Name: שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: למד שיטה יעילה לבידוד קרדיומיוציטים מעכבר ללא צורך באימון מקיף. השיטה מבצעת פרפוזיה ראשונית בתוך הגוף כדי להקטין זמן איסכמיה ולשפר את התפוקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) ו- T32 HL134616 (Sturgill and Salyer).

כל ההליכים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אוהיו בהתאם להנחיות NIH.
1. הכנת פתרון
הערה: ראה טבלה 2 עבור ריכוזי חיץ.
<ol><li>טרום בידוד (עד שבועיים לפני בידוד מיוציטים)<ol><li>בסיס חיץ זילוח: הכינו 1 ליטר של בסיס חיץ זילוח (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES,גלוקוז ו-BDM) ב-1 ליטר של אולטרה-טהור 18.2 MΩ·cm H2O. התאימו ל-pH7.4 לפני סינון סטרילי של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד ליום הבידוד.</li>
		<li>חיץ ניקוי: יש להכין 1 ליטר של חיץ ניקוי (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES,Glucose, EDTA ו-BDM) ב-1 ליטר של אולטרה-טהור 18.2 MΩ·cm H2O. יש לכוונן ל-pH7.4 לפני סינון סטרילי של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד ליום הבידוד.</li>
		<li>100 מ"מ תמיסת מלאי CaCl 2: שוקלים 1.11 גרם CaCl 2 ומתמוססים ל-100 מ"ל של אולטרה-טהור 18.2 MΩ·cm H2 O. יש לאחסן בטמפרטורתהחדר עד ליום הבידוד.</li>
		<li>Liberase aliquots: להמיס 5 מ"ג של אנזימי עיכול ב 5 מ"ל של מים סטריליים, ללא RNase. להכין 0.8 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 ° C עד יום הבידוד.</li>
		<li>למינציה את הכלים: יש למרוח 100 μL של למינין עכבר 40 מיקרוגרם/מ"ל על צלחות פטרי סטריליות בעלות תחתית זכוכית של 30 מ"ל. אפשר לשבת במשך 30 דקות ולהסיר עודף למינין. מניחים את הלמינין על צלחת פטרי עם דגירה UV בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד ליום הבידוד (ניתן להשתמש בצלחות פטרי למינציה עד שבועיים).</li>
		<li>מדיית DMEM: בארון בטיחות ביולוגית, הוסף 2.5 מ"ל של FBS, 0.5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין (50 U/mL-50 מיקרוגרם) ו-1 מ"ל של 500 mM BDM עד 46 מ"ל של DMEM. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד ליום הבידוד (ניתן להשתמש במדיה עד שבועיים).</li>
		<li>חומרי הדפסה M199: יש להכין 1 ליטר של חומרי הדפסה M199 (NaHCO3, HEPES, L-גלוטתיון, M199, BDM ו-BSA) ב-1 ליטר של חומר אחסון אולטרה-טהור 18.2 MΩ·cm H2O. יש לכוונן ל-pH 7.4 לפני סינון סטרילי (מסנן 0.22 מיקרומטר). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד ליום הבידוד.</li>
		<li>500 מ"מ מלאי BDM: יש להוסיף 0.5 גרם BDM ל-10 מ"ל של אולטרה-טהור 18.2 MΩ·cm H2O. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד ליום הבידוד.</li>
		<li>יצירת פלטפורמה מייצבת: בצק משחק עובש סביב בסיס המחט המוברגת לסטופקוק Luer. עובש לצלחת הפטרי שיכיל את הלב ויבטיח שהמחט תהיה בגובה המתאים להזרקת החדר (~5 מ"מ מעל תחתית המנה).</li>
	</ol></li>
	<li>יום הבידוד<ol><li>חיץ זילוח: ביום הבידוד, יש להוסיף 9.5 מ"ג של MgCl2 עד 100 מ"ל של בסיס חיץ זילוח. מניחים לערבב לחלוטין לפני הסרת 30 מ"ל של חיץ זילוח שהושלם ומניחים בבקבוק זכוכית נקי, רחב פה, 100 מ"ל עם מכסה מכסה בורג (חיץ עיכול). הערה: ניתן לבצע תוספות אלה ביום הבידוד ללא התאמות pH נוספות מכיוון שהוספתן משנה את ה- pH באופן זניח.<ol><li>הסר 12 מ"ל של מאגר זילוח והגדר בצד (מאגר עצירה). יוצקים את 58 מ"ל הנותרים של חיץ זילוח לתוך בקבוק זכוכית נקי, רחב פה, 100 מ"ל עם מכסה בורג. אחסנו את מאגר הזילוח הנותר בטמפרטורה של 37°C במהלך הבידוד.</li>
		</ol></li>
		<li>חיץ עיכול: הוסף 7.5 μL של 100 mM CaCl2 עד 30 מ"ל של חיץ זילוח לקבלת ריכוז סופי של 25 μM. מיד לפני הבידוד, הוסף 770 μL של Liberase למאגר העיכול לקבלת ריכוז סופי של 26 מיקרוגרם / מ"ל.</li>
		<li>מאגר עצירה: יש להמיס 240 מ"ג BSA ב-12 מ"ל של מאגר זילוח. יש לאחסן בטמפרטורה של 37°C במהלך הבידוד.</li>
		<li>חיץ ניקוי: מכינים מזרק 3 מ"ל של חיץ ניקוי ומנקים את המחט מבועות. יש לאחסן על קרח עד לבידוד.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנת סעפת
<ol><li>נקה את הסעפת מבוקרת הטמפרטורה עם חיץ זילוח טרי, תוך הקפדה על כך שלא יישארו בועות. באמצעות מחבר נעילת Luer, להבריג במחט 27 G, ולנקות מבועות. סעפת מפונה חיונית לבידוד מוצלח.</li>
