Name: אימונופטידומיקה: בידוד של עכבר ו- MHC אנושי Class I- ופפטידים הקשורים II לניתוח ספקטרומטריית מסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: למדו לבודד פפטידים מקומפלקסי MHC מסוג I ו-II מקווי תאים של עכבר ואדם לניתוח ספקטרומטריית מסה. פרוטוקול זה פשוט לביצוע ונגיש לכל מעבדה מחקרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפייר טיבאלט, אריק בוניל, ז'ול לנואה, קרוליין קוט (המכון למחקר באימונולוגיה וסרטן, אוניברסיטת מונטריאל) ואנתוני פרסל (אוניברסיטת מונאש) על הערותיהם התובנות. עבודה זו נתמכה במימון פונדס דה רשצ'ה דו קוויבק - סנטה (FRQS), קרן קול, צ'ו סנטה-ג'סטין, וקרנות צ'ארלס-ברונו, קרן קנדה לחדשנות, המועצה הלאומית למדעים ומחקר הנדסה (NSERC) (#RGPIN-2020-05232) והמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) (#174924).

הפרוטוקול שסופק כאן הותאם מפרוטוקולים שנקבעו13,14,15,16,17,18,19,20. ההליך הכולל לטיהור חיסונים (IP) של פפטידים מסוג MHC I ו- II מומחש באיור 1. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות קווי התאים והנוגדנים בהם נעשה שימוש.
1. צימוד חרוזים עם הנוגדנים (יום 1): זיווג נוגדנים לחרוזים המופעלים על ידי CNBr
הערה: הכינו פתרונות חדשים לכל ניסוי חדש. עיין בטבלת החומרים וטבלה משלימה 1 לרשימת המתכונים של ריאגנטים ופתרונות. כל השלבים מתבצעים בטמפרטורת החדר (RT). בעת שימוש בנוגדן חדש, בדקו את יעילות האיגוד על-ידי איסוף aliquots מפתח (ראו אינדיקציה OPTIONAL) וביצוע SDS-PAGE מכתים כחולים של Coomassie (איור 2).
<ol><li>הפעלה של חרוזי CNBr sepharose<ol>
<li>שוקלים 80 מ"ג של חרוזים המופעלים על ידי CNBr לכל דגימה ומעבירים אותם לצינור חרוטי של 15 מ"ל.</li>
		<li>כדי להקל על resuspension של חרוזים מיובשים, הראשון, להוסיף 5 מ"ל של 1 מ"מ M HCl ו pipette למעלה ולמטה 5 פעמים. לאחר מכן, למלא את הצינור החרוטי עם 8.5 מ"ל נוספים של 1 מ"מ HCl.</li>
		<li>יש לסובב במהירות של 20 סל"ד (סיבובים לדקה) למשך 30 דקות ב-RT באמצעות התקן סיבוב. צנטריפוגה החרוזים ב 200 x g במשך 2 דקות ב RT ולהסיר את supernatant על ידי שאיפה.</li>
		<li>מוסיפים 500 μL של חיץ צימוד לכדור החרוזים ומעבירים לצינור צנטריפוגה חדש של 2.0 מ"ל ושומרים בצד לשלב 1.2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צימוד נוגדנים לחרוזים המופעלים על ידי CNBr<ol>
<li>הכן את הנוגדן שנבחר לבידוד של פפטידים מסוג MHC I או II בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 2.0 מ"ל על ידי הוספת 2 מ"ג של הנוגדן (על פי הריכוז שצוין על ידי היצרן). השלם את הנפח ל 1 מ"ל עם פתרון חיץ צימוד כדי לקבל ריכוז סופי של 2 מ"ג / מ"ל.</li>
		<li>צנטריפוגה החרוזים משלב 1.1.4 ב 200 x g במשך 2 דקות ב RT ולאחר מכן להסיר את supernatant על ידי שאיפה.</li>
		<li>הוסף את תמיסת הנוגדנים לצינור המיקרו-צנטריפוגה 2.0 מ"ל המכיל את החרוזים הפעילים.</li>
		<li>(אופציונלי) קח aliquot של 18 μL (קלט), להוסיף 6 μL של מאגר SDS-PAGE 4x, ולהקפיא מיד.</li>
		<li>סובב את שפופרת המיקרו-צנטריפוגה משלב 1.2.3 ב-20 סל"ד למשך 120 דקות באמצעות התקן סיבוב. צנטריפוגה החרוזים ב 200 x g במשך 2 דקות ולאחר מכן להסיר את supernatant.</li>
		<li>(אופציונלי) קח aliquot של 18 μL של supernatant (נוגדן לא מאוגד), להוסיף 6 μL של 4x SDS-PAGE חוצץ ולהקפיא מיד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חסימה ושטיפה של נוגדנים עם חרוזים<ol>
<li>הוסף 1 מ"ל של 0.2 M גליצין לצינור microcentrifuge המכיל את החרוזים מצמידי הנוגדנים משלב 1.2.5. סובב במהירות של 20 סל"ד למשך 60 דקות ב- RT באמצעות התקן סיבוב.</li>
		<li>צנטריפוגה החרוזים ב 200 x g במשך 2 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant. יש להוסיף מ"ל אחד של PBS (תמיסת מלח חוצצת פוספט).</li>
		<li>צנטריפוגה החרוזים ב 200 x g במשך 2 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.</li>
		<li>(אופציונלי) קח aliquot של 18 μL של supernatant (נוגדן מאוגד, לשטוף האחרון), להוסיף 6 μL של 4x SDS-PAGE חיץ ולהקפיא מיד.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של PBS לחרוזים בשלב 1.3.3.</li>
		<li>(אופציונלי) קח aliquot של 18 μL של תערובת חרוזים (חרוזים בשילוב עם נוגדן), להוסיף 6 μL של 4x SDS-PAGE חיץ, ולהקפיא מיד.</li>
		<li>יש לשמור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש באותו יום בשלב 2.5. הערה: ניתן להכין חרוזים יום לפני האימונו-כיפה, אך אחסון ארוך יותר לא נבדק.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. תמוגה תאית ואימונוכיטור עם נוגדנים עם חרוזים משולבים (יום 1)
הערה: רמת מולקולות ה-MHC משתנה מסוג תא אחד לאחר, ומוצע לכימות של מולקולות MHC/HLA לכל תא21 (איור 4A). אנו ממליצים על מינימום של 1 x 108 תאים עבור כל IP. מספר זה של תאים מתאים 6-10 מ"ג של חלבון מתאי JY, EL4, ו- A20 solubilized עם 0.5% חיץ Chaps. כדי להכין כדורי תאים עבור כתובות IP, תאים צריכים להיות נקצרים, צנטריפוגה, ושטוף פעמיים עם 5 מ"ל של PBS. לאחר מכן, כדורי תא ניתן לאחסן בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל או צינור חרוטי 15 מ"ל ב -80 °C (80 °F) עד הזמן של IP. שים לב שניתן לבצע כתובות IP על כדורי תאים טריים שנקטפו או קפואים.
<ol><li>כדי לבודד פפטידים מסוג MHC I או II, להפשיר גלולה קפואה של 1 x 108 תאים על ידי חימום החלק התחתון של הצינור עם כף היד. מוסיפים 500 μL של PBS לכדור ופיפטה למעלה ולמטה עד ההשעיה הומוגנית. הערה: בהתאם לסוג התא, נפח גלולה התא יכול להשתנות באופן משמעותי. אם 500 μL של PBS אינו מספיק כדי להמיס את גלולה התא, להשתמש יותר PBS עד התאים להתפרק בקלות תוך צנרת למעלה ולמטה.</li>
	<li>למדוד את הנפח הכולל של הכדור resuspended ב- PBS ולהעביר לתוך צינור חדש 2 מ"ל צינור microcentrifuge צינור. לפצל לצינורות נוספים במידת הצורך.</li>
	<li>הוסף נפח של מאגר תמוגה תא (1% chaps חוצץ PBS המכיל מעכבי פרוטאז, 1 גלולה / 10 מ"ל של חוצץ) שווה ערך לנפח של גלולה תא resuspended ב PBS נמדד בשלב הקודם. הריכוז הסופי של מאגר תמוגה הוא 0.5% בחורים.</li>
	<li>סובב ב-10 סל"ד למשך 60 דקות ב-4 °C (4 °F) באמצעות התקן סיבוב. צנטריפוגה lysate התא ב 18,000 x g במשך 20 דקות ב 4 °C (4 °F ) עם בלם מלא ולהעביר את supernatant (המכיל את מתחמי MHC-פפטידים) בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 2.0 מ"ל.</li>
	<li>לשחזר את החרוזים מצמידים נוגדנים משלב 1.3.7 על ידי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 2 דקות ולהסיר את supernatant.</li>
	<li>העבר את תא lysate supernatant בשלב 2.4 לחרוזים מצמידי הנוגדנים ודגר עם סיבוב (10 סל"ד) במשך 14-18 שעות (לילה) ב 4 °C (4 °C (65 °F) באמצעות מכשיר סיבוב.</li>
</ol>3. הברחה של פפטידים MHC (יום 2)
הערה: עמודת פוליפרופילן מאפשרת התפעלות של מתחמי MHC-פפטיד תוך שמירה על החרוזים בעמודה. על מנת להעריך את היחס היחסי של מתחמי MHC-פפטידים התחום לחרוזים לפני ואחרי ההמלטות החומצית עם 1% TFA (חומצה משולשת), ניתן לבצע כתם מערבי עם aliquots שננקטו בשלבים מרכזיים במהלך הפרוטוקול (ראה אינדיקציה אופציונלית). סופג מערבי המוצג באיור 3 חושף את ההעשרה של מתחמי MHC-פפטידים בעקבות ההרחבה החומצית עם 1% TFA. היעדר האות בשבר זה יצביע על כך ששלב ההמלטה לא הצליח. שים לב כי חלקם של מתחמי MHC-פפטידים מאוגדים לחרוזים ניתן להעריך גם במקביל על ידי סופג מערבי באמצעות aliquot המתואר בשלב 3.1.6.
