שימוש קריסטל ויולט כדי לשפר קריאה חזותית אפקט ציטוטופתי מבוסס עבור טיטציה ויראלית באמצעות TCID50 Assays
12 בפברואר 2022
פרוטוקול זה מציג גישה מדויקת ואובייקטיבית לדמיין טיטריוציות ויראליות באמצעות סגול קריסטל, על ידי השוואתו עם מיקרוסקופיה אופטית וכתמים אימונוציטוכימיים.
מטרת הפרוטוקול הזה היא לייצר טיטציה של מלאי וירוסים ולדמיין אותו באמצעות כתמים סגולים קריסטל. כדי לעשות זאת, טיטציה ויראלית כללית תודגם ואחריה הכתמים. טיטציה זו תבוצע בצלחת 96 באר לתקופה של שבעה ימים בארון בטיחות ביולוגית בתוך מעבדה ברמה 2 בטיחות ביולוגית.
כדי לעשות זאת, צלחת 96 באר של קו התא המועדף יהיה זרע באמצעות המדיה המתאימה ולתת לגדול עד confluent. מלאי הווירוס יהיה מדולל באמצעות דילול פי עשרה, על ידי ערבוב 900 מיקרוליטרים של מדיה ו 100 microliters של וירוס, או דילול המתאים. הקפד מערבולת כל צינור כדי להבטיח ערבוב נכון של התקשורת ואת הנגיף ולהימנע שגיאות על דילול.
כתוב את הפריסה של הצלחת שלך בעופרת, כמו גם כל דילול כדי לעזור במהלך תהליך ההדבקה. לפני ההדבקה, לשטוף באמצעות 200 microliters של PBS. הוסף 50 מיקרוליטרים של האינוקולום שלך בבארות המתאימות.
לאחר מכן, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5%CO2 במשך שבעה ימים. לאחר הדגירה בת שבעת הימים, יש לשטוף בעזרת 200 מיקרוליטרים של PBS. תקן את התאים על ידי הוספת 50 מיקרוליטרים לבאר של PFA ב 4% ב- PBS ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הדגירה, לשטוף תאים שוב פעמיים עם 200 microliters של PBS לפני תוספת של 50 microliters לכל באר של סגול קריסטל במים ודגרה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, שאפו סגול קריסטל מן בארות ובאופן אופציונלי, להשאיר את הצלחות לאוויר יבש במשך שתיים עד חמש דקות בטמפרטורת החדר או לשטוף אותו עם 200 microliters של מים כדי להסיר כתם מוגזם לפני הדמיה. כתוצאה מכך, לאחר הכתמה מחדש, תאים שליליים יהיו מוכתמים.
בארות חיוביות ינוקו. מידע זה ישמש באחת משתי הנוסחאות המתוארות לחישוב הצמיג הנגיפי הסופי שלך. כאשר הטייטר שהושג עם כל שיטה הושווה, זה הראה כי במונוציטו כימיה כתמים יכול במקרים מסוימים לזהות בארות חיוביות נוספות בהשוואה סגול קריסטל, וכי כמו כן, שתי שיטות הכתמה יכול לזהות בארות חיוביות יותר מאשר הערכה חזותית באמצעות מיקרוסקופיה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים שיטה מדויקת לוויזואליזציה של טיטראציות נגיפיות באמצעות צביעה ב-crystal violet. הוא משווה שיטה זו למיקרוסקופיה אופטית ולצביעה אימונוציטוכימית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- וירוסים
- ביולוגיה של התא
- טכניקות מעבדה
רקע
- טיטרציה ויראלית חיונית לכימות של מלאי נגיפים.
- צביעה בסגול גבישי (Crystal violet) מספקת ייצוג חזותי של נוכחות נגיפית.
- שיטות השוואה כוללות מיקרוסקופיה אופטית וצביעה אימונוציטוכימית.
- טכניקות דילול נכונות הן קריטיות להשגת תוצאות מדויקות.
מטרת המחקר
- להפקת טיטרציה של מלאי נגיפים.
- להדמיית הטיטרציה באמצעות צביעה ב-crystal violet.
- להבטחת דיוק בשיטות הכמותיות של נגיפים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- זריעה של קו תאים מועדף בפלטת 96 בארות.
- ביצוע דילולים עשריים (tenfold) של מלאי הנגיף.
- ערבול באמצעות וורטקס של כל דילול לצורך ערבוב תקין.
- צביעה ב-crystal violet לאחר תקופת הדגרה של שבעה ימים.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של טיטראציות נגיפיות באמצעות קריסטל ויולט.
