שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

טכניקה זו אמינה ויעילה יותר ואינה דורשת תרגול או הכשרה נרחבים בהשוואה לטכניקות הנפוצות ביותר של מנגנון לנגנדורף. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מגבילה את הזמן האיסכמי מאז הזילוח הראשוני מתרחשת in vivo. בעת ביצוע טכניקה זו, זה חיוני כדי למנוע בועות בסעפת וכדי למנוע תנועה מוגזמת של הלב במהלך העיכול, אלה יכולים להקטין את התשואה.

תדגים טכניקה זו שרה סטורג'יל, סטודנטית לתואר שני במעבדתו של ד"ר מארק זיולו. התחל עם ניקוי סעפת הטמפרטורה מבוקרת באמצעות חיץ זילוח טרי שהוכן. לשם כך, הברג במחט 27 מד ונקה את הבועות באמצעות מחבר נעילת luer.

ודא שלא נותרו בועות. כדי לבודד את cardiomyocyte, לחשוף את עצם החזה של העכבר מורדם לחלוטין, לרוחב לקו האמצע, לחתוך בסמיכות דרך הצלעות אל בית השחי. ואז לחתוך דרך הסרעפת, הבטחת חתכים רדודים כדי למנוע את הלב.

מהדקים את עצם החזה עם hemostat ומקפלים את הצלעות לאחור כדי לחשוף את חלל בית החזה. הסר את קרום הלב מהלב בעדינות לפני חיתוך דרך הווריד קאווה התחתון מיד דיסטלי ללב. הזריקו שלושה מיליליטר של חיץ ניקוי קר כקרח לחדר הימני של הלב במשך דקה אחת באמצעות מחט 27 מד.

לאחר מכן, להחזיק את הלב באמצעות פינצטה. משכו אותו מהגוף וחשפו כמה שיותר מאבי העורקים. לאחר מכן מהדקים את אבי העורקים העולה באמצעות hemostat ו הבלו את הלב.

העבר במהירות את הלב המהודק למכסה של צלחת פטרי פוליפרופילן המכילה 10 מיליליטר של חיץ זילוח חם. הכניסו את הלב המהודק לפלטפורמה התומכת והזריקו 10 מיליליטר של חיץ זילוח מבוקר טמפרטורה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לחדר השמאלי במשך חמש דקות באמצעות מחט 27 מד מיוצבת המחוברת לסעפת. לאחר מכן, העבירו את הלב המהודק ואת המצע התומך לצלחת פטרי עם כחמישה מיליליטר של חיץ עיכול.

החלפת מזרקי קלט במזרק 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר חיץ עיכול. נקה את הסעפת של כל הבועות ואת חיץ הזילוח שנותר לפני ההזרקה. החלף בזהירות את המחט לאותו מיקום מחט בקודקוד החדר השמאלי.

בעזרת משאבת זילוח, הזריקו חיץ עיכול של 37 מעלות צלזיוס לחדר השמאלי למשך 15 דקות באמצעות מזרק 50 מיליליטר. שלוט בטמפרטורת התמיסה באמצעות מעיל מים המכויל לפלוט תמיסת 37 מעלות צלזיוס. מוציאים את החדרים מהאטריה לפני שמעבירים אותם לכוס של 10 מיליליטר.

מוסיפים שלושה מיליליטר של חיץ עיכול לכד וחותכים את החדרים לגושים גדולים בעזרת מספריים חדים. מכסים את הכד ברדיד אלומיניום ומניחים אותו באמבט מים מטלטל שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, משעים מחדש את גושי הרקמה בשלושה מיליליטר של חיץ העיכול ומטריאים אותו במשך כארבע דקות או עד לקבלת תערובת הומוגנית.

לאחר שתסיים, סנן את התאים לתוך צינור פוליפרופילן 50 מיליליטר באמצעות מסננת תאי ניילון 70 מיקרומטר. לשטוף מסננת תא ניילון עם שלושה מיליליטר של חיץ העיכול. מחזירים את התסנין לצינור פוליפרופילן תחתון עגול בקוטר 14 מיליליטר וצנטריפוגות אותו.

השליכו את הסופרנאטנט לפני שתשהו מחדש את הגלולה בשלושה מיליליטר של חיץ עצירה. לתרחיף התא, הוסף 54 מיקרוליטר של ציר סידן כלורי 100 מילימולרי כדי להפוך את ריכוז הסידן כלורי הסופי ל -1.8 מילימולר. תנו לתאים החיים להסתפק במשך 10 דקות והוציאו את הסופרנאטנט המכיל תאים מתים.

לאחר השעיה מחדש של הגלולה בתמיסת אחסון, התאים יכולים לשמש לניסויים פונקציונליים ותרביות. תמונות מיקרוסקופ ברייטפילד של תאים מבודדים הראו כי הבידוד של קרדיומיוציטים של עכברים יצר תאים שקטים בצורת מוט ללא כתמי קרום או קצוות מעוגלים. התאים הראו תפוקה של כ-80% ושיעורי הישרדות גבוהים שקבעו את הצלחת טכניקת הבידוד.

לבידוד מוצלח, חשוב ביותר להסיר את הבועות מהסעפת ולהחדיר את המחט לאותו חור בלב. לאחר הבידוד, הקרדיומיוציטים יכולים לשמש לניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים.