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient-index+optics%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173(2019).</li>
<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li>
<li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases%3A+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174(2019).</li>
<li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre%2FloxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li>
<li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-loxP-mediated+recombination%3A+General+principles+and+experimental+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li>
</ol>

המחברים אינם מדווחים על אינטרסים כלכליים מתחרים.

שאלה מרכזית במדעי המוח היא הבנת האופן שבו דינמיקה ומעגלים עצביים מקודדים ומאחסנים מידע, וכיצד הם משתנים במחלות מוח. באמצעות מיניסקופ in vivo Ca2+ הדמיה, ניתן לנטר בו זמנית פעילות עצבית בודדת מכמה מאות נוירונים בתוך מיקרו-מעגל מקומי מבעל חיים שמתנהג באופן חופשי. כאן, פרוטוקול ניתוח מפורט להזרקה ויראלית והשתלת עדשת GRIN מתואר כדי להכין מכרסמים להדמיית מוח עמוק in vivo Ca2+ באמצעות מערכת הקלטה של מיניסקופ שפותחה בהתאמה אישית. טבלה 1 מציגה את ההשוואות של מערכת המיניסקופ שלנו עם מערכות מיניסקופ אחרות הזמינות מסחרית ובהתאמה אישית 7,8,9,10,11,13,25,26. ראוי לציין כי השתלת עדשת GRIN באמצעות הפרוטוקול הכירורגי הנוכחי תואמת לכל מערכת הדמיה מסחרית או מותאמת אישית של פוטון יחיד ושני פוטונים עבור הדמיית סידן in vivo במוח עמוק.
מהזרקה ויראלית ועד רכישת נתונים של הדמיית סידן in vivo של מיניסקופ, כל הליך הניסוי לוקח לפחות חודשיים להשלים. זהו תהליך מסובך ועתיר עבודה. ההצלחה הסופית של הניסוי תלויה במספר גורמים, כולל בחירה נכונה של GECIs, הזרקת וירוס במדויק באזור המוח הממוקד, ביטוי ויראלי מספיק באוכלוסייה העצבית הרצויה, השתלת עדשת GRIN בדיוק במיקום הרצוי, התאוששות נאותה מניתוחים, כמו גם, האם דלקת חמורה מתרחשת לאחר הניתוח, והאם התנהגות בעלי החיים מושפעת קשות מניתוחים, וכן הלאה.
שני שלבים קריטיים כוללים הזרקה סטריאוטקסית של וירוס והשתלת עדשת GRIN. לצורך ההדגמה, המיקרו-איניג'קציה הסטריאוטקסית בוצעה ב-mPFC של העכבר, כאשר נגיף הקשור לאדנו (AAV1) מקודד את GCaMP6f בשליטת מקדם CaMKII שמתייג באופן סלקטיבי נוירונים פירמידליים ב-mPFC. GCaMP6f נבחר מכיוון שהוא אחד ממדדי הסידן המהירים והרגישים ביותר עם זמן של חצי ריקבון של 71 אלפיות השנייה15. בנוסף, הביטוי הנגיפי AAV של GCaMP6f הוא ארוך טווח (כלומר, מספר חודשים), מה שהופך אותו לאידיאלי לביצוע הדמיה חוזרת ונשנית in vivo Ca2+ לאורך תקופה ארוכה עבור מחקרי אורך במודלים של עכברים של מחלות נוירודגנרטיביות27. פרוטוקול הניתוח הנוכחי יכול להיות מותאם למיקוד אוכלוסיות תאים שונות בכל אזור מוח אחר. כלים ויראליים שונים זמינים מאפשרים תיוג סלקטיבי של אוכלוסיות עצביות ספציפיות באזור המוח הרצוי בגיל הרצוי. בנוסף, חוקרים יכולים לנצל את מערכת הרקומבינציה Cre-LoxP ואת מודלי העכברים המהונדסים הזמינים השונים כדי לבצע שינויים גנטיים ולחקור את תוצאות המעגלים ההתנהגותיים והעצביים28,29.
מאפיין ייחודי אחד של הפרוטוקול המוצג הוא שהשאיפה האוטומטית של רקמת המוח שכבה אחר שכבה בוצעה לפני השתלת עדשת GRIN (בקוטר 1 מ"מ). זה מושג באמצעות מחט 27 גרם המחוברת למערכת ואקום, הנשלטת על ידי זרוע רובוטית שנבנתה בהתאמה אישית ותוכנה23. בהתבסס על הניסיון שלנו, שיטה זו יוצרת משטח אחיד לעדשת GRIN למגע וגורמת פחות נזק לרקמה השכנה מאשר שאיפת רקמות ידנית23. מסיבה זו, הליך זה מביא יתרון ברור לעדשות GRIN בקוטר רחב יחסית (למשל, 1 מ"מ). עם זאת, ייתכן ששאיפת רקמות אינה נחוצה להשתלת עדשת GRIN בקוטר קטן יותר (0.5 מ"מ או 0.25 מ"מ). במקום זאת, ניתן לשתול אותו ישירות לאורך המסלול המוביל המיוצר עם מחט 30 G21.
מלבד שני השלבים הקריטיים שנדונו לעיל, יש לשקול בזהירות גורמים רבים אחרים לצורך ניתוח מוצלח. (1) יש לעקר את כל המכשירים שבאים במגע עם המוח כדי למנוע זיהום. (2) כל שלבי הניתוח צריכים להתבצע כדי למזער את הנזק למוח כדי למנוע דלקת נוספת ויצירת רקמת צלקת מוגזמת. (3) יש לשקול בקפידה את מינוני ההרדמה שניתנו בתחילה ונשמרו במהלך הניתוח, במיוחד אלה שניתנו באופן תוך-צפקי. מינוני ההרדמה עשויים להשתנות בהתאם לזני עכברים שונים, שכן חלקם עשויים להיות רגישים יותר. (4) מצבו של העכבר צריך להיות מנוטר כל הזמן במהלך הניתוח. לבסוף, (5) העכברים צריכים להיות במעקב קבוע לאחר הניתוח, שכן סיבוכים רבים עלולים להתרחש לאחר הניתוח.
למרות שנתח של רקמת מוח מוסר באופן חד צדדי במהלך שלב השתלת עדשת GRIN, לא ראינו ליקויי התנהגות ברורים 7,12. משקלו של המיניסקופ הוא כ-2 גרם והכבל מתוכנן בהתאמה אישית כדי להפוך אותו לקליל ולהבטיח שהעכבר יוכל לשאת אותו בקלות. המיניסקופ והכבל מחוברים לחיה רק לפני הדמיית in vivo ומנותקים לאחר ההדמיה. תהליך ההדמיה כולו אורך בדרך כלל לא יותר מ-30 דקות. לכן, מכשור זה אינו מונע מהעכבר להתנהג בחופשיות. התקנת המיניסקופ ושלבי הדה-אינסטלציה זקוקים להרדמה קצרה (פחות מ-2 דקות) עם איזופלורן לצורך ריסון בעלי חיים. בדרך כלל אנו מאפשרים לעכבר להתאושש מהחשיפה הקצרה של איזופלורן למשך 30 דקות לפני ביצוע הדמיית in vivo. ביצענו הדמיית סידן in vivo של מיניסקופ פעם בשבוע במשך כמה שבועות מבלי לשים לב להשפעה כלשהי על בריאות העכברים ועל ההתנהגות החברתית של העכבר12.
מגבלה מרכזית אחת של מערכת ההקלטה הנוכחית של המיניסקופ היא הצורך לחבר את המיקרוסקופ לכבל לצורך רכישת נתונים. נוכחות הכבל מגבילה לעתים את ביצועי משימת העכבר ומגבילה את ההקלטה של חיה אחת בכל פעם. לאחרונה פותח מיניסקופ אלחוטי25,26. זה ירחיב את ביצועי המשימה ויאפשר הדמיית in vivo בו זמנית ממספר בעלי חיים בקבוצה. יתר על כן, פיתוח GECIs רגישים יותר עם אורכי גל הניתנים להפרדה ספקטרלית בשילוב עם מיניסקופ דו-צבעי יציעו אפשרויות מרגשות יותר למחקר במדעי המוח.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.
The following paragraph was added to the end of the Discussion:
Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.

Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

איתות Ca2+ תוך-תאי הוא מווסת חיוני של גדילת תאים, התפשטות, התמיינות, הגירה, שעתוק גנים, הפרשה ואפופטוזיס1. בתאי עצב, איתות Ca2+ נשלט במדויק מכיוון שהתבנית המרחבית-טמפורלית שלו קשורה לתפקודים חיוניים כגון רגישות ממברנה, שחרור נוירוטרנסמיטורים ופלסטיות סינפטית2.
הדמיית סידן In vivo היא טכניקה רבת עוצמה שניתן להשתמש בה כדי לפענח ייצוג מעגלים עצביים יסודיים להתנהגויות נורמליות של בעלי חיים, לזהות פעילויות עצביות חריגות במודלים של בעלי חיים של הפרעות מוחיות, ולחשוף מטרות טיפוליות פוטנציאליות שעשויות לנרמל את המעגלים המשתנים האלה. שתי מערכות ההדמיה הנפוצות של סידן in vivo הן מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לסריקת לייזר דו-פוטונית 3,4,5,6 ומיקרואנדוסקופיה ממוזערת (מיניסקופ) המותקנת על הראש 7,8,9,10,11,12,13 . המיקרוסקופיה הקונבנציונלית של שני פוטונים מציעה יתרונות שולטים כגון רזולוציה טובה יותר, רעש נמוך יותר והלבנת תמונות נמוכה יותר; עם זאת, חיות הניסוי נדרשות להיות קבועות ראש, מה שמגביל את מחקרי ההתנהגות שניתן לבצע 3,4,5,6. לעומת זאת, מערכת המיניסקופ המותקנת על הראש היא קטנה וניידת, מה שמאפשר לחקור מגוון רחב של מבחני התנהגות באמצעות בעלי חיים המתנהגים בחופשיות 7,8,9,10,11,12,13.
ישנם שני אינדיקטורים מובילים של Ca2+, אינדיקטורים כימיים 5,14 ואינדיקטורים לסידן מקודדים גנטית (GECIs)15,16. הדמיית Ca2+ התאפשרה על ידי שימוש ב-GECIs רגישים ביותר המועברים עם וקטורים נגיפיים המאפשרים תיוג ספציפי של נוירונים במעגל הממוקד. המאמץ המתמשך לשפר את הרגישות, אריכות הימים והיכולת לתייג אפילו את התאים התת-תאיים, הופך את ה-GECIs לאידיאליים למחקרי הדמיית סידן in vivo שונים 17,18,19.
פיזור האור ברקמת המוח במהלך ההדמיה מגביל את החדירה האופטית לעומק, אפילו עם המיקרוסקופיה הדו-פוטונית. עם זאת, עדשת ה-Gradient Index (GRIN) מתגברת על בעיה זו מכיוון שעדשת ה-GRIN יכולה להיות מוטמעת ישירות ברקמות הביולוגיות ולהעביר תמונות מאזור המוח העמוק אל מטרת המיקרוסקופ. בניגוד לעדשה קונבנציונלית העשויה מחומר הומוגני אופטי ודורשת משטח בעל צורה מסובכת כדי להתמקד וליצור תמונות, ביצועי עדשת GRIN מבוססים על שינוי הדרגתי במקדם השבירה בתוך חומר העדשה שמשיג מיקוד עם משטח מישור20. ניתן לייצר עדשת GRIN עד לקוטר של 0.2 מ"מ. לכן, עדשת GRIN ממוזערת יכולה להיות מושתלת במוח העמוק מבלי לגרום נזק רב מדי.
במאמר זה, פרוטוקול ניתוח מלא מוצג עבור המוח העמוק in vivo סידן הדמיה. לצורך ההדגמה, אנו מתארים ניתוחי מוח המכוונים באופן ספציפי לקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית (mPFC) של מוח העכבר והקלטת הדמיית סידן in vivo באמצעות מערכת מיניסקופים שנבנתה בהתאמה אישית שפותחה על ידי קבוצתו של ד"ר לין במכון הלאומי לשימוש בסמים (NIDA/IRP)7,12. ההליך הניסיוני כולל שני ניתוחי מוח גדולים. הניתוח הראשון הוא הזרקה סטריאוטקסית של וקטור ויראלי המבטא GCaMP6f (GECI) ב-mPFC. הניתוח השני הוא להשתיל את עדשת ה-GRIN באותו אזור במוח. לאחר ההחלמה מניתוחי מוח אלה, ההליך הבא הוא להצמיד את מחזיק המיניסקופ (בסיס) על גולגולת העכבר באמצעות מלט דנטלי. In vivo ניתן לבצע הדמיה Ca2+ בכל עת לאחר הרכבת המיניסקופ על בסיסו. פרוטוקול הניתוח להזרקה ויראלית והשתלת עדשות GRIN תואם לכל מערכת הדמיה מסחרית או מותאמת אישית של פוטון יחיד ושני פוטונים עבור הדמיית הסידן in vivo במוח העמוק.

