שיפור רבייה כדי לענות על מידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות 2018 הנחיות בניתוח מעקב חלקיקים

פרוטוקול זה פותח עבור מפעילי טירון של NanoSight LM10. על ידי ביצוע ההוראות שלב אחר שלב, ניתן להשיג תוצאות מדויקות וניתנות לשחזור. טכניקה זו מסייעת להבטיח תוצאות עקביות במהלך ריצות ניסיון מרובות ללא קשר לרמת המיומנות של המשתמש.

אפיון ננו-חלקיקים, במיוחד כימות, ממשיך להיות אתגר בתחום המחקר השלפוחית החוץ-תאית. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח עקבי של גודל וריכוז של חלקיקים בהשעיה. התחל על ידי ניקוי משטחי הזכוכית של מודול הלייזר עם מנקה עדשות באיכות טובה ונייר עדשה.

לפני הרכבת המודול, ודא כי חותם O-טבעת יושב כראוי בחריץ של כיסוי תא הזרימה. לאחר מכן מניחים את כיסוי תא הזרימה על מודול הלייזר, ומבטיחים כי מגעים חשמליים נמצאים בכיוון הנכון. לאחר מכן, מניחים את ארבעת ברגי האגודל הטעונים בקפיץ דרך לוחית תא הזרימה ומפעילים את החוטים של מודול הלייזר מבלי להידוק בנפרד.

תוך כדי הפעלת לחץ אחיד על כיסוי תא הזרימה, הדקו באופן אחיד את ברגי האגודל בצורה אלכסונית לסירוגין עד לקירור. לשטוף שני מזרקי שחפת מיליליטר עם מתאמי מנעול להחליק שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של DPBS. הסר והשלך את הבוכנה ממזרק השחפת הראשון לפני החדרת המזרק ליציאה הנותרת כדי לשמש כמאגר דילול או מדגם.

לאחר מכן מלא את המזרק השני במיליליטר אחד של DPBS וצרף אותו ליציאת הכניסה של כיסוי תא הזרימה. החזק את מודול הלייזר מוטה עם יציאת מזרק השקע מורמת כדי לאפשר לאוויר להיות מטוהר מהתא כמו DPBS מוזרק לאט לתוך מודול הלייזר. לשטוף את DPBS הנותרים ממודול הלייזר על ידי הזרקת מיליליטר אחד של אוויר לתוך היציאה הנכנסת.

חזור על השטיפה פעמיים. לאחר הסומק האחרון, רוקנו את מודול הלייזר לחלוטין ככל האפשר וטענו את המודול למיקוד ולמיקום. פתח את התוכנה.

תחת כרטיסיית הלכידה בתיבה הימנית העליונה, לחץ על התחל מצלמה. אם המצלמה נכבית באופן אוטומטי לאחר חמש דקות, לחץ על הפעל את המצלמה כדי להפעיל אותה מחדש. באותה כרטיסיה, התאם את רמת המצלמה ל- 14 עד 16 כדי להבהיר את קו הלייזר ולפשט את זיהוי החלקיקים ואת המיקוד.

על-ידי הזזת המחוון העליון בצד שמאל של החלק השמאלי של הראש פנימה או החוצה, הסט את התמונה מהמצלמה אל העפעפיים. בשדה הראייה, מצא את האזור של צפיפות מוגברת, המכונה טביעת האצבע והמרכז, ולמקד את טביעת האצבע אנכית. בשדה הראייה, מרכז את קו הלייזר ולאחר מכן הזז את המחוון העליון כדי להסיט את האור למצלמה כפי שנצפה על מסך המחשב.

התמונה על מסך המחשב היא תמונת מראה מהתצוגה בעפעפי המיקרוסקופ. התאם את המוקד כדי לחדד את התמונה של חלקיקים נעים בודדים על המסך באמצעות ידית המיקוד. כדי לטעון את הדגימות, לצייר מיליליטר אחד של המדגם לתוך מזרק שחפת מיליליטר שטוף ולחבר את המזרק ליציאת הכניסה של כיסוי תא הזרימה.

ממשיכים לקדם את הבוכנה עד שהנוזל ניכר במזרק הפתוח המחובר ליציאת השקע. המודול צריך להיות מוטה כדי לאפשר לאוויר להיות מטוהר ממודול הלייזר. בתצוגת המצלמה, העבר את המוקד מימין לקו הלייזר לאזור של מספר אחיד של חלקיקים.

התאם את הכיוון האנכי כדי למרכז את רצועות האור האופקיות ולמקד מחדש עד שהמספר הגבוה ביותר של חלקיקים יהיה בתצוגה. ודא לשמור על המיקום של המוקד עקבי עבור כל האמצעים הבאים. התאם את רמת המצלמה לנקודה שבה סמל המידע הכהה מהבהב לסירוגין לסירוגין בפינה השמאלית העליונה של תצוגת המצלמה.

