Name: שימוש קריסטל ויולט כדי לשפר קריאה חזותית אפקט ציטוטופתי מבוסס עבור טיטציה ויראלית באמצעות TCID50 Assays (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 6 s
Description: למד שיטת צביעה בקריסטל ויולט לכימות ויראלי מדויק בחללי 96-באר באמצעות TCID50. הפרוטוקול משווה בין צביעה אימונוהיסטוכימית למיקרוסקופיה אופטית לקבלת תוצאות אמינות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים רוצים להודות לד"ר פרנק שולר על הערותיו המועילות בכתב היד, קלואי מריאנט על עזרתה בתמונות המיקרוסקופיה ותרזה מ. טדג' על הגרסה האנגלית המועילה שלה.

1. פרוטוקול טיטריון
הערה: השתמש בווירוס ציטוטופתי המדביק תאים חסידים. להדגמה זו, וירוס שפעת A (IAV) ממוצא חזירים (A / קליפורניה / 07/2009 /(H1N1)) ווירוס הרבייה והנשימה חזירית (PRRSV) סוג 2, זן NC 1-7-4 שימשו.
<ol><li>טירט וירוסים אלה ב 96 לוחות היטב במשך 7 ימים בארון בטיחות ביולוגית הממוקם במעבדה Biosafety רמה 2 (BSL-2).<ol>
<li>כדי לבצע titrations אלה, זרע 96 לוחות היטב עם קו התא הנדרש. עבור PRRSV, השתמש בקו תא MA-104 ו עבור IAV השתמש בקו תא MDCK. עבור תרבית התא, להשתמש במדיום DMEM בתוספת 10% FBS, L-גלוטמין ופניצילין-סטרפטומיצין ולהגדיל את התאים למפגש.</li>
		<li>לפני ההדבקה, לשטוף את התאים באמצעות 200 μL של PBS.</li>
		<li>לדלל את מלאי הווירוס באמצעות סדרת דילול פי 10 על ידי ערבוב 900 μL של מדיה ו 100 μL של וירוס. הקפד למערבולת כראוי את הצינור כדי להבטיח ערבוב נכון של המדיום והוירוס כדי למנוע שגיאות דילול.</li>
		<li>סמן את פריסת הצלחת על המכסה. לשטוף את בארות עם 1x חוצץ מלוח פוספט (PBS). הוסף 50 μL של inoculum בבארות המתאימות לאחר שיטות טיטריון שתוארו בעבר2,3.</li>
		<li>דגירה ב 37 °C (5° C) אינקובטור CO2 במשך 7 ימים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הערכת אפקט ציטוטופתי (CPE) באמצעות מיקרוסקופיה
<ol><li>לאחר הדגירה של 7 ימים, לשטוף את כל הבארות עם 200 μL של 1x PBS פעמיים.</li>
	<li>להעריך את כל הבארות של הלוח תחת מיקרוסקופ אור כדי לזהות חזותית CPE. במקרה של PRRSV ו- IAV, CPE שלהם מורכב מוות תא וניתוק לאחר מכן מהצלחת, מה שמוביל להפרעה monolayer. עם זאת, וירוסים אחרים עשויים להציג סוגים שונים של CPE.</li>
</ol>3. פרוטוקול הכתמת
הערה: אפקט ציטופתי (CPE) הוערך באמצעות כתמים סגול קריסטל.
<ol><li>לאחר הדגירה של 7 ימים, לשטוף את כל הבארות באמצעות 200 μL של 1x PBS פעמיים.</li>
	<li>תקן את התאים על ידי הוספת 50 μL / באר של 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1x PBS ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>לאחר הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 200 μL של 1x PBS. לאחר מכן, להוסיף 50 μL / באר של סגול קריסטל מדולל ל 4% במים ודגרה במשך 5 דקות ב RT. הערה: כימיקל סגול קריסטל מכתים את התאים שנותרו מחוברים לצלחת בזמן הקיבעון, ומשאירים את חלקי הבאר שבהם התאים מנותקים ללא מוכתמים.</li>
	<li>לבסוף, לשאוף סגול קריסטל מן בארות ובאופן אופציונלי להשאיר את הצלחות לאוויר יבש במשך 2-5 דקות ב RT או לשטוף את הצלחת עם 200 μL של מים כדי להסיר כתם עודף לפני הדמיה.</li>
	<li>השתמש בשיטות שתוארו בעבר כדי לחשב מתמטית את הטיטר. כאן, נוסחת קרבר ונוסחת Muench הוחלו על PRRSV ו- IAV, בהתאמה 2,3. פרטים של משוואות אלה מוצגים בסעיף התוצאה הייצוגית.</li>
</ol>4. תיוג אימונוציטוכימי (ICC)
הערה: תיוג אימונוציטוכימיה עבור שני הווירוסים בוצע בעקבות שיטות שתוארו בעבר9,10,11.
<ol><li>לאחר הדגירה של 7 ימים של titration, לתקן את התאים באמצעות PFA כמתואר בשלב 3.2.</li>
	<li>לשטוף את הצלחות עם פתרון המורכב על ידי 100 מ"ל של 1 M טריס הידרוכלוריד, 1 גרם של סאפונין, ו 8.5 גרם של NaCl ב 900 מ"ל של H2O. לאחר מכן, להשלים שתי שטיפות נוספות עם תערובת של 1x PBS ו 5% סרום בקר עוברי (FBS) ודגורה עם פתרון טריס-סאפונין-NaCl בטמפרטורת החדר (RT) במשך 20 דקות.</li>
	<li>לדגור את כל הבארות עם הנוגדן העיקרי עבור 2 שעות ב RT. הערה: נפח הנוגדנים העיקריים עבור כל וירוס היה 100 μL והוכן באמצעות דילול 1:300 של 2% FBS ב 1x PBS.</li>
	<li>לשטוף את התאים פעמיים עם פתרון טריס, סאפונין, ו NaCl מוכן בשלב 4.2.</li>
	<li>לדגור את כל בארות עם הנוגדן המשני עבור 1 שעה ב RT. הערה: נפח הנוגדן המשני היה 100 μL והוכן באמצעות דילול של 1:250 של 2% FBS ב- 1x PBS.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם דילול טריס, סאפונין, ו NaCl כמתואר בשלב 4.2.</li>
	<li>שאפו לדילול הקודם ודגרו את הלוחות עם 200 μL / באר של תמיסה אמינואתיל קרבזול (AEC) בדילול סופי של 1:50 במים בעקבות הוראות היצרן במשך 30 דקות ב RT.</li>
	<li>לאחר הדגירה, להשליך את פתרון AEC ולהוסיף 100 μL / באר של 1x PBS עבור הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה.</li>
	<li>נגזר מתמטית את טיטר כמתואר בשלב 3.5.</li>
</ol>