</ol>3. הכנת בעלי חיים
<ol><li>יש להזריק לעכבר תוך צפקית 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-20 מ"ג/ק"ג קסילזין לפי משקל גוף מיד לפני הבידוד. הליך זה השתמש בעכבר C57Bl/6 זכר בן 4 חודשים.</li>
	<li>במידת הצורך, הניחו את העכבר על כרית כירורגית מחוממת כדי לעודד טשטוש. אוהלו את זרועות העכבר, והדביקו את הגפיים ואת בסיס הזנב לחיתול מעבדה כחול. ודא כי החיה מורדמת לחלוטין על ידי נסיגה של רפלקס צביטת הבוהן. יש למרוח וילון סטרילי סביב אזור הניתוח.</li>
</ol>4. הליך בידוד קרדיומיוציטים
<ol><li>לחשוף את עצם החזה של העכבר, לרוחב לקו האמצע, לחתוך בסמיכות דרך הצלעות אל בית השחי. חתכו בעדינות את הסרעפת במלואה, והקפידו על חתכים רדודים כדי למנוע את הלב. מהדקים את עצם החזה עם hemostat ומקפלים את הצלעות לאחור כדי לחשוף את חלל בית החזה.</li>
	<li>בעדינות להסיר את קרום הלב מן הלב לחתוך במלואו דרך נבוב הווריד הנחות, מיד דיסטלי ללב. השתמש מזרק 3 מ"ל עם מחט 27 G כדי להזריק במהירות 3 מ"ל של חיץ ניקוי קר כקרח לחדר הימני של הלב במשך 1 דקות.</li>
	<li>החזיקו בעדינות את הלב באמצעות פינצטה והתרחקו מהגוף, חושפים כמה שיותר מאבי העורקים. באמצעות hemostat, להדק את אבי העורקים העולה, נזהר לא להדק את אטריה, ואת הבלו את הלב מן החזה.</li>
	<li>להעביר במהירות את הלב המהודק למכסה של צלחת פטרי פוליפרופילן עם כ 10 מ"ל של חיץ זילוח חם. הניחו את הלב המהודק לתוך הפלטפורמה התומכת והשתמשו במחט 27 G מיוצבת המחוברת לסעפת כדי להזריק 10 מ"ל של חיץ זילוח מבוקר טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לחדר השמאלי במשך 5 דקות.</li>
	<li>מעבירים את הלב המהודק ואת המצע התומך לצלחת פטרי עם כ-5 מ"ל של חיץ עיכול. החלפת מזרקי קלט עבור מזרק 50 מ"ל עם 25 מ"ל של חיץ העיכול.</li>
	<li>נקה את הסעפת של כל הבועות ואת חיץ הזילוח שנותר לפני ההזרקה. החלף בזהירות את המחט לאותו מיקום מחט בקודקוד החדר השמאלי.</li>
	<li>השתמש במשאבת זילוח כדי להזריק חיץ עיכול מבוקר טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לחדר השמאלי למשך 15 דקות באמצעות מזרק 50 מ"ל. שלוט בטמפרטורת התמיסה באמצעות מעיל מים שכויל בעבר להוצאת תמיסה של 37 מעלות צלזיוס בקצה המחט.</li>
	<li>מוציאים את החדרים מהאטריה ומעבירים לכוס של 10 מ"ל. מוסיפים 3 מ"ל של חיץ עיכול לכוס ובעזרת מספריים חדים חותכים את החדרים לחתיכות גדולות. מכסים את הכד ברדיד אלומיניום ומניחים באמבט מים רועד שחומם מראש ל-37°C למשך 5 דקות.</li>
	<li>השליכו את הסופרנטנט, תוך זהירות להימנע מהסרת גושי רקמה. להשהות מחדש את גושי הרקמה ב 3 מ"ל של חיץ העיכול triturate במשך כ 4 דקות או עד תערובת הומוגנית מושגת.</li>
	<li>סנן את התאים דרך מסננת תאי ניילון 70 מיקרומטר לתוך צינור פוליפרופילן 50 מ"ל.</li>
	<li>החזירו את התסנין לצינור פוליפרופילן עגול בנפח 14 מ"ל וצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-100 סל"ד. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-3 מ"ל של חיץ עצירה.</li>
	<li>הוסף 54 μL של 100 mM מלאי CaCl 2 לתאים המרחפים לקבלת ריכוז CaCl2 סופי של 1.8 mM. שלב זה יכול להתבצע גם בהדרגה כדי להגדיל את תפוקת התא.</li>
	<li>אפשרו לתאים חיים להתיישב על ידי כוח הכבידה במשך 10 דקות לפני שתסירו את הסופרנאטנט המכיל תאים מתים. השהה מחדש את הגלולה בתמיסת אחסון (פתרון זילוח עם 200 מיקרומטר CaCl2). תאים אלה יכולים לשמש כיום לניסויים פונקציונליים (כלומר, הדמיה/התכווצות סידן, מהדק טלאי וכו'), תרבית וכו'. הערה: התאים עשויים גם להיות מושהים מחדש בתמיסות תלויות מעבדה או ניסוי.</li>
</ol>5. תרבית תאים
<ol><li>ספור את התאים באמצעות המוציטומטר או לפי ספירת תצוגות שדה באמצעות החלקת כיסוי מרושתת. מכיוון שמיוציטים גדולים מאוד, ספירה באמצעות המוציטומטר אינה תמיד מדויקת. זה משמש כדי לקבל מושג על כמה תאים בקירוב התקבלו מהבידוד.</li>
	<li>לדלל את התאים ל~ 25,000 תאים / מ"ל עם מדיה DMEM. הוסף 1 מ"ל של תמיסת תאים לכל באר.</li>
	<li>יש לדגור ב-37°C, 95% O 2, 5% CO2 למשך שעתיים.</li>
	<li>שאפו בעדינות מדיית DMEM מכל באר והוסיפו 2 מ"ל של מדיה M199.</li>
	<li>יש לדגור ב-37°C, 95% O 2, 5% CO2 למשך עד 24 שעות.</li>
</ol>

<ol><li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li>
<li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li>
<li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca%282%2B%29+handling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005(2012).</li>
<li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23%2F24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca%282%2B%29+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li>
<li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li>
<li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12%2C13-diHOME+to+mediate+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li>
<li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+increased+systolic+Ca2%2B+and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2%2B+transient+kinetics+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li>
<li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+3%27-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li>
<li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXL-1020%2C+a+novel+nitroxyl+%28HNO%29+prodrug%2C+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic%3A+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894(2017).</li>
<li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research%3A+advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li>
<li>Harary, I., Farley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+single+isolated+beating+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of single isolated beating heart cells.</a> Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).</li>
<li>Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+collagenases+and+other+proteolytic+enzymes+in+the+dispersal+of+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues.</a> Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).</li>
<li>Baker, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+apparatus+for+mammalian+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An improved apparatus for mammalian heart perfusion.</a> The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).</li>
<li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).</li>
<li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation%3A+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+procedure+for+isolating+adult+mouse+cardiomyocytes+for+epicardial+activation+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).</li>
<li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605(2016).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li>
<li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22AIP+Conference+Proceedings%22%5BJournal%5D)">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140(2019).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688(2018).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866(2021).</li>
<li>Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+preparation+of+Ca2%2B+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers.</a> Methods in Cell Biology. 99, 126(1994).</li>
<li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li>
<li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li>
<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li>
</ol>