<table><tbody><tr><td>קוצי קידוח 0.6 מ"מ ו-1.2 מ"מ</td><td>KF טכנולוגיית</td><td>8000037800</td><td>לקרניוטומיה</td></tr><tr><td>מחט 27-G ו-30-G BD</td><td>מחט PrecisionGlide</td><td>REF 305109 ו-REF305106</td><td>לשני הניתוחים</td></tr><tr><td>45 מלקחיים זוויתיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11251-35</td><td>לניתוחים</td></tr><tr><td>7.5% תמיסת פובידון-יוד (בטדין)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-151-17</td><td>חומר חיטוי משטח</td></tr><tr><td>אצטון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>179124-1L</td><td>מנקה עדשות GRIN</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-25G</td><td>להשתלת עדשות GRIN</td></tr><tr><td>משחה אנטיביוטית</td><td>HeliDerm Technology</td><td>81073087</td><td>להזרקת וירוסים</td></tr><tr><td>תרופה אנטי דלקתית (איבופרופן)</td> <td>Johnson & Johnson Consumer Inc</td><td>30043308</td><td>פועל כמשכך כאבים לאחר ניתוחים</td></tr><tr><td>AutoStereota</td><td>NIDA/IRP</td><td>github.com/liang-bo/autostereota</td><td>להשתלת עדשות GRIN</td></tr><tr><td>תוכנת קידוד התנהגות (Point Grey FlyCap2)</td><td>Point Grey</td><td>Point Grey מחקר Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td><td>להתנהגות הקלטה</td></tr><tr><td>אגוז משושה פליז</td><td>McMASTER-CARR</td><td>92736A112</td><td>להשתלת עדשת GRIN</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Par Pharmaceuticals</td><td>NDC 4202317905</td><td>להשתלת עדשות GRIN</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>10043-52-4</td><td>להכנת aCSF</td></tr><tr><td>COMMUTATOR</td><td>NIDA/IRP</td> רכיב <td>מעוצב בהתאמה אישית</td><td>של מערכת רכישת תמונה</td></tr><tr><td>מיכל חמצן דחוס ו-Caxbondioxide Rocky</td><td>Mountain Air Solutions</td><td>BI-OX-CD5C-K</td><td>לעדשת GRIN השתלה</td></tr><tr><td>מיכל חמצן דחוס</td><td>Rocky Mountain Air Solutions</td><td>OX-M-K</td><td>להזרקת וירוסים</td></tr><tr><td>טכנולוגיית Microdrill KF אלחוטית</td><td></td><td>8000037800</td><td>לקרניוטומיה</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate</td><td>Henkel Coorporation</td><td># 1811182</td><td>להשתלת עדשת GRIN</td></tr><tr><td>בקר רכישת נתונים</td><td>NIDA/IRP</td> רכיב <td>מעוצב בהתאמה אישית</td><td>של רכישת תמונה מערכת</td></tr><tr><td>כבל העברת נתונים</td><td>NIDA/IRP</td> רכיב <td>בעיצוב מותאם אישית</td><td>של מערכת רכישת תמונה</td></tr><tr><td>סט מלט דנטלי</td><td>C& B Metabond ו-Catalyst</td><td>A00253revA306 ו-A00168revB306</td><td>להשתלת עדשות GRIN</td></tr><tr><td>סט מלט דנטלי</td><td>Duralay</td><td>2249D</td><td>להשתלת עדשת GRIN</td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>VETone</td><td>NDC 1398503702</td><td>להשתלת עדשות GRIN</td></tr><tr><td>דקסטרוז</td><td>סיגמא</td><td>50-99-7</td> להכנת <td></td></tr><tr><td>ג'ל דיאטה</td><td>aCSF Clear H20</td><td>72-06-5022</td><td>תוסף תזונה </td></tr><tr><td>לעדשת GRIN לעכבר GRINTECH</td><td></td><td>NEM-100-25-10-860-S</td><td>להשתלת עדשת GRIN</td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>Physitemp Instruments LLC.</td><td>#10023</td><td>כדי לשמור על חום גוף העכבר במהלך ניתוחים</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>VETone</td><td>V1 502017</td><td>הרדמה</td></tr><tr><td>קטמין</td><td>VETone</td><td>V1 501072</td><td>להשתלת עדשות גרין</td></tr><tr><td>לידוקאין</td><td>WEST-WARD</td><td>NDC 0143-9575-01</td><td>הרדמה מקומית</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט</td><td>סיגמא</td><td>7791-18-6</td><td>להכנת aCSF</td></tr><tr><td>מיקרוליטר מזרק (המילטון)</td> <td>המילטון</td><td>7653-01</td><td>להזרקת וירוסים</td></tr><tr><td>בקר משאבת מיקרו-מזרק</td><td>מכשיר דיוק עולמי</td><td>#178647</td><td>להזרקת וירוסים</td></tr><tr><td>מיניסקופ</td><td>NIDA/IRP</td><td>מעוצב בהתאמה אישית</td><td>להדמיה</td></tr><tr><td>בסיס מיניסקופ</td><td>Protolabs</td><td>תוכנן בהתאמה אישית</td><td>להרכבת הבסיס</td></tr><tr><td>זרוע אחיזת מיניסקופ</td><td>NIDA/IRP</td><td>תוכנן בהתאמה אישית</td><td>להרכבת מכסה ההגנה הבסיסי</td></tr><tr>של<td>Miniscope</td><td>Protolabs</td><td>תוכנן בהתאמה אישית</td><td>להגנה על המיניסקופ</td></tr><tr><td>בקר ממונע</td><td>Thorlabs</td><td>KMTS50E</td><td>להרכבת הבסיס</td></tr><tr><td>NeuView</td><td>NIDA/IRP</td><td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td><td>להדמיה in vivo</td></tr><tr><td>משחה עיניים</td><td>Puralube Vet</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>צינור PCR</td> עיניים <td>Thermo Scientific</td><td>AB-0622</td><td>להשתלת עדשת GRIN</td></tr><tr><td>מהדק</td><td>צביטה מכשיר דיוק עולמי</td><td>14040</td><td>להידוק הצינור קלטת</td></tr><tr><td>פוליטטרפלואורואתילן (PTFE) קלטת</td><td>TegaSeal PTFE קלטת</td><td>A-A-58092</td><td>לחיזוק miniScope לבסיס</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>7447-40-7</td><td>להכנת</td></tr><tr><td>זרוע רובוטית</td> aCSF <td>NIDA/IRP</td><td>מעוצבת בהתאמה אישית</td><td>להשתלת עדשות GRIN</td></tr><tr><td>מלח</td><td>Hospira</td><td>RL 7302</td><td>לשני הניתוחים</td></tr><tr><td>בורג</td><td>סט DECORAH LLC.</td><td>3BT-P9005-00-0025</td><td>להברגת אום המשושה מפליז בבסיס המינסקופ</td></tr><tr><td>&nbsp; צינורות גומי סיליקון, 0.062 אינץ' ID, 1/8 אינץ' OD</td><td>McMaster</td><td>2124T3</td><td>להשקיה של aCSF</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא</td><td>144-55-8</td><td>להכנת aCSF</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>7647-14-5</td><td>להכנת aCSF</td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא</td><td>7558-80-7</td><td>להכנת aCSF</td></tr><tr><td>שלב סטריאוטקסי</td><td>KOPF</td><td>דגם 962 כפול מדויק במיוחד בעלי חיים קטנים סטריאוטקסיים</td><td>לשני הניתוחים</td></tr><tr><td>צמר גפן סטרילי</td><td>פוריטני</td><td>REF 806-WC</td><td>לשני הניתוחים</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11251-35</td><td>לניתוחים</td></tr><tr><td>תפר</td><td>Sofsilk</td><td>REF SS683</td><td>להזרקת וירוסים</td></tr><tr><td>&nbsp; מסנן מזרק (0.22 ומיקרו; m)</td> <td>Millex</td><td>SLGVR33RS</td><td>לסינון aCSF במהלך השתלת עדשת GRIN</td></tr><tr><td>תרחיף ויראלי (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td> <td>Addgene</td><td>100834-AAV1</td><td>להזרקת</td></tr><tr><td></td><td></td> וירוסים <td>טיטר: 2.8 X 10^13 GC/ml</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>VETone</td><td>V1 510650</td><td>להשתלת עדשת GRIN</td></tr></tbody></table>