<ol><li>Kärber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+to+the+collective+treatment+of+pharmacological+series+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedeberg%27s+Archive+for+Experimental+Pathology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+per+cent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty per cent endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).</li>
<li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+method+of+right+and+wrong+cases+%28constant+stimuli%29+without+Gauss%27s+formulae%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Psychology%22%5BJournal%5D)">The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227(1908).</li>
<li>Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+assay+methods%3A+accuracy+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Virus assay methods: accuracy and validation.</a> Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).</li>
<li>Kim, J., Chae, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+virus+isolation%2C+polymerase+chain+reaction%2C+immunohistochemistry%2C+and+in+situ+hybridization+for+the+detection+of+porcine+circovirus+2+and+porcine+parvovirus+in+experimentally+and+naturally+coinfected+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).</li>
<li>Suchman, E., Blair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytopathic+effects+of+viruses+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytopathic effects of viruses protocols.</a> American Society of Microbiology. , (2007).</li>
<li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yángüez, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarakus%2C+U+%22Influenza+Virus%22">Influenza Virus</a>. , Springer. 59-88 (2018).</li>
<li>Tingstedt, J. -E., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immune+responses+in+the+lungs+of+pigs+infected+in+utero+with+PRRSV%3A+an+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study.</a> Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).</li>
<li>Guarner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+studies+of+influenza+A+virus+infection+in+human+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs.</a> American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).</li>
<li>Nicholls, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+highly+pathogenic+influenza+and+pandemic+influenza+virus+in+formalin+fixed+tissues+by+immunohistochemical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods.</a> Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