אין ניגודי עניינים לחשוף.

היתרון העיקרי של טכניקת בידוד קרדיומיוציטים ללא לנגנדורף שלנו הוא שהיא מגבילה את זמן ההיפוקסיה והאיסכמי בכך שאינה דורשת קנולציה למכשיר לנגנדורף. לחילופין, בדומה לטכניקות לנגנדורף הקלאסיות שלוקח מספר דקות להסיר, לנקות ולתלות את הלב, מה שגורם לעיתים קרובות לנזק איסכמי למיוציטים, השיטה שלנו כוללת ניקוי דם in vivo באמצעות תמיסת ניקוי קר כקרח. חיץ הניקוי הקר כקרח מכיל חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA), תצבית קטיונים דו-ערכיים באופן בלתי הפיך כדי להסיר סידן ביעילות, מה שהופך אותו לנוגד קרישה מצוין, ולכן מפסי...

במשך עשרות שנים, רעיון חיוני בספרות הביולוגיה של הלב הוא מנגנון הפעולה המולקולרי. יש להקים מנגנון פעולה על מנת לפרסם מחקרים מהימנים. אסטרטגיה מבוססת היטב לקביעת מנגנון מולקולרי היא מחקרי קרדיומיוציטים מבודדים, הדורשים קרדיומיוציטים באיכות גבוהה להשגת נתונים אמינים. ניסויים תאיים ומולקולריים המבוצעים על קרדיומיוציטים לקביעת מנגנון פעולה הם תקן הזהב לחקר התכווצות1, אלקטרופיזיולוגיה2, סידן (Ca 2+) מחזור3, מיופילמנט Ca2+ רגישות4, שלד ציטו-שלד5, מטבוליזם6, השפעות הורמונים7, מולקולות איתות8, מחקרי תרופות9 וכו. העכבר הפך למין המועדף על רוב הניסויים בביולוגיה של הלב בשל קלות המניפולציה הגנטית, גודלו הקטן, תוחלת החיים הקצרה יחסית שלו, עלותו הנמוכה וכו '10. עם זאת, בידוד אמין של קרדיומיוציטים עכבר באיכות גבוהה אינו טריוויאלי עם הטכניקות הנוכחיות.
מעבדות מבודדות קרדיומיוציטים כבר כמעט 70 שנה11. כמעט כל הטכניקות לבידוד קרדיומיוציטים מסתמכות על עיכול הלב באמצעות אנזימים שונים (קולגנאז, פרוטאז, טריפסין וכו '). בתקופות המוקדמות (שנות ה-50 עד שנות ה-60) נעשה שימוש בשיטת הגוש, שכללה הוצאת הלב, חיתוך לחתיכות קטנות בהרבה ודגירת תמיסה עם קולגנאז/פרוטאז/טריפסין12. בשנות ה-70 יישמו המעבדות את שיטת "לנגנדורף"13, שבודדה קרדיומיוציטים באמצעות טכניקת בידוד מבוססת זילוח של העורקים הכליליים (זילוח מדרדר עם אנזים באמצעות מנגנון לנגנדורף); טכניקה זו נותרה השיטה השלטת לבידוד מיוציטים בתחום כיום, ~50 שנה מאוחר יותר14,15,16. העבודה האחרונה עברה לשימורי הלב in vivo כדי להגביל את זמן ההיפוקסיה ואת הנזק האיסכמי וכתוצאה מכך בידודי קרדיומיוציטים מעולים (יבולים טובים יותר ואיכות גבוהה יותר)17. לאחרונה, זה התפתח לביצוע in vivo, זילוח לב ללא לנגנדורף 18,19,20,21,22. פיתחנו את טכניקת בידוד קרדיומיוציטים ללא לנגנדורף המבוססת על טכניקת Ackers-Johnson et al.18 והתאמנו רכיבים שונים מטכניקות בידוד קודמות רבות. התאמות מפתח אלה כוללות הזרקה של חיץ ניקוי קר כקרח ושילוב של פלטפורמה תומכת כדי לייצב את המחט, המאפשר מניפולציה מופחתת של הלב. כמו כן מפורט בטכניקה זו בקרת טמפרטורה של חוצצים מוזרקים (37 מעלות צלזיוס), אשר הפחית את הזמן בין הזרקת in vivo לעיכול עקב פחות זילוח EDTA כפי שפורסם בעבר18. על ידי הפחתת מניפולציה של הלב ולכן מזעור גודל אתר לנקב, זילוח יסודי ומתמיד של העורקים הכליליים מתקבל. כמו כן, שיפרנו את הטכניקה עם עיכול בשיטת נתח משני, כמות ה-EDTA במאגר הניקוי המוזרק, ושינינו את רמת החומציות. הטכניקה המתוארת שלנו אמינה יותר, יעילה יותר, ואינה דורשת הכשרה/תרגול נרחב בהשוואה לשימוש במכשיר לנגנדורף (טבלה 1).