הזרקה נגיפית סטריאוטקסית והשתלת עדשה בעלת אינדקס שיפוע להדמיית סידן עמוקה במוח in vivo

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיניאטורי (מיניסקופ) הוא כלי רב עוצמה להדמיית סידן in vivo מחיות המתנהגות בחופשיות. הוא מציע מספר יתרונות על פני מערכות הדמיה קונבנציונליות של סידן מרובה פוטונים: (1) קומפקטי; (2) קל משקל; (3) בר השגה; ו-(4) מאפשר הקלטה מבעלי חיים שמתנהגים בחופשיות. פרוטוקול זה מתאר ניתוחי מוח להדמיית סידן in vivo במוח עמוק באמצעות מערכת הקלטה של מיניסקופ שפותחה בהתאמה אישית. הליך ההכנה מורכב משלושה שלבים, כולל (1) הזרקה סטריאוטקסית של הנגיף באזור המוח הרצוי במוח של מוח עכבר כדי לתייג תת-קבוצה מסוימת של נוירונים עם חיישן סידן מקודד גנטית; (2) השתלת עדשת אינדקס גרדיאנט (GRIN) שיכולה להעביר תמונת סידן מאזור מוח עמוק למערכת המיניסקופ; ו-(3) הצמדת מחזיק המיניסקופ מעל גולגולת העכבר, שם ניתן לחבר מיניסקופ מאוחר יותר. כדי לבצע הדמיית סידן in vivo , המיניסקופ מהודק על המחזיק, ותמונות סידן עצבי נאספות יחד עם הקלטות התנהגות סימולטניות. פרוטוקול הניתוח הנוכחי תואם לכל מערכת הדמיה מסחרית או מותאמת אישית של פוטון יחיד ושני פוטונים להדמיית סידן in vivo עמוקה במוח.