<ol><li>התרחבות של מתחמי MHC-פפטיד מהנוגדנים החרוזים<ol>
<li>הסר את המכסה התחתון של עמודת הפוליפרופילן, הנח את העמודה על ארון העמודות פוליפרופילן והתקין מיכל ריק מתחת כדי לאסוף זרימה דרכו. הערה: נדרשת עמודה אחת לכל דגימה.</li>
		<li>לשטוף את עמודת פוליפרופילן עם 10 מ"ל של חוצץ A ולתת לו לנקז על ידי כוח המשיכה. אם מהירות הזרימה של ההמלטות הנוזלית איטית מדי, חתוך עוד יותר את הקצה התחתון של עמודת הפוליפרופילן.</li>
		<li>למדוד ולאסוף את תערובת חרוזים-lysate (~ 2 מ"ל) משלב 2.5 ולהעביר אותו לתוך עמודת פוליפרופילן.</li>
		<li>(אופציונלי) קח aliquot של 20 μL (או 1/100 מתוך הנפח הכולל) עבור סופג מערבי להקפיא מיד. שבר זה מתאים לתרכובות MHC-פפטידים הכוללות המדגרות עם החרוזים.</li>
		<li>תן לתערובת הנוזלית לברוח על ידי כוח המשיכה.</li>
		<li>(אופציונלי) לאסוף ולמדוד את הזרימה דרך ולקחת aliquot של 20 μL (או 1/100 מתוך הנפח הכולל) עבור סופג מערבי להקפיא מיד. שבר זה מייצג את שאריות תסביכי MHC-פפטידים לא מאוגדים.</li>
		<li>כדי לשחזר את תערובת החרוזים-lysate ככל האפשר, לשטוף את הצינור משלב 3.1.3 עם 1 מ"ל של חוצץ A ולהעביר אותו לעמודת פוליפרופילן.</li>
		<li>לשטוף את החרוזים שנשמרו בעמודה פוליפרופילן על ידי הוספת 10 מ"ל של חוצץ A. תן למאגר הכביסה לברוח על ידי כוח המשיכה.</li>
		<li>חזור על שלב הכביסה עם 10 מ"ל של חיץ B, 10 מ"ל של חוצץ A ולאחר מכן 10 מ"ל של חיץ C.</li>
		<li>הסר את עמודת הפוליפרופילן מהמדף והנח אותה על גבי צינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 2.0 מ"ל. החזק את העמוד ואת הצינור יחד עם היד.</li>
		<li>הוסף 300 μL של 1% TFA לעמודת פוליפרופילן ולערבב את החרוזים על ידי צנרת למעלה ולמטה 5 פעמים. הערה: החרוזים יישמרו בעמודת הפוליפרופילן, והפפטידים הקשורים ל- MHC יתעלמו בצינור המיקרו-צנטריפוגה של 2.0 מ"ל.</li>
		<li>מעבירים את ההמלטה בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 2.0 מ"ל. חזור על שלב 3.1.11 ובריכה את 2 eluates (eluates המכיל את מתחמי MHC-פפטיד צריך להתאים סך של 600 μL וישמש בשלב 3.2.4).</li>
		<li>(אופציונלי) לאסוף aliquot של 6 μL (או 1/100 של הנפח הכולל) עבור סופג מערבי להקפיא מיד. שבר זה מתאים למתחמי MHC-פפטידים שנמלטו מהחרוזים.</li>
	</ol></li>
	<li>התפלה והרחבה של פפטידים MHC הערה: התפלה והרחקה של שלבי פפטידים MHC יכול להיעשות על ידי התקנת העמודה C18 על צינור מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל. להתאמה טובה יותר, התקן את החישולים המסופקים על ידי היצרן בין העמודה C18 לבין צינור מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בעמודת C18 עם קיבולת עוצמת קול של 5-200 μL (6-60 מיקרוגרם). כל השלבים מתבצעים ב- RT.<ol>
<li>הוסף 200 μL של מתנול על גבי עמודה C18, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1546 x g במשך 3 דקות. להשליך את הזרימה דרך.</li>
		<li>הוסף 200 μL של 80% ACN (acetonitrile)/0.1%TFA מעל העמודה C18, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1546 x g במשך 3 דקות. להשליך את הזרימה דרך.</li>
		<li>הוסף 200 μL של 0.1%TFA על גבי העמודה C18, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1546 x g במשך 3 דקות. להשליך את הזרימה דרך.</li>
		<li>טען 200 μL של מתחמי MHC-פפטיד משלב 3.1.12 מעל העמודה C18. צנטריפוגה ב 1546 x g במשך 3 דקות ולהשליך את הזרימה דרך.</li>
		<li>חזור על שלב 3.2.4 פעמיים עד לטעינת אמצעי האחסון המלא. שים לב שפפטידים של MHC נשמרים בעמודה C18.</li>
		<li>הוסף 200 μL של 0.1%TFA לעמודה C18, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1546 x g במשך 3 דקות. להשליך את הזרימה דרך.</li>
		<li>העבר את עמודת C18 לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 2.0 מ"ל. הפחת פפטידים MHC מהעמודה C18 על-ידי הוספת 150 μL של 28%ACN/0.1%TFA.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 1546 x g במשך 3 דקות.</li>
		<li>העבר את הזרימה דרך בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל. היזהר לא להשליך את הזרימה דרך; הוא מכיל את הפפטידים המבודדים מסוג MHC I או II.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.2.7-3.2.9 פעמיים עבור נפח כולל של 450 μL.</li>
		<li>להקפיא את 450 μL של eluate (מטוהר MHC class I או II פפטידים) ב -20 °C (20 °F) עד דגימות מנותחות על ידי LC-MSMS.</li>
		<li>לפני ניתוח LC-MS/MS, פפטידים מטוהרים מסוג MHC I או II משלב 3.2.11 מתאדים ליובש באמצעות רכז ואקום עם הגדרות קבועות מראש של 45 °C (45 °F) עבור 2 שעות, רמת ואקום: 100 mTorr ורמפה ואקום: 5. הערה: האידוי של דגימות קפואות הוא יעיל מאוד. פפטידים מיובשים ניתן להקפיא מחדש עד ניתוח.</li>
	</ol></li>
</ol>4. זיהוי פפטידים מסוג MHC I ו- II על ידי LC-MS / MS
הערה: נתח את החיסון MHC Class I ו- II באמצעות Orbitrap בעל ביצועים גבוהים וספקטרומטרים של מסה של זמן טיסה מרובע ברזולוציה גבוהה6. המידע הבא ניתן כאינדיקציה בלבד, תוך התחשבות בכך שכלי הספקטרומטריה השונים הקיימים של מסת טנדם פועלים על פי סטנדרטים תפעוליים שונים. מתווה קצר של השלבים נדון להלן :
<ol><li>Solubilize את הדגימות היבשות (משלב 3.2.12) ב 50 μL של 4% חומצה פורמית (FA).</li>
	<li>טען שלוש זריקות של 16 μL עבור כל מדגם ונפרד בעמודה הפוכה תוצרת בית (150-μm i.d. על ידי 250 מ"מ אורך, יופיטר 3 מיקרומטר C18 300 Å) עם שיפוע מ 5%-30% ACN-0.1% FA וקצב זרימה של 600 nL / min על UHPLC ננו-זרימה מחובר MS.</li>
	<li>רכש כל ספקטרום MS מלא ברזולוציה של 120000, AGC של 4 x 105 עם מצב אוטומטי לזמן ההזרקה וספקטרה באמצעות טנדם-MS (MS-MS) על יונים קודמים טעונים כפולים הנפוצים ביותר עבור מקסימום של 3 s. הערה: ניסויי טנדם-MS מבוצעים באמצעות דיסוציאציה מתנגשת באנרגיה גבוהה יותר (HCD) באנרגיית התנגשות של 30%, רזולוציה של 30,000, AGC של 1.5 x 105 וזמן הזרקה של 300 אלפיות השנייה.</li>
	<li>לעבד את קבצי הנתונים משלוש הזריקות / מדגם באמצעות תוכנת ניתוח פרוטאומיקה LC-MS / MS (למשל, PEAKS X) באמצעות העכבר ומאגרי מידע אנושיים (UniProtKB / Swiss-Prot (2019_09)).</li>
	<li>בחרו 'עיכול אנזימים שלא צוין' לפרמטר האנזים, ו-10 עמודים לדקה ו-0.01 Da לטולרנסים המוניים על יונים מבשרים ורסיסים, בהתאמה. הערה: שינויים משתנים הם deamidation (NQ) וחמצון (ז). כל פרמטרי החיפוש האחרים הם ערכי ברירת המחדל. רשימות פפטיד סופיות מסוננות באמצעות ALC של 80% ועם שיעור גילוי כוזב (FDR) של 1% באמצעות תוכנת ניתוח LC-MS/MS של proteomics.</li>
</ol>5. הדמיה של נתוני אימונופטידומיקה
הערה: ניתן להעריך את איכות נתוני האימונופטידומיקה הנוצרים על ידי MS בדרכים מרובות, כפי שתואר לאחרונה 22,23. כדי להמחיש את הנתונים ולהעריך את האיכות הכוללת שלהם, הרכב וספציפיות MHC, ניתן להשתמש בכלי התוכנה MhcVizPipe (MVP).
<ol><li>בצע את כל ההוראות והתיעודים הקשורים כדי להתקין ולהפעיל את תוכנת ה- MVP הזמינה באתר האינטרנט של מעבדת קארון GitHub24. הערה: ה-MVP מספק תצוגה מהירה ומאוחדת של איכות הדגימה, הרכב וספציפיות MHC. MVP מקביל לשימוש באלגוריתמים אימונופטידומיים מבוססים היטב (NetMHCpan25, NetMHCIIpan26 ו- GibbsCluster27) ומפיק דוחות מאורגנים וקלים להבנה בתבנית HTML (שפת סימון היפר-טקסט). הדוחות ניידים לחלוטין וניתן לצפות בהם בכל מחשב עם דפדפן אינטרנט מודרני. ראה נתונים משלימים 1-4 לקבלת דוגמאות של דוחות HTML.</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