טייטציות ויראליות משמשות באופן שגרתי במחקר וירולוגיה, עם זיהוי PFU וביקורי TCID50 הנפוצים ביותר 1,2,3,4. שתי השיטות מסתמכות על זיהוי CPE בתאים נגועים, ולמרות שניתן להעריך אותם חזותית באמצעות מיקרוסקופיה, כתמים מוחלים בדרך כלל כדי להשיג תוצאה אובייקטיבית יותר או אפילו להפחית את זמני הדגירה. במקרה של TCID50, אחת החלופות הנפוצות ביותר לזיהוי CPE חזותי המציע מדד מדויק ואובייקטיבי היא ICC <...

טיטציה ויראלית באמצעות TCID50 assay היא טכניקה נפוצה במחקר מחלות זיהומיות1. למרות וריאציות על המתמטיקה מאחורי שיטה זו הוצעו לאורך זמן1,2,3,4, השיטות המיושמות כיום של זיהוי זיהום מסתמכות על אישור חזותי באמצעות נוכחות של אפקט ציטוטופתי (CPE) באמצעות microscopy5. כדי לאשר הדמיה CPE אובייקטיבית יותר על TCID50 assays, immunocytochemical (ICC) כתמים תאיים מיקוד החלבונים של הנגיף היא אחת השיטות הנפוצות ביותר6 כמו וירוסים שונים יכולים לייצר צורות שונות של CPE. במקרה שלנו, השינויים המורפולוגיים של התא דומים כאשר נגועים הן בנגיף שפעת A (IAV) והן בווירוס הרבייה והתסמונת הנשימתית החזירית (PRRSV), שם תאים נגועים אוספים ומתנתקים מהצלחת. במקרה של PRRSV, זה גורם CPE המכונה "הרס מוחלט", שבו כל התאים בסופו של דבר ניתוק מן הבאר. IAV לעומת זאת, יכול להציג הן הרס מוחלט והן CPE נוסף המכונה "הרס סכום ביניים" שבו מספר קטן של תאים אינם מתנתקים לאחר זיהום7. עם זאת, טכניקה זו גוזלת זמן רב לביצוע ודורש שימוש ריאגנטים יקרים יחסית. חשוב לציין כי ICC אינו מתייג CPE, אלא את מספר התאים שנדבקו בהצלחה על ידי הנגיף. משמעות הדבר היא כי התאים שנדבקו בהצלחה עד סוף הדגירה ייראו כחיוביים גם אם הזיהום עדיין לא גרם ל- CPE, ולכן, צפוי אחוז גבוה יותר של תאים חיוביים של ICC בהשוואה ל- CPE. מסיבה זו, במחקר זה אנו מתארים שיטה משלימה של זיהוי חזותי של CPE ב TCID50 assay המבוסס על סגול קריסטל, כימי עם מטען חיובי המתחבר קרום התא ומשמש להכתים תאים דבקים. סגול קריסטל משמש לעתים קרובות במחקר וירולוגיה כדי למדוד יחידות יוצרות פלאק, בין היתר8.
במחקר זה, אנו משווים את הרגישות של זיהוי CPE מיקרוסקופי לא מוכתם עם כתמים סגול קריסטל וכתמים אימונוציטוכימיים המבוססים על זיהוי חלבון ויראלי, אשר ידוע להיות אובייקטיבי יותר בשל הרגישות הגבוהה שלה. מחקר זה מראה כי הן סגול קריסטל וחיסון כתמים מדויקים יותר מאשר זיהוי CPE מבוסס מיקרוסקופיה חזותית וניתן להשתמש בהם כדי לזהות באופן אובייקטיבי בארות נגועות TCID50 titration. בהתחשב ביכולתם להגיע לרמת דיוק כמעט זהה על וירוסים ציטוטופתיים שנבדקו בקווי תאים, סגול קריסטל מוצג כדרך מהירה ובמחיר סביר יותר לקבוע טיטריוציות ויראליות על TCID50 assay. השיטה המוצעת באמצעות כתמים סגול קריסטל לוקח זמן כולל של 40 דקות לבצע, עם 15 דקות עבור דגירה paraformaldehyde (PFA), 5 דקות עבור דגירה סגול קריסטל מקסימום של 15 דקות להכנת חומר, שחיץ, וייבוש. פרוטוקול אימונוציטוכימיה שהוחל להשוואה לוקח זמן ממוצע של 4 שעות 30 דקות ובוצע כפי שתואר בעבר9,10. השיטה המוצעת נועדה לעזור לדמיין טיטציה ויראלית שהושלמה. זמני זיהום ודגרה יכולים להתבצע בפריסה שונה בהתאם לנגיף. כאן בדקנו שני וירוסי RNA עם השפעה ציטוטפתית על קווי התא.