איור 1 מראה את ההליך הניסויי הסכמטי, הכולל הזרקה נגיפית, השתלת עדשת GRIN, הצמדת בסיס המיניסקופ לגולגולת העכבר והדמיית סידן in vivo באמצעות מיניסקופ. ההליך כולו אורך כחודשיים. איור 2 מראה את המרכיבים העיקריים המתוארים בפרוטוקול להדמיית סידן in vivo של מיניסקופ. איור 3 מציג את הממשקים של תוכנת AutoStereota במהלך השתלת עדשת GRIN. איור 4 מציג את הממשקים של NeuView ואת תוכנת הקלטת ההתנהגות במהלך הדמיית סידן in vivo.
התוצאה של הדמיית סידן in vivo תלויה בהצלחתם של ניתוחי הזרקה נגיפית והשתלת עדשות GRIN. איור 5 מראה מגוון של תוצאות (כלומר, לא מוצלחות, לא אופטימליות וטובות) מרישומי הדמיית סידן in vivo . במקרים לא מוצלחים, תמונת הסידן יכולה להיראות כהה או בהירה, אך בדרך כלל חושפת לא או מעט מאוד נוירונים פעילים. בדרך כלל איננו ממשיכים בניסויים ברישום סידן in vivo אם יש פחות מחמישה תאי עצב פעילים. הדמיית סידן in vivo טובה חושפת בדרך כלל כמה מאות נוירונים פעילים. אם הקלטה מכילה פחות ממאה תאי עצב פעילים, אנו רואים בה הקלטה לא אופטימלית.
הן בהקלטות לא אופטימליות והן בהקלטות טובות בוצעו ניסויי הדמיית סידן in vivo , וניתוח הנתונים שלאחר מכן בוצע. סרט 1 מציג הקלטה מייצגת של הדמיית סידן in vivo מ-mPFC של העכבר. סרטוני התנהגות ונתוני הדמיית סידן מעובדים בדרך כלל בנפרד. ניתן להבקיע באופן ידני סרטוני התנהגות עכבר. קבצי הדמיית סידן מעובדים באמצעות ארגז הכלים לעיבוד תמונה של סידן CaImAn24. איור 6 מראה מפת תאים מייצגת וכמה עקבות סידן מרישום טוב של הדמיית סידן in vivo .
לאחר השלמת הדמיית הסידן in vivo , השלב האחרון הוא לאשר אם ההזרקה הנגיפית והשתלת עדשת GRIN התרחשו באזור המוח הרצוי. לשם כך, העכבר הוחדר עם מלח בעל מאגר פוספט (PBS) ואחריו 4% פרפורמלדהיד (PFA). מוח העכבר נקטף, הוצב ב-4% PFA במשך 12 שעות, ואוחסן ב-PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מוח העכבר נחתך אז לפרוסות בעובי 50 מיקרומטר עם ויברטום. פרוסות המוח הוכתמו ב-DAPI ונצפו תחת המיקרוסקופ (לא מתואר בפרוטוקול)12. איור 7 הוא פרוסת מוח של עכבר בגודל של כ-1.94 מ"מ קדמית לברגמא מעכבר ניסיוני, ומראה את המסלול שבו הושתלה עדשת ה-GRIN. אזור הפלואורסצנציה הירוק מתחת למסלול עדשות GRIN ובסביבתו מציין את הביטוי של GCaMP6f באזור mPFC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> איור 1: סקירה סכמטית של ההליך הניסיוני. (B) השתלת עדשת GRIN ב-mPFC. (C) הצמדת בסיס מיניסקופ לגולגולת העכבר. (D) הרכבה של מיניסקופ והדמיית סידן in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> איור 2: רכיבים עיקריים הדרושים להדמיית סידן in vivo . (A) עדשת GRIN בקוטר 1 מ"מ ובאורך 4.38 מ"מ. (B) מחט קהה בעלת קצה קהה מלוטשת באורך 27 גרם המשמשת לשאיפת רקמת המוח. (C) הזרוע הרובוטית המוצמדת למחזיק המחט. (D) מכסה מותאם אישית מצינור PCR להגנה על עדשת ה-GRIN החשופה עד להצמדת בסיס מיניסקופ על גולגולת העכבר. (E) מחזיק המיניסקופ (בסיס) עם אום הקסדצימלי. (F) מיניסקופ שחלק החוט שלו עטוף בקלטת PTFE. (G) מיניסקופ מהודק לבסיסו באמצעות בורג נעילה. (ח) המיניסקופ האוחז בזרועו. (I) בקר ממונע תלת-ממדי שנבנה בהתאמה אישית ומשמש להקלה על תנועת המיניסקופ במיקומי XYZ. (J) מכסה מגן מהודק על הבסיס כדי להגן על עדשת ה-GRIN החשופה בזמן שהעכבר אינו מבצע הדמיית סידן in vivo . (K) המיניסקופ המחובר לכבל. (L) מערכת רכישת הנתונים להדמיה in vivo Ca2+ . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> איור 3: ממשקים של תוכנת AutoStereota במהלך שאיפת רקמת מוח שכבה אחר שכבה. (B) הממשק המתאים לשלבים 2.17.4 עד 2.17.6. (C) הממשק המתאים לשלבים 2.17.7 עד 2.17.9. (ד) הממשק המתאים לשלבים 2.17.10 עד 2.17.12. תיבות אדומות מדגישות את ערכי הקלט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> איור 4: הממשקים של תוכנת NeuView ותוכנת הקלטת ההתנהגות במהלך הדמיית סידן in vivo . (A) הממשק של NeuView. (ב,ג) הממשקים של תוכנת הקלטת ההתנהגות. תיבות אדומות מדגישות לחצנים שיש ללחוץ עליהם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> איור 5: הקרנה מקסימלית של תאים פלואורסצנטיים ממפים כדי להראות את טווח התוצאות האפשריות. (A) הוא כהה ומכיל פחות מ-5 תאי עצב פעילים. (B) הוא בהיר אך אין לו נוירונים פעילים. (C) מפת התאים מהדמיית סידן in vivo תת-אופטימלית המכילה כמה תאי עצב פעילים. (D) מפת התאים מהדמיית סידן in vivo טובה הכוללת כמה מאות נוירונים פעילים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> איור 6: מפת תאים מייצגת וחולף סידן מהדמיית סידן in vivo מוצלחת. הפאנל השמאלי הוא מפת התאים הפלואורסצנטיים של ההקרנה המקסימלית מהקלטת הדמיית סידן in vivo ב-mPFC במהלך בדיקת שדה פתוח. ההקלטה נמשכת 5 דקות. הפאנל הימני מציג ארעי סידן מ-15 אזורי עניין (תואמי צבע). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> איור 7: הערכה לאחר המוות של עכבר ניסיוני. ההערכה שלאחר המוות עבור ביטוי GCaMP6f והשתלת עדשת GRIN ב- mPFC של עכבר ניסיוני. האזור המלבני מציין את הנתיב להשתלת עדשת GRIN. האזור הירוק שמתחת לאזור המושתל בעדשת GRIN מאשר כי GCaMP6f הובטא, ועדשת GRIN הושתלה בדיוק באזור המוח הרצוי. Cg, קליפת המוח הסינגולטית; PrL, קליפת המוח הפרה-לימבית; IL, קליפת המוח האינפרא-לימבית. סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
טבלה 1: השוואות של מערכת המיניסקופים שנבנתה בהתאמה אישית ב-NIDA עם מערכות מיניסקופ אחרות 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
סרט 1: הקלטת הדמיית סידן in vivo מ-mPFC של העכבר במהלך בדיקת שדה פתוח. למטרות הדגמה, סרטון זה מציג רק הקלטה של דקה אחת. קצב הפריימים המקורי של ההקלטה הוא 10 פריימים לשנייה. הסרטון מהיר פי 6 מההקלטה המקורית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.</a>

הדמיית סידן in vivo של Miniscope in vivo היא טכניקה רבת עוצמה לחקר דינמיקה עצבית ומיקרו-מעגלים בעכברים המתנהגים בחופשיות. פרוטוקול זה מתאר ביצוע ניתוחי מוח להשגת הדמיית סידן in vivo טובה באמצעות מיניסקופ.