שני קווי תא עכבר (EL4 ו- A20), קו תא אנושי אחד (JY) וחמישה נוגדנים זמינים מסחרית [M1 (אנטי H2Db / Kb), Y3 (אנטי H2Kb), M5 (אנטי H2-IAd / IEd), W6/32 (אנטי HLA-ABC) ו- L243 (anti-HLA-DR)] נבדקו ואומתו בהקשר של פרוטוקול זה ומספקים נתוני אימונופטידומיקה באיכות גבוהה. נוגדנים אחרים נגד HLA זמינים (למשל, אנטי HLA-A2 BB7.2) אך לא נבדקו כאן. שים לב כי נוגדן W6/32 נמצא בשימוש נרחב ואת הנוגדן המבוסס ביותר בתחום; זה מאפשר בידוד של פפטידים שהוצגו על ידי כל מולקולות HLA-ABC בבני אדם ודווח בעבר על ידי מעבדות מומחים לעבוד ממקורות ביולוגיים שונים כגון רקמות טריות או קפואות8,39, תאים חד גרעיניים דם היקפיים ותא מונו-גרעיני מח עצם40, ביופסיות41, xenografts41,42, נתיחות שלאחר המוות43 ודגימות פלזמה44,45.
הכנת פתרונות טריים המשמשים לאורך הפרוטוקול היא קריטית. בפרט, השימוש בפתרונות חומציים טריים בבקבוקי זכוכית הוא קריטי כדי למנוע זיהום עוקב של הדגימות שניתחו על ידי MS. בנוסף, כאשר הפרוטוקול נעשה בפעם הראשונה ו / או עם נוגדן חדש, חשוב להעריך כי הנוגדן הוא אכן מצמיד לחרוזי Sepharose CNBr באמצעות ג'ל Coomassie כחול. שלבי הכביסה של החרוזים המשולבים עם הנוגדנים בעקבות אימונוכד של מתחמי MHC-פפטידים הם גם קריטיים כדי למנוע זיהום של פפטידים שאינם MHC. לבסוף, טיפול מיוחד נדרש כדי לא להיפטר eluates בעקבות ההתרוממות של מתחמי MHC-פפטיד עם 1% TFA ואת ההשתחצנות של פפטידים מן הטור C18 עם ACN28%/0.1% FA.
הפרוטוקולים הקיימים הזמינים בספרות מתארים צעדים נוספים לטיהור נוסף של הפפטידים בסוף הליך הבידוד, למשל, פיצול פפטיד בשיטות שונות14,46 או סינון אולטרה באמצעות מסנני 10-30 kDa13,47. הפרוטוקול הנוכחי אינו מספק פרטים על שלבים נוספים אלה ומספיק כדי לספק נתוני אימונופטידומיקה באיכות גבוהה. עם זאת, צעדים כאלה יכולים להיחשב על ידי לא מומחים כדי לשנות ולפתור בעיות כדי לייעל עוד יותר את הליך בידוד פפטיד.
סוג החרוזים וסוג מאגר ההמלטה החומצי המשמשים להמלטת מתחמי MHC מהחרוזים ניתן לשנות גם לפתרון בעיות13,14,15,16,17,18,19. בהקשר זה, חרוזים המופעלים על ידי CNBr הם בדרך כלל נקודת התחלה טובה שכן הם זולים יחסית בנוסף להראות גמישות במונחים של כריכה עם סוגים שונים של נוגדנים. בפרוטוקול הנוכחי, חרוזים המופעלים על-ידי CNBr הוצגו כבעלי ביצועים טובים יחסית באמצעות חמישה נוגדנים שונים הזמינים מסחרית (כלומר, M1, Y3, W6/32, L243 ו- M5). מלבד חרוזי CNBr המופעלים על ידי sepharose, חלבון A או G או A / G sepharose 4 חרוזי זרימה מהירה קלים גם הם לטיפול, ולמרות שהם יקרים יחסית, יכולים לייצר תוצאות דומות. גורם נוסף שיש לקחת בחשבון הוא הזיקה של הנוגדן לחלבון A או G. יתר על כן, חרוזים מגנטיים sepharose הם גם קל מאוד לשימוש אבל הם יקרים יחסית. ללא תלות בסוג החרוזים שנבחרו על ידי אנשים שאינם מומחים, מומלץ לאסוף aliquots בשלבים קריטיים של הפרוטוקול ולבצע ג'ל SDS-PAGE מוכתם קומאסי כחול כדי לעקוב אחר היעילות המחייבת של הנוגדן לחרוזים, כפי שמוצג באיור 2.
גורם חשוב נוסף המשפיע על ההצלחה של בידוד פפטידים MHC מתייחס לסוג של חיץ ההמלטה החומצית המשמש לבודד את מתחמי MHC-פפטיד מהחרוזים. מאגרים שונים דווחו כולל 0.1%, 1% או 10% TFA, 0.2% FA ו 10% חומצה אצטית. 1% TFA היה חיץ ההמלטה עובד עבור כל הנוגדנים שנבדקו. ניתן לעקוב אחר שלב זה גם על ידי סופג מערבי כנגד מולקולות ה-MHC המשמשות ללכידת פפטידים של MHC, כפי שמוצג באיור 3.
כל המאגרים המכילים אצטוניטריל (ACN) ו/או חומצה משולשת (TFA) הם אגרסיביים ויכולים להוביל לזיהום המדגם בחומרים מולקולריים ופולימריים קטנים כגון פלסטיקאים אם במגע עם פלסטיק. כדי להימנע מבעיות כאלה, כל הפתרונות המכילים ממס אורגני ו/או TFA מוכנים טריים מדי יום ומאוחסנים בבקבוק זכוכית עד לשימוש. רוב השלבים מבוצעים בצינור פלסטיק חלבון LoBind. צינורות אלה תוכננו במיוחד עבור פרוטאומיקה ועשויים באיכות הגבוהה ביותר, פוליפרופילן בתולי ללא ביוצידים, plasticizers, ולטקס. הם מיוצרים גם עם תבניות ממוטבות ומלוטשות מאוד ללא שימוש בחומרי החלקה. אמצעי זהירות אלה חשובים לשקול כדי לאפשר את הדור של נתונים חיסוניים באיכות גבוהה.
הנוגדן הוא מגבלה חשובה לבידוד של פפטידים הקשורים ל- MHC. נוגדן W6/32 מאפשר בידוד של פפטידים המוצגים על ידי כל מולקולות HLA-ABC class I בבני אדם והוא הנוגדן הנפוץ והמבוסס ביותר בתחום. הקלדת HLA ברזולוציה גבוהה של קווי תאים אנושיים לא ממופים או biospecimens אינו הכרח על יישום של נוגדן W6/32, אבל בכל זאת מומלץ עבור יישומים מסוימים כדי להקל על פרשנות נתונים48. מידע הקלדה של HLA/MHC ניתן למצוא גם במשאבים ציבוריים עבור קווי תאים מרובים ומודלים של עכבר49. מלבד נוגדן W6/32, ארבעת הנוגדנים האחרים (M1, M5, Y3 ו- L243) שנבדקו ואומתו בהקשר של פרוטוקול זה זמינים כולם מסחרית. מצד שני, נוגדנים רבים אחרים שדווחו במחקרים חיסוניים קודמים לא אומצו במידה רבה על ידי הקהילה ואינם זמינים מסחרית או זמינים באמצעות התרבות של קווי תאים היברידיים, וזה יקר יחסית.
מגבלה חשובה נוספת לבידוד של פפטידים הקשורים ל- MHC היא כמות החומר ההתחלתי הנדרש. הכמות הנדרשת היא ביחס הפוך לרמת הביטוי של מולקולות MHC על פני התא, שניתן לכמת על ידי ציטומטריית זרימה (איור 4A). תאים המציגים רמות ביטוי גבוהות של מולקולות MHC (למשל, תאים דנדריטיים ותאים המטופויאטיים באופן כללי) מניבים בדרך כלל נתוני אימונופטידומיקה באיכות גבוהה. מעבדות מומחים להשתמש מ נמוך ככל 50 מיליון תאים50, אבל 100 מיליון עד 1 מיליארד תאים מומלצים עבור שאינם מומחים. שימוש בביופסיה של רקמות (<13 מ"ג)41, קסנוגרפט42,43, נתיחה שלאחר המוות44, ופלזמה45,46 דגימות דווחו גם הם, אך נותרו מאתגרים עבור מעבדות שאינן מומחים. כמו כן, המספר הכולל של פפטידים הקשורים ל- MHC הצפוי מתועד היטב עבור קווי תאים מבוססים (כאן, בין ~ 2000 ל - 10000 פפטידים בהתאם לקו התא ולנוגדנים המשמשים), אך הכמויות המוחלטות של פפטידים המוצגים באופן טבעי שנמשכים ביעילות על ידי הטכניקה נשארים שנויים במחלוקת. ואכן, מחקרים קודמים העריכו כי היעילות של הליך הבידוד תלויה פפטיד והוא יכול להיות נמוך ככל 0.5%-2%51. מגבלות אחרות במערכת החיסונית הן רבייה של השיטות וחוסר היכולת של כלי חבילת NetMHCpan להוסיף ביאור נכון לפפטידים לאללים MHC שפחות מאופיינים. בהקשר זה, פיתוח ויישום נוספים של שיטות MS רכישה עצמאיות יחסית לנתונים7,32,52, כמו גם קיבוץ פפטיד חדש ואלגוריתמי חיזוי מחייבים של פפטיד MHC31,34,53,54 צפויים לשפר את הרבייה ואת הדיוק של ביאור פפטיד באימונופטידומיקה. אימונופטידומיקה עומדת בפני מגבלות אחרות בנוגע לרכישת טרשת נפוצה וניתוח חישובי של פפטידים הקשורים ל- MHC ומכוסים במקומות אחרים 1,6,55.
While הבידוד של פפטידים הקשורים HLA-ABC מדגימות אנושיות באמצעות נוגדן W6/32 מבוסס היטב ומיושם באופן נרחב על ידי קבוצות מחקר רבות, הבידוד של עכבר MHC class I- ופפטידים הקשורים II הוא יחסית פחות מבוסס. לפיכך, פרוטוקולים חזקים לבידוד של ליגנדים MHC עכבר נדרשים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול ממוטב לבידוד של פפטידים מסוג MHC I ופפטידים מסוג MHC II משני קווי תאי עכבר ממקור C57BL/6 ו- BALB/ c, בהתאמה. באופן ספציפי, הפרוטוקול מאפשר בידוד של פפטידים הקשורים ל- H2Kb ו- H2Db הקשורים באמצעות נוגדן M1, כמו גם פפטידים מסוג H2-IAd ו- H2-IEd הקשורים באמצעות נוגדן M5. לכן, הפצה ויישום של הפרוטוקול הנוכחי צריך להקל על מחקר חיסוני בסיסי ותרגומי במודלים שונים של עכבר.
ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי להקים ולתקן זרימת עבודה של אימונופטידומיקה, וכן כדי לסמן פרוטוקולים חדשים. לדוגמה, זה יכול להיות מותאם ואופטימיזציה נוספת לבצע הקרנה חיסונית במטריצות ביולוגיות שונות החל דם / פלזמה לרקמה טרייה או קפואה ל- FFPE (פורמלין קבוע פרפין מוטבע). יתר על כן, הפרוטוקול יטפח את הרבייה התוך-מעבדתית והבין-מעבדתית של הליך הכנת הדגימה באימונונפפטידומיקה ולכן צפוי למצוא יישום רחב במחקר בסיסי וקליני.