<table><tbody><tr><td>10 סמ"ק Bd Luer-Lok מזרק</td><td>פישר מדע</td><td>14-827-52</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיירקס בצורה נמוכה</td><td>קול-פאלמר</td><td>UX-34502-01</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"ל כובע פוליפרופילן בקבוק אחסון מדיה מזכוכית</td><td>DWK מדעי החיים</td><td>UX-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>14 מ"ל מבחנות פוליפרופילן עגולות תחתונות עם כובע</td><td>פישר מדע</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>2,3-בוטנדיון מונוקסימה</td><td>Sigma</td><td>B0753</td><td>>98%</td></tr><tr><td>3 סמ"ק BD מזרק Luer-Lok Fisher</td><td>Sci</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ כלי תחתית זכוכית</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל מזרק BD ללא מחט</td><td>Fisher Sci</td><td>13-689-8</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-22999-84</td><td></td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS כרית חימום ג'ל חלל</td><td>פישר מדע</td><td>14-370-223</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 27 גרם x 1/2 אינץ' מחטים היפודרמיות</td><td>בקטון דיקינסון</td><td></td> סרום בקר 305109 <td></td></tr><tr><td>אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>A3803</td><td>מקטע הלם חום, אבקה ליופילית, למעשה ללא חומצות שומן, >98%</td></tr> <tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>סיגמא</td><td>C7902</td><td>>99%</td></tr> <tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G7021</td><td>מתאים לתרבית תאים, >99.5%</td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>Fisher Sci</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Sci</td><td>AAA1071336</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 מ"מ צלחת תרבית תאים מטופלת TC</td><td>353003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>R& D Systems (Bio-techne)</td> <td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulatators</td><td>Fisher Sci</td><td>13-874-432</td><td></td></tr><tr><td>Hartman Mosquito Hemostatic Corpps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15921</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set</td><td>Fisher Sci</td><td>02-671-11</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>>99.5%</td></tr><tr><td>סרט תיוג</td><td>פישר מדע</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>Legato 100 משאבת מזרק</td><td>kdScientific</td><td>788100</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטתיון</td><td>פישר מדע</td><td>ICN19467980</td><td></td></tr><tr><td>ליבראז TH כיתה מחקר</td><td>סיגמא</td><td>5401135001</td><td>ריכוז תרמוליזין גבוה</td></tr><tr><td>M199</td><td>פישר מדע</td><td>MT10060CV</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>עכבר למינין</td><td>קורנינג</td><td>354232</td><td></td></tr><tr><td>עט / סטרפטוקוק</td><td>פישר מדע</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>P5405</td><td>>99%</td></tr> <tr><td>אמבט מים הדדי דיגיטלי מדויק</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSCIR19</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא</td><td>S5761</td><td>מתאים לתא תרבית</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>S5886</td><td>>99%</td></tr> <tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא</td><td>S5011</td><td>>99%</td></tr> <tr><td>מסננת תאים סטרילית 70 ומיקרו; m</td><td>פישר מדע</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים לסטודנטים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>VWR רפידות תחתונות סופגות</td><td>פישר מדע</td><td>NC9481815</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