הזרקה נגיפית סטריאוטקסית והשתלת עדשה בעלת אינדקס שיפוע להדמיית סידן עמוקה במוח In Vivo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

הדמיית סידן in vivo של Miniscope מאפשרת לחוקרים לבחון את הפעילות המרחבית והמתואמת באופן זמני ממאות נוירונים במבנים מוחיים עמוקים של בעלי חיים המתנהגים בחופשיות. הדמיית הסידן של Miniscope in vivo מציעה יתרונות רבים, כולל היכולת לבצע הקלטות שהן ספציפיות לסוג התא, בקנה מידה גדול ואורכיות. פרוטוקול הניתוח שלנו להזרקה ויראלית והשתלת עדשת GRIN תואם לכל מערכת הדמיית פוטון בודדת מסחרית או מותאמת אישית ושתי מערכות הדמיית פוטון להדמיית סידן in vivo במוח העמוק.מי שידגים את ההליך יהיה רשמי טאפה, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. לאחר חיטוי האזור הכירורגי המגולח של עכבר מורדם, השתמש באזמל כדי לבצע חתך של שני סנטימטרים דרך העור לאורך קו האמצע כדי לחשוף את למבדה וברגמה של הגולגולת. לאחר איתור הקידוח הדנטלי בקוטר 0.5 מילימטר למיקום של 1.94 מילימטרים אחוריים קדמיים ו-0.5 מילימטרים רוחביים מדיאליים מהברגמה, התחילו לקדוח דרך הגולגולת.לאחר מכן, טען את הנגיף למזרק המיקרוליטר באמצעות לוח הבקרה של משאבת המיקרו והמשוך 500 ננוליטרים של בועת אוויר ואחריה 800 ננוליטרים של הנגיף בקצב זרימה של 50 ננוליטרים בשנייה. הזיזו באיטיות את המחט לתוך רקמת המוח אל קואורדינטת Z הממוקדת של הגחון הגבי באורך 1.75 מילימטרים, ואז הזיזו אותה מעט עד לקואורדינטת Z של הגחון הגבי באורך 1.65 מילימטרים. בלוח הבקרה, הגדר את משאבת המיקרו להזריק 500 ננו-ליטרים של הנגיף בקצב זרימה של 50 ננו-ליטרים בדקה לפני שתלחץ על כפתור ה-Run כדי להזריק את הנגיף.כאשר ההזרקה מסתיימת, יישרו את קצוות העור וסגרו בזהירות את החתך עם תפר 4-0. יש למרוח משחה אנטיביוטית על האזור התפור כדי למנוע זיהום. כדי להשתיל אינדקס שיפוע או עדשת GRIN, יש לשים אזור משולש של העור בגובה 1.5 ס"מ ובסיס של 1.5 ס"מ מהצד הקדמי בין העיניים לצד האחורי שמאחורי הלמבדה באמצעות מספריים עדינים.לאחר ניקוי יסודי של הגולגולת והתייבשות, יש למרוח ציאנואקרילט על קצות העור ולהצמיד את העור לגולגולת. לאחר חמש דקות כאשר הציאנואקרילט מתייבש, אתרו בור מקדחה דנטלי בקוטר 1.2 מילימטר למיקום של 1.94 מילימטרים אחוריים קדמיים, 0.8 מילימטרים רוחביים מדיאליים מהברגמה. קודחים דרך הגולגולת, ולאחר מכן מסירים את הדורה באמצעות קצה מחט של 30 מדים.נקו את כל פיסות פסולת העצם עם מלקחיים חדים בזווית של 45 מעלות. לאחר מכן, חברו מחט קצה קהה מלוטשת ידנית של 27 מדים למחזיק המחט המוצמדת לזרוע רובוטית מוטה בזווית של 10 מעלות וחברו את הקצה השני של מחזיק המחט למערכת הוואקום הביתית. אתר את קצה המחט רק כדי לגעת בברגמא לפני שתלחץ על כפתור Bregma כדי להגדיר את קואורדינטת Z של bregma לאפס.הגדר את ערך הקלט X ל- 0.8, הזן ערך Y ל- 1.94, הזן את ערך Z ל- 1.0 ולחץ על חפש כפתור כדי להזיז את המחט לראש החור שנקדח בגולגולת. מרכזים את קצה המחט אל החור שנקדח ומורידים אותה למצב Z אפס. הפעילו את הוואקום והתחילו לשטוף את אזור המוח החשוף בנוזל מוחי מלאכותי, או ACSF, באמצעות מערכת צינורות מבוקרת כבידה המחוברת למחט של 30 מדים עם קצה כפוף.ACSF מבעבע באופן רציף עם תערובת גזים של 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני תוך כדי סינון דרך מסנן של 0.2 מיקרון. באמצעות תוכנת AutoStereota, השאיפה של רקמת המוח תושלם בארבעה סבבים. עבור הסיבוב הראשון של השאיפה, ודא שהערך Z מציג אפס.לאחר מכן, בהפעלה zStep, לחץ ובדוק את השורה הראשונה והשנייה. הגדר את הערכים עבור השורה הראשונה ל- 0.2 ו- 1. הגדר את הערכים עבור השורה השנייה ל- 0.15 ו- 4.בהפעלה 'מצב', הגדר את גודל המחט 27 ו-1.2. סט דימס 0.9. כל הערכים האחרים יהיו ברירת המחדל.כדי להתחיל את השאיפה, לחץ ברצף על הלחצנים NotSet, KeepZero ו-Start. הסיבוב הראשון של השאיפה יוצר כיס עמוד עם עומק של 0.8 מילימטרים וקוטר של מילימטר אחד. בסיבוב השלישי של השאיפה, לחץ ובדוק את השורה הראשונה עבור הפעלת zStep והגדר את הערכים עבור השורה הראשונה ל- 1.8 ו- 1.בהפעלה 'מצב', הגדר את גודל המחט 27 ו- 2.2. התחל את השאיפה על ידי שמירה על ערכים אחרים זהים לאלה של הסיבוב הקודם. לאחר הסיבוב השלישי של השאיפה, עומק כיס העמוד הוא 1.8 מילימטרים.