במהלך העשור האחרון, העניין בחקירת הרפרטואר של פפטידים הקשורים ל- MHC חרג מהמגזר האקדמי והגיע לתעשיות הביוטכנולוגיה והתרופות. ואכן, בסרטן, גילוי של neoantigens ספציפי לגידולים מעשיים מייצג מוקד מחקר מרכזי במגזר התעשייתי לפתח אימונותרפיות קליניות המובילות לאונקולוגיה מותאמת אישית1,2,3. ביסודו של דבר, פפטידים הקשורים ל- MHC מוצגים בכל הגוף, משקפים את השלב התאי של התא, והם משמעותיים בתנאי מחלה שונים כגון אוטואימוניות, השתלה, מחלות זיהומיות, דלקת, סרטן ואלרגיות1,4. לכן, פפטידים הקשורים ל- MHC, או ליגנדים אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA) בבני אדם, הם בעלי עניין רפואי רב והם מכונים באופן קולקטיבי אימונופטידום5.
טרשת נפוצה היא גישה אנליטית רבת עוצמה לאפיון את האימונופטידום6,7, כולל גילוי של גידול ספציפי neoantigens8,9,10,11. זרימת עבודה טיפוסית לביצוע ניסוי חיסוני כוללת שלושה שלבים עיקריים: 1) הכנה מדגמית לבידוד פפטידים הקשורים ל- MHC, 2) רכישת נתונים על ידי MS ו- 3) ניתוח נתונים באמצעות כלי תוכנה חישוביים שונים12. יצירת דגימות באיכות גבוהה המתוארות בפרוטוקול חזותי זה היא קריטית להצלחתו של כל פרויקט באימונופפטידומיקה מבוססת MS. הפרוטוקול המתואר להלן מתמקד בבידוד פפטידים הקשורים ל- MHC class I ו- II מקווי תאים מבוססים היטב המתאימים ליצירת נתוני אימונופטידומיקה באיכות גבוהה. תוצאות מייצגות מקווי תא אלה מוצגות בפרוטוקול הנוכחי.

<table><tbody><tr><td>קו תאים A20</td><td>ATCC</td><td>TIB-208</td><td>עכבר B לימפובלסט</td></tr><tr><td>אצטוניטריל, LC/MS כיתה</td><td>FisherScientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנושי HLA A, B, C (W6/32) - MHC class I</td><td>BioXcell</td><td>BE0079</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אדם/קוף HLA-DR (L243) - MHC Class II</td><td>BioXcell</td><td>BE0308</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-עכבר H2 (M1/42.3.9.8) - MHC Class I</td><td>BioXcell</td><td>BE0077</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר H2-IAd/IEd (M5/114) - MHC class II</td><td>BioXcell</td><td>BE00108</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse H2Kb (Y3) - MHC class I</td><td>BioXcell</td><td>BE0172</td><td></td></tr><tr><td>BupH Phosphate Buffered Sasalt Packs (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>28372</td><td>תכולת שקית מומסת בנפח סופי של 500 מ"ל מים נטולי יונים (FisherScientific, W64)</td></tr><tr><td>CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1- פרופנסולפונט)</td> <td>EMDMilipore</td><td>220201-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose Cytivia המופעל על ידי CNBr</td><td></td> <td># 17-0430-01</td><td></td></tr><tr><td>קו תאים EL4</td><td>ATCC</td><td>TIB-39</td><td>עכבר T לימפובלסט</td></tr><tr><td>epTIPS טיפים לשימור, 1000 ומיקרו; L/Eppendorf</td><td>FisherScientific</td><td>02-717-352</td><td>תוצאות טובות יותר עם חומר שימור נמוך</td></tr><tr><td>epTIPS טיפים לשימור, 200 ומיקרו; L/Eppendorf</td><td>FisherScientific</td><td>02-717-351</td><td>תוצאות טובות יותר עם חומר שימור נמוך</td></tr><tr><td>חומצה פורמית, LC/MS</td><td>Grade FisherScientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>FisherScientific</td><td>RDCG0250500</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חומצה הידרוכלורית</td><td>FisherScientific</td><td>60-007-11</td><td></td></tr><tr><td>JY קו תאים</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>94022533-1VL</td><td>קו לימפובלסטואיד של תאי B אימורטליזציה של EBV</td></tr><tr><td>מתנול, LC/MS Grade</td><td>FisherScientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>עמודות כרומטוגרפיה פולי הכנה (עמודת פוליפרופילן)</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td>המכונה עמודת פוליפרופילן בפרוטוקול</td></tr><tr><td>מעכב פרוטאזות</td><td>ThermoFisher</td><td>A32963</td><td>1 גלולה לכל 10 מ"ל של מאגר ליזה תאים</td></tr><tr><td>Qifikit</td><td>Dako</td><td>K007811-8</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>אמרסקו</td> <td># 0865-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>FisherScientific</td><td>MSX04201</td><td></td></tr><tr><td>דיסק מיצוי פאזה מוצקה, עמודה אולטרה-מיקרוספין C18</td><td>קבוצת הקן</td><td>SEMSS18V</td><td>קיבולת של 6&ndash; 60 ומיקרו; גרם, נפח מקסימלי של 200 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית (TFA), LC-MS Grade</td><td>FisherScientific</td><td>PI85183</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>FisherScientific</td><td>T395-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>FisherScientific</td><td>#10812846001</td><td></td></tr><tr><td>Tube LoBind 1.5 מ"ל/Eppendorf</td><td>FisherScientific</td><td>E925000090</td><td>תוצאות טובות יותר עם חומר שמירה נמוך</td></tr><tr><td>צינור LoBind 2 מ"ל/אפנדורף</td><td>FisherScientific</td><td>13-698-795</td><td>תוצאות טובות יותר עם חומר שמירה נמוך</td></tr><tr><td>מים, LC/MS כיתה</td><td>FisherScientific</td><td>W64</td><td></td></tr></tbody></table>