הצורך בשיטות ניתנות לשחזור אך פשוטות מבחינה טכנית המניבות קרדיומיוציטים באיכות גבוהה חיוני למחקר בביולוגיה של הלב. ניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים (למשל, התכווצות, אלקטרופיזיולוגיה, מחזור סידן וכו ') על קרדיומיוציטים הם תקן הזהב לביסוס מנגנונים של מחלות. העכבר הוא המין המועדף לניסויים פונקציונליים והטכניקה המתוארת היא במיוחד לבידוד קרדיומיוציטים של עכבר. שיטות קודמות הדורשות מכשיר לנגנדורף דורשות רמות גבוהות של אימון ודיוק עבור קנולציה אבי העורקים, לעתים קרובות לגרום איסכמיה. התחום עובר לשיטות בידוד נטולות לנגנדורף שהן פשוטות, ניתנות לשכפול ומניבות מיוציטים בני קיימא לרכישת נתונים פיזיולוגיים ולתרבית. שיטות אלה מפחיתות מאוד את זמן האיסכמיה בהשוואה לקנולציה של אבי העורקים וגורמות לקרדיומיוציטים המתקבלים באופן אמין. ההתאמה שלנו לשיטה נטולת לנגנדורף כוללת זילוח ראשוני עם תמיסת ניקוי קרה כקרח, שימוש בפלטפורמה מייצבת המבטיחה מחט יציבה במהלך הזילוח, ושלבי עיכול נוספים כדי להבטיח קרדיומיוציטים המתקבלים באופן אמין לשימוש במדידות תפקודיות ובתרבית. שיטה זו פשוטה ומהירה לביצוע ודורשת מיומנות טכנית מועטה.

ישנם מספר אלמנטים שיש לבחון בעת קביעת הצלחת הבידוד. ראשית, הקרדיומיוציטים חייבים להיות בצורת מוט ללא כתמים בממברנה, כמו התאים שבודדו באיור 1. בידוד טיפוסי יניב ~80% מהמיוציטים בצורת מוט. אם הבידוד מניב משהו פחות מ 50% תאים בצורת מוט, אז זה נחשב בידוד לא מוצלח קרדיומיוציטים אינם בשימוש. לבסוף, cardiomyocytes צריך להיות שקט. מיוציטים המתכווצים באופן ספונטני מפגינים אי סבילות ל- Ca2+ וייצרו נתונים לא אמינים. מכל הבידודים המבוצעים בטכניקה הנ"ל, כמעט כל הבידודים נחשבים מוצלחים. קרדיומיוציטים בתרב...

תקן הזהב בקרדיולוגיה לניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים הוא קרדיומיוציטים. מאמר זה מתאר התאמות לטכניקה שאינה לנגנדורף לבידוד קרדיומיוציטים של עכברים.