הסיבוב האחרון של השאיפה הוא לנקות את הדם שהצטבר בתחתית הכיס. הגדר את הערכים עבור השורה הראשונה ל- 1.6 ו- 1 בהפעלת zStep והגדר גודל מחט 27 מד ו- 2.2 ו- Dims 0.6 בהפעלת מצב לפני תחילת השאיפה. ברגע שהכיס נקי מדם, עצרו את הוואקום, הפסיקו את ההשקיה של ACSF והביאו את המחט למעלה 2 מילימטרים בקואורדינטות Z ו-0.5 מילימטרים קדמיים למרכז.הכניסו את עדשת ה-GRIN הסטרילית בקוטר 1 מילימטר לכיס רקמת המוח. לאחר מכן, יש למרוח את האגרוז המומס במרווח שבין עדשת ה-GRIN לרקמת המוח בעזרת מרית. לאחר agarose יוצר ג'ל, להסיר עודף agarose באמצעות להב מיקרו.מערבבים את אבקת המלט הדנטלית ואת נוזל הזרזים בבאר ערבוב מצוננת מראש ומורחים שכבה של מלט שרף דבק מרפא את עצמו על הגולגולת, החל מהקפת עדשת ה-GRIN ולאחר מכן כיסוי כל הגולגולת החשופה. בבאר פלסטיק נקייה, מערבבים אבקת מלט דנטלית ופחם שחור עם נוזל כדי למרוח שכבה דקה של התערובת על גבי השכבה הראשונה של המלט הדנטלי. תנו לו להתקשות במשך חמש דקות.חבר את המיניסקופ לכבל והפעל את התוכנה שפותחה בהתאמה אישית NuView. ב- NuView, לחץ על חומרה, בדוק את LED1 ולחץ על הזרם כפתור כדי להציג את התמונות החיות. כדי להפסיק את ההזרמה בשידור חי, לחץ על עצור כפתור.לאחר מכן, התיישבו המיניסקופ בזרוע האחיזה של מיניסקופ שנבנתה בהתאמה אישית. בעזרת בקרים ממונעים, אתרו את המיניסקופ ממש מעל עדשת ה-GRIN החשופה, מה שהופך אותה למקבילה לפני השטח של העדשה. הורידו באיטיות את המיניסקופ לכיוון עדשת ה-GRIN והתאימו את מיקום ה-Z שלו עד שיימצא מישור המיקוד הטוב ביותר.יש למרוח את השכבה הראשונה של מלט דנטלי סביב בסיס המיניסקופ מבלי לשנות את מיקום המיניסקופ. לאחר הקשחת המלט, הסר בעדינות את הזרוע המחזיקה כך שהמיניסקופ יוכל לעמוד בפני עצמו על ראש העכבר. יש למרוח שכבה שנייה של מלט דנטלי סביב הבסיס כדי למלא את כל הפערים, ולוודא שאין דליפת נורת LED מהמרווחים.תנו למלט הדנטלי להתקשות. לאחר הרדמה קצרה של העכבר עם איזופלורן, שחררו את בורג הנעילה בבסיס עם מברג קטן לפני הסרת מכסה המגן ונקו את פני השטח של עדשת GRIN עם צמר גפן ספוג אצטון. חברו את המיניסקופ לכבל והפעילו את תוכנת NuView כדי להתחיל לזהות את מישור המוקד הטוב ביותר עם התאמת מיקום המיניסקופ ביחס לבסיס על ידי הידוק קל או התרופפות בעזרת מלקחיים קהים.לאחר קביעת מישור המוקד הטוב ביותר, הדקו את בורג הנעילה לפני ניתוק הכבל והנחת העכבר בחזרה בכלוב הביתי שלו. הפעל את תוכנת מצלמת ההתנהגות כדי להציג את זירת התנהגות העכבר באמצעות פונקציית שידור חי. כוונו באופן ידני את המיקוד של המצלמה העליונה.בחר הפעל Strobe ובדוק את הפעל /השבת את ההדק, ולאחר מכן לחץ על לחצן הקלט. לאחר מכן השתמש ב- Browse כדי לבחור מיקום שבו יישמרו הקלטות התנהגות. בחר את תבנית התמונה הרצויה.קירבו את העכבר לזירה וחברו את המיניסקופ לכבל המקושר למערכת איסוף הנתונים. לאחר מכן הניחו את העכבר במרכז הזירה. בתוכנת מצלמת ההתנהגות, לחץ על התחל הקלטה.ב- NuView, בדוק את LED1, לחץ על Capture ולאחר מכן הפעל לחצנים כדי להתחיל להקליט. זה מאפשר הקלטות בו זמנית של הדמיית סידן והתנהגות עכבר. לחץ על עצור אחרי 3, 000 מסגרות ושמור את הקבצים.בסיום ההקלטה, הרדימו לזמן קצר את העכבר עם איזופלורן, נתקו את המיניסקופ מהבסיס והניחו את מכסה המגן מעל הבסיס לפני שהחזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו. מפת התאים מהדמיית סידן in vivo תת-אופטימלית הכילה כמה תאי עצב פעילים, בעוד שמתוך הדמיה מוצלחת כללה כמה מאות נוירונים פעילים באזור הממוקד. בדוגמה הטיפוסית של הדמיית סידן in vivo לא מוצלחת, האזור נצפה כהה והכיל פחות מחמישה נוירונים פעילים, או שהאזור היה בהיר אך לא היו בו נוירונים פעילים.בניתוח הייצוגי מוצגים מפת התאים הפלואורסצנטיים של ההקרנה המקסימלית וחלופי סידן מרישום רציף של הדמיית סידן in vivo. ההערכה שלאחר המוות לביטוי GCaMP6f והשתלת עדשת GRIN ב-PFC המדיאלי של עכבר ניסיוני הצביעה על כך ש-GCaMP6f הובטא ועדשת ה-GRIN הושתלה במדויק באזור המוח הרצוי. כדי לקבל הדמיית סידן טובה, יש צורך להבטיח כי הדימום נעצר לחלוטין ואת השדה נקי קרישי דם לפני השתלת עדשת GRIN.ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור שינויים במעגלים עצביים במודל העכברים של הפרעות מוחיות אנושיות שונות ולבדוק אם מועמד לתרופה יכול לנרמל את המעגלים שהשתנו.