אימונופטידומיקה: בידוד של עכבר ו- mhc אנושי class i- ופפטידים הקשורים ii לניתוח ספקטרומטריית מסה

Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis

אימונופטידומיקה היא תחום מתפתח המתדלק ומנחה את פיתוח החיסונים והאימונותרפיות. ליתר דיוק, הוא מתייחס למדע של חקירת הרכב הפפטידים המוצגים על ידי קומפלקס היסטו-תאימות גדול (MHC) מולקולות מדרגה I ומולקולות מדרגה II באמצעות פלטפורמות טכנולוגיות ספקטרומטריית מסה (MS). בין כל השלבים בזרימת עבודה חיסונית מבוססת MS, הכנה לדוגמה חשובה ביותר ללכידת נתונים באיכות גבוהה של רלוונטיות טיפולית. כאן, הוראות שלב אחר שלב מתוארות כדי לבודד MHC class I ופפטידים הקשורים II על ידי טיהור immunoaffinity מדגימות בקרת איכות, מעכבר (EL4 ו- A20) וקווי תאים אנושיים (JY) באופן ספציפי יותר. הריאגנטים השונים והנוגדנים הספציפיים מתוארים ביסודיות כדי לבודד פפטידים הקשורים ל- MHC מקווי תאים אלה, כולל השלבים לאימות היעילות מחייבת החרוזים של הנוגדנים ויעילות ההמלטה של מתחמי הפפטיד MHC-פפטיד מהחרוזים. ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי להקים ולתקן זרימת עבודה של אימונופטידומיקה, וכן כדי לסמן פרוטוקולים חדשים. יתר על כן, הפרוטוקול מהווה נקודת התחלה נהדרת עבור כל מי שאינו מומחה בנוסף לטפח את הרבייה התוך-מעבדתית של תהליך הכנת המדגם באימונופפטידומיקה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לטיהור של MHC class I ומתחמי פפטיד מדרגה II מקווי עכבר ותא אנושי המספקים נתוני אימונופטידומיקה באיכות גבוהה. הפרוטוקול מתמקד בהכנת דגימה באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית.