לניתוח מעקב אחר חלקיקים, או NTA, הגדר את משך הזמן ל-30 או 60 שניות ואת מספר הסרטונים לחמש. כדי לשנות את שם קובץ הבסיס הקיים, לחץ על הכרטיסיה עבור אתר אחסון חדש עבור נתונים שנוצרו עם שם קובץ חדש. לאחר מכן בדוק את תיבת טמפרטורת היעד כדי להזין את הטמפרטורה הרצויה ולחץ על צור סקריפט כדי לעשות שימוש חוזר במדידה הרגילה.

לאחר טעינת הדגימה והניסוי מוכן להפעלה, לחץ על צור והפעל קובץ Script. במסך המוקפץ של פרטי הדוח המוגדר, מלא את השדות במידע הדרוש על האופרטור, המדגם והדולל. לאחר מילוי כל השדות הרצויים, לחץ על הגדרות אישור כדי לאתחל את קובץ ה- Script.

לפני כל לכידת וידאו, חפש הנחיה לקדם את הבוכנה באופן ידני. הזרקו כ-0.05 מיליליטר של הדגימה לתא הלייזר. כשהחלקיקים נחים, לחץ על אישור. עם השלמת לכידת הווידאו החמישית, תופיע תיבת אישור הגדרות יחד עם תיבת התהליך.

כאשר המסגרות מתקדמות באופן ידני מתחתית מסך הווידאו, שים לב למספר הצלבים הכחולים היוצרים חלקיקים על המסך והגדר את סף האיתור לעיבוד המדגם. המתן לעיבוד אוטומטי של סרטוני הווידאו בהיסטוגרמה של תוצאות לפני הצגת הודעת השלמה בתיבת דו-שיח ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר הופעת התיבה הגדרות ייצוא, שמור את התוצאות על-ידי לחיצה על ייצוא. סמן את כל חמשת סרטוני הלכידה המפורטים בניסוי הנוכחי.

לאחר מכן, לחץ על עבד קבצים נבחרים והמתן שתיבת אישור ההגדרה תופיע בתיבת התהליך כדי לשנות את סף האיתור ולאחר מכן התאם את סף האיתור לרמה הרצויה ועבור להגדרה ולחץ על אישור. הסרטונים יעובדו באופן אוטומטי בהיסטוגרמה של תוצאות ותיבת דו-שיח תוצג הודעה על השלמה. לחץ OK.In את הניתוח הייצוגי, את התוצאות של ניתוח nanotracking, או NTA, עבור דגימות ליפוזום ודילול DPBS מייצג מוצגים. דגימות מסוננות היו קוטר חלקיקים ממוצע של 108 ננומטר וריכוז של 7.4 כפול 10 לחלקיקים השמיניים למיליליטר.

לעומת זאת, דגימות לא מסוננות היו קוטר חלקיקים ממוצע של 159 ננומטר וריכוז של 7.6 כפול 10 לחלקיקים השמיניים למיליליטר. ברמות מצלמה משולבות, ככל שסף האיתור הוגדל משניים לחמש, גודל החלקיקים הממוצע והמצב הראה ירידה משמעותית בגדלי החלקיקים של הדגימות המסוננות. ריכוזי החלקיקים ברמות המצלמה המשולבות ירדו ככל שסף האיתור הוגדל.

לא זוהה הבדל משמעותי בריכוזי החלקיקים בין דגימות מסוננות לדגימות לא מסוננות. בסף זיהוי משולב, ככל שרמת המצלמה עלתה מ-12 ל-14, נרשמה ירידה בגודל החלקיקים הממוצע והמצבי של הדגימות המסוננות. ריכוזי החלקיקים בסף הזיהוי המשולב עלו ככל שרמות המצלמה עלו מ-12 ל-14.

לא נצפו הבדלים משמעותיים בין דגימות מסוננות לדגימות לא מסוננות. שלבים 4.1 עד 5.2 חשובים כדי למצוא את אזור הצפייה הנכון. השגת תוצאות עקביות על-פני ריצות ניסיון מרובות תלויה במיומנות חוזרת זו.

פיזור אור דינמי משמש לעתים קרובות כבן לוויה לניתוח מעקב ננו-חלקיקים בעיקר כדי לקבל את פוטנציאל הזטה, שהוא מטען פני השטח של החלקיקים. עבור ניתוח חלקיקים, NTA ממשיך להיות שיטה בעלת ערך רב לכימות של חלקיקים שימושי למחקר שלפוחית חוץ תאית.