<table><tbody><tr><td>צלחות תרבית תאים 96 בארות</td><td>Genesee</td><td>25-221</td> תמיסת AEC <td>שקופה ושטוחה</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>1122</td><td></td></tr><tr><td>סגול קריסטל</td><td>Thermo Fisher</td><td>C581-25; C581-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>BioWest</td><td>S1480</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Thermo Fisher</td><td>J19943</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן שפעת ראשוני</td><td>Bioss</td><td>BS-0344R</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן PRRSV ראשוני</td><td>Bioss</td><td>BS-10043R</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן AAA1882014 Secondaty</td><td>Invitrogen</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>Tris Hydrochloride</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9856</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש קריסטל ויולט כדי לשפר קריאה חזותית אפקט ציטוטופתי מבוסס עבור טיטציה ויראלית באמצעות tcid50 assays

Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays

טיטציה ויראלית היא בדיקת מפתח למחקר וירולוגיה. זיהוי של אפקט ציטוטופתי (CPE) באמצעות בדיקות TCID50 ויחידות יוצרות פלאק (PFU) הן שתי השיטות העיקריות לחישוב טיטר של מלאי וירוסים ומבוססות לעתים קרובות על זיהוי מיקרוסקופיה או כתמי תאים להדמיה. במקרה של TCID50 assay, ויזואליזציה אובייקטיבית מבוססת בדרך כלל על כתמים אימונוציטוכימיים (ICC) של וירוס תאי לחישוב titers בשילוב עם זיהוי CPE חזותי באמצעות מיקרוסקופיה. עם זאת, כתמי בית הדין הפלילי הבינלאומי יקרים וגוזלים זמן רב. במחקר זה, השווינו תצפית CPE חזותית באמצעות מיקרוסקופיה, כתמי ICC וכתמים סגול קריסטל כדי לקבוע את titers של שני וירוסים יוצרי CPE, וירוס שפעת A (IAV) ממוצא חזירים ווירוס הרבייה והנשימה חזירית (PRRSV). אנו מראים כי הן הכתמת קריסטל סגול ו- ICC מדויקות יותר מזיהוי CPE חזותי, ומציגות רמות דיוק כמעט זהות הן ב- IAV והן ב- PRRSV. מסיבה זו, כאן אנו מציגים כתמים סגול קריסטל כדרך מהירה ובמחיר סביר יותר לקבוע titrations ויראלי על TCID50 assay עבור וירוסים יוצרי CPE titrated בשורות התא.

המשוואות ששימשו לחישוב מתמטי של הטיטר תוארו בעבר2,3.
בקצרה, עבור PRRSV, אנו מיישמים את שיטת קארבר:
טיטר (TCID50) = 10 T + 1.3 שבו:
<img alt="משוואה לדינמיקה סיבובית, T = d + (r/N) × (n + N/2), ניתוח נוסחאות." src="/files/ftp_upload/63063/63063eq01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1">
בנוסחה זו d = יומן שלילי של הדילול...

פרוטוקול זה מציג גישה מדויקת ואובייקטיבית לדמיין טיטריוציות ויראליות באמצעות סגול קריסטל, על ידי השוואתו עם מיקרוסקופיה אופטית וכתמים אימונוציטוכימיים.

שימוש קריסטל ויולט כדי לשפר קריאה חזותית אפקט ציטוטופתי מבוסס עבור טיטציה ויראלית באמצעות TCID50 Assays

Viral titration is a key assay for virology research. The detection of cytopathic effect (CPE) via TCID50 assays and plaque-forming units (PFU) assays are ...