אימונופטידומיקה: בידוד של עכבר ו- MHC אנושי Class I- ופפטידים הקשורים II לניתוח ספקטרומטריית מסה

Immunopeptidomics is an emerging field that fuels and guides the development of vaccines and immunotherapies. More specifically, it refers to the science ...

פרוטוקול זה חשוב מכיוון שהוא פשוט לביצוע ובהישג יד של כל מעבדה. פרוטוקול זה מאפשר בידוד של HLA או MHC סוג I או פפטידים מסוג II מדגימות אדם או עכבר. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מדעיות הקשורות לכל תחומי המחקר הקשורים למערכת החיסון, בין אם בסרטן, וירולוגיה או מחלות אוטואימוניות.פרוטוקול זה נבנה כדי להיות נגיש לכל מי שעובד במעבדת מחקר. פשוט בצע את השלבים. התחל להפעיל את חרוזי ברומיד ציאנוגן Sepharose על ידי שקילה 80 מיליגרם לכל מדגם והעברתם לצינור חרוטי 15 מיליליטר.הוסף חמישה מיליליטר של חומצה הידרוכלורית מילימולרית. פיפטה למעלה ולמטה חמש פעמים כדי להקל על resuspension של החרוזים היבשים, ולאחר מכן למלא את הצינור החרוטי עם 8.5 מיליליטרים נוספים של חומצה הידרוכלורית מילימטר אחד. סובב את החרוזים במהירות של 20 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות התקן מסתובב.צנטריפוגה החרוזים ב 200x G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant על ידי שאיפה. הוסף 500 מיקרוליטרים של חיץ צימוד לפלטת החרוזים, ולאחר מכן העבר את מתלה החרוזים לצינור צנטריפוגה חדש של שני מיליליטר והניחו אותו בצד. לצימוד הנוגדנים לחרוזים אלה, הוסיפו שני מיליגרם של הנוגדן הנבחר בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של שני מיליליטר והרכיבו את הנפח למיליליטר אחד עם תמיסת חיץ צימוד כדי לקבל ריכוז סופי של שני מיליגרם למיליליטר.העבר את פתרון החרוזים שהוכן בעבר והוסף אותו לתמיסת הנוגדנים. לאחר מכן, לסובב את צינור microcentrifuge ב 20 סל"ד במשך 120 דקות באמצעות התקן סיבוב, צנטריפוגה החרוזים, ולאחר מכן להסיר את supernatant כפי שתואר קודם לכן. עכשיו להתחיל לחסום ולשטוף את החרוזים על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.2-טוחן גליצין לצינור microcentrifuge המכיל את החרוזים מצמידים נוגדנים, וסיבוב ב 20 סל"ד במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות מכשיר סיבוב.לאחר צנטריפוגה והסרה של supernatant, לשטוף את החרוזים עם PBS מיליליטר אחד, להסיר את supernatant על ידי צנטריפוגה, ולאחסן את החרוזים במיליליטר אחד של PBS בארבע מעלות צלזיוס עד השימוש. כדי לבודד פפטידים מסוג MHC I או II, הפשירו פלטה קפואה של 100 מיליון תאים על ידי חימום תחתית הצינור בכף היד. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של PBS ללוח הצבעים ופיפטה למעלה ולמטה עד שהמתלה יהיה הומוגני.העבר את ההשעיה בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של שני מיליליטר והוסף נפח שווה של מאגר תמוגה לתאים. סובב במהירות של 10 סל"ד למשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס באמצעות התקן סיבוב. צנטריפוגה lysate התא ב 18, 000x G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם בלם מלא, ולהעביר את supernatant בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש, שני מיליליטר.לשחזר את החרוזים מצמידים נוגדנים על ידי צנטריפוגה והסרת supernatant. לאחר מכן, להעביר את התא lysate supernatant לחרוזים מצמידים נוגדנים, ודגור ב 10 סל"ד במשך 14 עד 18 שעות לילה בארבע מעלות צלזיוס באמצעות מכשיר מסתובב. ביום השני, הסר את המכסה התחתון של עמודת הפוליפרופילן, הנח את העמודה על ארון העמודות פוליפרופילן, והתקן מיכל ריק מתחת כדי לאסוף זרימה דרך.עכשיו לשטוף את עמוד פוליפרופילן עם 10 מיליליטר של חוצץ A ולתת לו לנקז על ידי כוח המשיכה. אם מהירות הזרימה של ההמלטות הנוזלית איטית מדי, חתוך עוד יותר את הקצה התחתון של עמודת הפוליפרופילן. מודדים ואוספים את תערובת החרוזים/ליסט ומעבירים אותה לעמודת הפוליפרופילן.תן לתערובת הנוזלית לברוח על ידי כוח המשיכה. לחלופין, לאסוף ולהקפיא 20 microliters של aliquot עבור סופג מערבי. עכשיו לשטוף את החרוזים שנשמרו בעמודה פוליפרופילן על ידי הוספת 10 מיליליטר של חוצץ A ולתת לו לברוח על ידי כוח המשיכה.הסר עמוד פוליפרופילן מהמדף והנח אותו על גבי צינור מיקרוצנטריפוגה חדש, שני מיליליטר, מחזיק את העמוד ואת הצינור יחד עם היד. הוסף 300 מיקרוליטרים של 1%TFA לעמודת הפוליפרופילן וערבב את החרוזים על ידי צנרת למעלה ולמטה חמש פעמים. לאחר מכן, להעביר את ההמלטה בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש, שני מיליליטר.להתפלה וניצול של פפטידים MHC, הוסף 200 מיקרוליטרים של מתנול על גבי עמודת C-18 וצנטריפוגה ב 1, 546x G במשך שלוש דקות כדי להשליך את הזרימה דרך. הוסף 200 מיקרוליטרים של 80% אצטוויטריל ב- 0.1%TFA מעל העמודה C-18 ושוב צנטריפוגה כדי להשליך את הזרימה. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של 0.1%TFA, תוך ביטול הזרימה דרך צנטריפוגה.לבסוף, טען 200 מיקרוליטרים של מתחמי הפפטידים של MHC על גבי עמודת C-18, בטל את הזרימה באמצעות צנטריפוגה וחזור על הפעולה עד לטעינת הנפח המלא. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטרים של 0.1%TFA, צנטריפוגה כדי להשליך את הזרימה דרך, העבר את עמודת C-18 לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של שני מיליליטר, והתחמק מפפטידים MHC על ידי הוספת 150 מיקרוליטרים של 28% אצטוניטריל ב- 0.1%TFA. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את הזרימה דרך בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש, 1.5 מיליליטר.חזור על תהליך ההמלטה פעמיים עבור נפח כולל של 450 מיקרוליטרים, וקפאה במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לניתוח על ידי LC-MS-MS. השתמש פפטידים מטוהרים אלה לזיהוי של פפטידים מסוג MHC I ו- II בספקטרומטר מסה. היעילות המחייבת של חרוזים באה לידי ביטוי בירידה משמעותית בעוצמת כתמי האות של שרשראות קלות וכבדות כאשר החרוזים קשורים באופן קוולנטי לחרוזי CNBr, בהשוואה לנוגדן לפני הזיווג.הבידוד של מתחמי פפטיד MHC בעקבות התחמקות חומצית אושר על ידי אות הזיהוי החזק של מתחמי פפטיד MHC באמצעות נוגדן נגד HAL-ABC שרשרת כבדה. כמו כן, הוערך יכולת השכפול הפנים-אישית של התוצאות באמצעות הפרוטוקול הנוכחי. המקדם הממוצע של וריאציה עבור מספר הפפטידים שזוהו על פני שלושה העתקים ביולוגיים שונים היה קטן, אשר השתנה בין 1.9 ל 11%עם זאת, זהות הפפטידים השתנה במידה ניכרת, ואת שיעור הפפטידים זוהו רבייה על פני שלושה replicates ביולוגי נע בין 39% ל 63%, מפות החום שנוצרו הראו כוח מחייב MHC חזוי של הפפטידים מזוהים.עבור העכבר MHC class I ופפטידים מדרגה II, הקלסרים החזקים או החלשים היו 89 ו -87% בהתאמה. עבור פפטידים אנושיים מסוג HLA I ופפטידים מדרגה II, הקלסרים החזקים או החלשים היו 97 ו -70% בהתאמה. מוטיבים מחייבים פפטיד של העכבר ואנושי עבור LHC בכיתה I ופפטידים בכיתה II נוצרו גם.לפני האופטימיזציה של פרוטוקול זה, הבידוד של פפטידים מסוג MHC MHC ו- II היה די קשה. פרוטוקול ממוטב זה יאפשר בידוד של פפטידים מסוג MHC MHC ו- II ממודלים של עכבר ויוו, למשל, המשמשים באופן שגרתי לאימות מחקרים רבים ומגוונים הקשורים למחלות.