stereotaxic-viral-injection-gradient-index-lens-implantation-for-deep

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כדי להבין את הדינמיקה של הרשת microcircuits ב הניאוקורטקס, חיוני להקליט בו זמנית את הפעילות של מספר גדול של נוירונים. In-vivo שני הפוטונים הדמיה סידן היא השיטה היחידה המאפשרת להקליט את הפעילות העצבית של אוכלוסייה צפופה עם רזולוציה של תא בודד.

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

במאמר זה, אנו מציגים שיטה להפוך מחטים נימי זכוכית עם לומן 50 מיקרומטר. טכניקה זו מפחיתה באופן משמעותי את הנזק המוחי, ממזער דיפוזיה פסיבית של תרופות ומאפשרת מיקוד מדויק לתוך המוח מכרסמים.

מיקוד של מבנים מוחיים עמוקים עם Microinjections עבור משלוח של תרופות, וקטורים ויראליים, או השתלת תאים

מקור: Lee, H. et. al., הדמיית סידן מוצלחת in vivo עם מיקרוסקופ ממוזער המותקן על הראש באמיגדלה של עכבר שמתנהג בחופשיות. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים הדמיית סידן in vivo בעכבר באמצעות מקדם שבירה שיפוע, או עדשת GRIN, ומיקרוסקופ ממוזער. המערך משלב קיבוע ראש בתוך מערכת כלובים ניידת ללא חיכוך, מגרה נוירונים ומעורר זרם יוני סידן. עדשת GRIN לוכדת איתות סידן במוח, ומאפשרת הדמיה בזמן אמת של פעילות עצבית.

הדמיית סידן מיקרואנדוסקופית בזמן אמת בעכבר הנע בחופשיות

מקור: Thapa, R., et. al., הזרקה ויראלית סטריאוטקסית והשתלת עדשות אינדקס שיפוע למוח עמוק  In Vivo הדמיית סידן.  J. Vis. Exp. (2021)הסרטון מדגים הדמיית סידן בזמן אמת באמצעות מיניסקופ בעכבר שעבר התמרה, ומתאם בין פעילות עצבית להתנהגות.

הדמיית סידן בזמן אמת של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית של עכבר באמצעות מיניסקופ

כאן אנו מתארים את הפרוצדורות כרוכות בהדמיה שני פוטונים של קליפת המוח עכבר בהתנהגות בסביבת מציאות מדומה.

סידן הדמיה שני פוטונים בעכברים ניווט סביבת מציאות מדומה

דימות סידן מיקרונדוסקופי In vivo הוא כלי רב ערך המאפשר ניטור בזמן אמת של פעילויות עצביות בבעלי חיים מתנהגים בחופשיות. עם זאת, יישום טכניקה זו על האמיגדלה היה קשה. פרוטוקול זה נועד לספק קו מנחה שימושי עבור מיקוד מוצלח תאי אמיגדלה עם מיקרוסקופ מיניאטורי בעכברים.

מוצלח בהדמיית סידן Vivo עם מיקרוסקופ מיניאטורי ראש הר באמיגדלה של עכבר מתנהג בחופשיות

אנו מציגים פרוטוקול לחשוף את גזע המוח של עכבר בוגר מהצד הגחוני. באמצעות עדשת מדד שבירה הדרגתית עם מיקרוסקופ מיניאטורי, ניתן להשתמש בהדמיית סידן כדי לבחון את הפעילות של סומטה עצבית זית נחותה ב- vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

התכווצות המלט הדנטלי במהלך הריפוי מחליפה את לוחית הבסיס. פרוטוקול זה ממזער את הבעיה על ידי יצירת בסיס ראשוני של המלט הדנטלי שמשאיר מקום למלט את לוח הבסיס. שבועות לאחר מכן, ניתן לקבע את לוח הבסיס במקומו על פיגום זה באמצעות מלט חדש קטן, ובכך להפחית את התכווצותו.

שימוש בציפוי בסיס ובמיניסקופ מעוגן מראש עם עדשה אובייקטיבית למחקר חולף בסידן בעכברים

הבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס מבצעת תפקידים חיוניים ומובחנים בלמידה ובזיכרון. פרוטוקול זה מתאר סדרה של הליכים חזקים ויעילים להדמיית סידן in vivo של תאי גרגירים בבליטה המשוננת בעכברים הנעים בחופשיות.

In Vivo הדמיית סידן של תאי גרגירים בבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס בעכברים 

פרוטוקול זה מפרט הדמיית סידן ב-vivo של נוירונים היפותלמיים באמצעות מיקרוסקופ מוקטן (מיניסקופ) בעכברים המתנהגים בחופשיות במהלך מניפולציה של מצב חברתי (בידוד חברתי ואיחוד חברתי). שיטה זו מאפשרת דימות ברזולוציה של נוירון יחיד של פעילות ההיפותלמוסית שמייצגת צורך חברתי וסיפוק חברתי, ומאפשרת מחקרים מכניים של הומאוסטזיס חברתי.

In Vivo הדמיית סידן עם מיקרוסקופ מיניאטורי בהיפותלמוס להבנת התנהגויות חברתיות בעכברים

למד הדמיית סידן עמוקה במוח in vivo באמצעות מיניסקופ ועדשת GRIN בעכברים חופשיים. פרוטוקול זה מאפשר מעקב אחר פעילות מאות נוירונים במעגלים עצביים חיים לאורך זמן.

הזרקה נגיפית סטריאוטקסית והשתלת עדשה בעלת אינדקס שיפוע להדמיית סידן עמוקה במוח In Vivo

גלה סרטונים נוספים