מטרת הפרוטוקול הזה היא לייצר טיטציה של מלאי וירוסים ולדמיין אותו באמצעות כתמים סגולים קריסטל. כדי לעשות זאת, טיטציה ויראלית כללית תודגם ואחריה הכתמים. טיטציה זו תבוצע בצלחת 96 באר לתקופה של שבעה ימים בארון בטיחות ביולוגית בתוך מעבדה ברמה 2 בטיחות ביולוגית.כדי לעשות זאת, צלחת 96 באר של קו התא המועדף יהיה זרע באמצעות המדיה המתאימה ולתת לגדול עד confluent. מלאי הווירוס יהיה מדולל באמצעות דילול פי עשרה, על ידי ערבוב 900 מיקרוליטרים של מדיה ו 100 microliters של וירוס, או דילול המתאים. הקפד מערבולת כל צינור כדי להבטיח ערבוב נכון של התקשורת ואת הנגיף ולהימנע שגיאות על דילול.כתוב את הפריסה של הצלחת שלך בעופרת, כמו גם כל דילול כדי לעזור במהלך תהליך ההדבקה. לפני ההדבקה, לשטוף באמצעות 200 microliters של PBS. הוסף 50 מיקרוליטרים של האינוקולום שלך בבארות המתאימות.לאחר מכן, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5%CO2 במשך שבעה ימים. לאחר הדגירה בת שבעת הימים, יש לשטוף בעזרת 200 מיקרוליטרים של PBS. תקן את התאים על ידי הוספת 50 מיקרוליטרים לבאר של PFA ב 4% ב- PBS ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הדגירה, לשטוף תאים שוב פעמיים עם 200 microliters של PBS לפני תוספת של 50 microliters לכל באר של סגול קריסטל במים ודגרה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, שאפו סגול קריסטל מן בארות ובאופן אופציונלי, לה

use-crystal-violet-to-improve-visual-cytopathic-effect-based-reading

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Assay מתאר אמצעי מהיר למדוד היווצרות biofilm מוקדם חיידקים ופטריות. שיטה זו משתמשת צלחת microtiter כמו לתשתית להיווצרות חיידקים biofilm ו biofilm היא דמיינו באמצעות סגול זן קריסטל. Assay מספק גם assay איכותי או כמותי ליצירת biofilm מוקדם.

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

מקור: Bouillier, C., ועמיתיהם יצירה, הגברה ותיתור של נגיפי סינציטיום נשימי (RSV) רקומביננטיים. .J. Vis. Exp (2019)הסרטון מדגים בדיקת טיטרציה של פלאקים (plaque titration assay) המשמשת לכימות של נגיף סינציטנלי נשימתי (RSV) רקומביננטי זיהומי בשכבות מונו-שכבה של תאי אפיתל. הוא מציג את הדבקת תאי המאכסן באמצעות תרחיפי נגיף בדילולים סדרתיים, את הגבלת התפשטות הנגיף על ידי שכבת כיסוי חצי-מוצקה מבוססת תאית, ואת היווצרות פלאקים מקומיים כתוצאה מאפקטים ציטופתיים. הפרוצדורה מסתיימת בצביעה, דה-קונטמינציה...

בדיקת טיטרציה של פלאקים לכימות של נגיף הסינציטיום הנשימתי (RSV) זיהומי

Source: Frias-De-Diego and A., Crisci, E. Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays. J. Vis. Exp., (2022)This video demonstrates a crystal violet staining method to visualize cytopathic effects in virus-infected cell cultures. The pattern of stained and unstained wells across serial dilutions enables rapid, cost-effective estimation of the viral infectious dose.

Crystal Violet Staining for Estimating Viral Infectious Titer in Cell Cultures 

מקור: .Baer, A. and Kehn-Hall, K. קביעת ריכוז נגיפי באמצעות בדיקות פלאק: שימוש במערכות כיסוי מסורתיות וחדשניות J. Vis. Exp. (2014).סרטון זה מדגים את השימוש בשכבת כיסוי נוזלית מבוססת תאית מיקרוקריסטלית בבדיקת פלאקים, על ידי השוואת יעילותה ביצירת פלאקים נגיפיים לעומת שכבת כיסוי מסורתית של אגרוז חצי-מוצק.