immunopeptidomics-isolation-mouse-human-mhc-class-i-ii-associated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

תקנים איזוטופ יציב ו ללכוד על ידי Anti-פפטיד נוגדנים (SISCAPA) זוגות להעשרת הזיקה של פפטידים עם איזוטופ יציב דילול ספקטרומטריית מסה (MRM-MS) כדי לספק מדידה כמותית של פפטידים כתחליפי עבור חלבונים, בהתאמה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות חלקיקים מגנטיים בפורמט אוטומטיות חלקית.

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בפפטיד: tetramers MHC וmicrobeads המגנטי לבודד אוכלוסיות בתדירות נמוכה של תאי T epitope ספציפיים ולנתח אותם על ידי cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת למחקר הישיר של אוכלוסיות תאי T אנדוגני עניין...

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לצלחות 384 גם הוא תאר. פורמט חסכוני זה צריך להיות שימושי בתחומי deimmunization חלבון ועיצוב חיסון ופיתוח.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

פרוטוקול עבור כימות חלבון בנוזלים ביולוגיים מורכבים באמצעות טכנולוגיית חיסונית אוטומטית-MALDI (iMALDI) מוצג.

פפטיד, חלבון כימות באמצעות כלים אוטומטיים חיסונית-MALDI (iMALDI)

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע polysome פרופיל על הלב העכבר perfused מבודדים. אנו מתארים שיטות הלב זלוף, polysome פרופיל של ניתוח של שברים polysome ביחס mRNAs miRNAs, את פרוטאום polysome.

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

סינתזות Lanthipeptide לזרז תגובות מרובות צעדים במהלך הביוסינתזה של מוצרים טבעיים פפטיד. כאן, אנו מתארים רציף, מלמטה למעלה, מימן-deuterium חילופי ספקטרומטריית מסה (HDX-MS) זרימת עבודה שניתן להפעיל כדי ללמוד את הדינמיקה הקונפורמטיבית של סינתטאז lanthipeptide, כמו גם אנזימים דומים אחרים המעורבים ביוסינתזה של מוצר טבעי פפטיד.

פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד

פרוטוקול זה מכסה ניתוח מפורט של הרכב פפטידוגליקן באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מיצוי תכונות מתקדם ותוכנת ניתוח ביואינפורמטיקה.

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי נרחב המווסת מסלולים ביולוגיים מרובים. ספקטרומטריית מסות היא הטכנולוגיה הטובה ביותר ליצירת פרופיל עולמי של R-מתיל-פרוטאום, כאשר היא משולבת לגישות ביוכימיות להעשרת פפטידים מותאמים. תהליך העבודה המיועד לזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה גלובלית של R בתאים אנושיים מתואר כאן.

גישה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לניתוח R-מתילציה של חלבונים גלובליים ובביטחון גבוה

מוצג פרוטוקול להעשרת חלבוני התא המאכסן (HCPs) ממוצרי תרופות (DP) ואיתור פפטידים באמצעות חרוזי העשרת פרוטאום. השיטה מודגמת באמצעות חומר תרופתי נוגדן חד-שבטי (mAb) (DS), שהוא חומר ייחוס מאופיין היטב להערכה והשוואה של שיטות שונות מבחינת ביצועים.

ניתוח חלבון התא המארח באמצעות חרוזי העשרה בשילוב עם עיכול מוגבל

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי אוכלוסיות נדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכברים באמצעות העשרת תאי T מבוססי חרוזים מגנטיים וטטרמרים מסוג peptide:major histocompatibility complex (MHC).

זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות

למדו לבודד פפטידים מקומפלקסי MHC מסוג I ו-II מקווי תאים של עכבר ואדם לניתוח ספקטרומטריית מסה. פרוטוקול זה פשוט לביצוע ונגיש לכל מעבדה מחקרית.

אימונופטידומיקה: בידוד של עכבר ו- MHC אנושי Class I- ופפטידים הקשורים II לניתוח ספקטרומטריית מסה

גלה סרטונים נוספים