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

טכניקה זו אמינה ויעילה יותר ואינה דורשת תרגול או הכשרה נרחבים בהשוואה לטכניקות הנפוצות ביותר של מנגנון לנגנדורף. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מגבילה את הזמן האיסכמי מאז הזילוח הראשוני מתרחשת in vivo. בעת ביצוע טכניקה זו, זה חיוני כדי למנוע בועות בסעפת וכדי למנוע תנועה מוגזמת של הלב במהלך העיכול, אלה יכולים להקטין את התשואה.תדגים טכניקה זו שרה סטורג'יל, סטודנטית לתואר שני במעבדתו של ד"ר מארק זיולו. התחל עם ניקוי סעפת הטמפרטורה מבוקרת באמצעות חיץ זילוח טרי שהוכן. לשם כך, הברג במחט 27 מד ונקה את הבועות באמצעות מחבר נעילת luer.ודא שלא נותרו בועות. כדי לבודד את cardiomyocyte, לחשוף את עצם החזה של העכבר מורדם לחלוטין, לרוחב לקו האמצע, לחתוך בסמיכות דרך הצלעות אל בית השחי. ואז לחתוך דרך הסרעפת, הבטחת חתכים רדודים כדי למנוע את הלב.מהדקים את עצם החזה עם hemostat ומקפלים את הצלעות לאחור כדי לחשוף את חלל בית החזה. הסר את קרום הלב מהלב בעדינות לפני חיתוך דרך הווריד קאווה התחתון מיד דיסטלי ללב. הזריקו שלושה מיליליטר של חיץ ניקוי קר כקרח לחדר הימני של הלב במשך דקה אחת באמצעות מחט 27 מד.לאחר מכן, להחזיק את הלב באמצעות פינצטה. משכו אותו מהגוף וחשפו כמה שיותר מאבי העורקים. לאחר מכן מהדקים את אבי העורקים העולה באמצעות hemostat ו הבלו את הלב.העבר במהירות את הלב המהודק למכסה של צלחת פטרי פוליפר

a-simple-effective-method-to-consistently-isolate-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

תרבויות cardiomyocyte העכבר ראשיים הן אחד הכלים המרכזיים לחקירה של ארגון ותפקוד myofibrillar. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עיקרי מלב עכבר בילוד. תרבויות cardiomyocyte וכתוצאה מכך עשויות לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני ביומכנית, ביוכימי ותא ביולוגי.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

כאן אנו מתארים את הבידוד של cardiomyoctyes עכבר המבוגר באמצעות מערכת זלוף Langendorff. תאים וכתוצאה מכך הם Ca2 +, סובלניים, חשמלי שקט ויכולים להיות מתורבת וtransfected עם אדנו או lentiviruses כדי לתפעל ביטוי גנים. הפונקציונליות שלהם יכולה גם להיות מנותחת באמצעות מערכת MMSYS וטכניקות תיקון מהדק.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של שריר לב עכבר בוגר. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית לתרבות של שריר לב בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב לבידוד הניתן לשחזור ותרבית ארוכת טווח של קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים עם תפוקה, טוהר וכדאיות גבוהים.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

הפרוטוקול הזה משמש כדי לבודד פרפור לב בודד מהלב של העכבר המבוגר באמצעות הגישה העיכול קטע. גישה זו משמשת כדי לבודד את הפרפור הימני או השמאלי, שניתן להשתמש בו כדי לאפיין את פרפור מיציט אלקטרופיזיולוגיה במחקרים הדבקת מהדק.

בידוד של פרפור מיוציטים מעכברים למבוגרים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד, טרנס-תירטוי ותרבות ארוכת טווח של עכבר בוגר וקרדיומיוציטים של חולדות.

בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

פרוטוקול זה מתאר שינויים בשיטת לנגנדורף כולל עומק שינון אבי העורקים לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרזדורים חדריים מעכברים בוגרים.

שינויים בשיטת לנגנדורף לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרשים בוגרים

למד שיטה יעילה לבידוד קרדיומיוציטים מעכבר ללא צורך באימון מקיף. השיטה מבצעת פרפוזיה ראשונית בתוך הגוף כדי להקטין זמן איסכמיה ולשפר את התפוקה.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

גלה סרטונים נוספים