הערכת מערכת כיסוי נוזלית לבדיקות פלאקים נגיפיים

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת כדאיות התא באמצעות הליך צביעה סגול קריסטלי עבור תאים סרטניים עמידים לתרופות כימותרפיות.

צביעת קריסטל ויולט: טכניקה לדמיין תאים סרטניים עמידים לתרופות באמצעות מבחני היווצרות מושבה

שיטה זו מתארת ​​את השימוש בכימיה לחץ כדי למדוד שינויים בשעתוק תא מארח לאחר הדבקה בנגיף קדחת הבקעה (RVFV) מתח MP-12. תוצאות יכולות להיות דמיינו איכותית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או הושגו כמותית באמצעות cytometry הזרימה. שיטה זו ניתנת להתאמה לשימוש עם וירוסים אחרים.

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

שלושה מבחני, כולל השפעת cytopathic (CPE) מבוססת assay, assay מנת התגובה וassay בזמן של תוספת (TOA) פותחו, אופטימיזציה, תוקף ומנוצל כדי לזהות antivirals רומן נגד וירוס Bluetongue (BTV), כמו גם כדי לקבוע את הפעולה מנגנון-of-האפשרית (משרד חקלאות) לantivirals זיהה לאחרונה.

מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue

מבחני פלאק הם תקן הזהב לכימות ויראלי, תוך שימוש בשכבות לכידה על חד-שכבות תאיות מארחות כדי לקבוע טיטרים ויראליים. בעוד שבאופן מסורתי נעשה שימוש בשכבות-על שונות למחצה, כאן אנו מדגימים טכניקות פלאק המשווים שכבות-על מוצקות למחצה לתאית מיקרו-קריסטלית נוזלית חדשה בקרב מספר משפחות של נגיפים.

קביעת ריכוז נגיפית באמצעות לוחית מבחני: מערכות כיסוי שימוש מסורתיות וחדשני

אנו מתארים שיטה ליצירת, הגברה גנטית שונה וירוסים syncytial הנשימה (RSVs) ואת וזמינותו של פלאק ממוטב עבור RSVs. אנו ממחישים לפרוטוקול זה על-ידי יצירת שני וירוסים רקומביננטי בהתאמה לאפשר כימות של שכפול RSV ולחיות ניתוח של RSV הכללה וגופי בגרגרים הכללה גופים הקשורים דינמיקה.

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התפשטות נגיף הזיקה (ZIKV) בתאי כליות של קוף ירוק אפריקאי ורו ואת הכימות של ZIKV באמצעות שיטות זיהוי חיסוני קולורימטרי מבוססות תאים בפורמטים של 24 בארות ו-96 בארות (תפוקה גבוהה).

התפשטות וירוסים וכימות קולורימטרי מבוסס תאים

מבחן TCID50 המדווח כאן משתמש במדידות התנגדות בזמן אמת ללא תוויות ובמודול הווירולוגיה של המערכת כדי לנטר באופן אובייקטיבי את ההשפעות הציטופתיות הנגרמות על ידי וירוס (CPE) בזמן אמת. הבדיקה היעילה הזו מקצרת משמעותית את זמן העבודה תוך תמיכה במדידות CPE קינטיות ומהירות תפוקה גבוהה וכמותית ומאפשרת חישובי TCID50 אוטומטיים בזמן אמת.

בדיקת מינון זיהומי של תרבית רקמה (TCID50) בזמן אמת וללא תוויות באמצעות אימפדנס לכימות אוטומטי של טיטר ויראלי

למד שיטת צביעה בקריסטל ויולט לכימות ויראלי מדויק בחללי 96-באר באמצעות TCID50. הפרוטוקול משווה בין צביעה אימונוהיסטוכימית למיקרוסקופיה אופטית לקבלת תוצאות אמינות.

שימוש קריסטל ויולט כדי לשפר קריאה חזותית אפקט ציטוטופתי מבוסס עבור טיטציה ויראלית באמצעות TCID50 Assays

גלה סרטונים נוספים