- השוואה עם שיטות צביעה אחרות הראתה עקביות.
- השגה של כימות מדויק של מלאי הנגיפים.
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה למחקרים עתידיים.
מסקנות
- צביעה ב-Crystal violet היא שיטה יעילה להדמיה של טיטראציות ויראליות.
- הפרוטוקול משפר את הדיוק של הכימות הוויראלי.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו עבור יישומים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טיטרציה ויראלית מדויקת היא קריטית לסריקת תרופות נוגדות וירוסים ולפיתוח חיסונים, שכן זיהוי לא עקבי של CPE עלול לפגוע בזיהוי מועמדים פוטנציאליים ובהחלטות לגבי המשך הפיתוח. צביעה ב-Crystal violet מציעה חלופה משתלמת וניתנת לשחזור לצביעה אימונוציטוכימית, ובכך משפרת את סטנדרטיזציית הבדיקה ומפחיתה שונות בתהליכי גילוי מוקדמים. הדבר תומך בביטחון ניבוי בהערכות יעילות של תרופות נוגדות וירוסים ומאפשר סריקה רחבה ובעלת תפוקה גבוהה המבוססת על TCID50 עבור וירוסים הגורמים ל-CPE.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר כימות אובייקטיבי של זיהומיות נגיפית, מפחית את ההסתמכות על מיקרוסקופיה סובייקטיבית ותומך בהסרת סיכונים מכניסטית של מטרות אנטי-ויראליות.
- ערך תפעולי: מספק שיטת צביעה מהירה וזולה המגדילה את תפוקת הבדיקה ואת השחזוריות באישור פגיעות (hit validation) של תרכובות אנטי-ויראליות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר נקודות קצה ברורות וכמותיות עבור בדיקות TCID50, ובכך משפר את יחס אות-רעש בקמפיינים של סריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בריאגנטים יקרים ל-ICC, ובכך מפחית את העלות לכל בדיקה ומאפשר יישום רחב יותר בפלטפורמות לגילוי תרופות אנטי-ויראליות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק מדידות עקביות של תיתור נגיפי לאורך מחקרים, ובכך תומך במידול מהימן של תגובה למינון במחקרי יעילות פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: מקל על סטנדרטיזציה בין-מעבדתית של הכנת מלאי נגיפים, ובכך מפחית את השונות הבין-ניסויית במחקרי תמיכה ב-IND.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי של תרופות אנטי-ויראליות, החל מאישור ראשוני של מועמדים (hits) ועד לאופטימיזציה של תרכובות מובילות (leads), כאשר טיטרציה ויראלית מדויקת מספקת מידע על קשרי מבנה-פעילות (SAR) ועל פרופילי עמידות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי אספקת מודלים הדירים להדבקה נגיפית עבור מחקרים של מנגנוני פעולה.
- סריקה: מספקת תוצאות סטנדרטיות וכמותיות החיוניות להתקדמות משלב ה-hit לשלב ה-lead במערכי סריקה של תרופות אנטי-ויראליות.
- אנליטיקה: מאפשרת חישוב מדויק של ערכי TCID50, המאפשר השוואה מדויקת של עוצמת התרכובות בתנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מבטיחה רצף מסריקה אנטי-ויראלית in vitro למודלים של הדבקה in vivo, באמצעות כימות עקבי של מלאי הנגיפים.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת ניתנת להרחבה ובעלות נמוכה, הישימה על פני מספר יעדי נגיפים ותחומי טיפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ביעילות אנטי-ויראלית על ידי הפחתת תוצאות שגויות שליליות הנובעות מהערכה חזותית של CPE.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור וההתרחבות של בדיקות TCID50 באמצעות צביעה סטנדרטית ומפושטת.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון בתוכניות אנטי-ויראליות על ידי הורדת עלויות הבדיקה מבלי להתפשר על איכות הנתונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות אספקת נתוני titer ויראליים מהימנים עבור קריטריוני go/no-go.
שיקולי יישום
- דורש הכשרה בסיסית בבירוויולוגיה וטכניקה אספטית לטיפול בטוח בנגיפים בסביבת BSL-2.
- מסתמך על ציוד מעבדה סטנדרטי הכולל אינקובטורים, צנטריפוגות וקוראי לוחות לצורך כימות אופציונלי.
- מחייב הסכמה בין צוותים על משך הצביעה ופרוטוקולי השטיפה כדי להבטיח הדירות בין מעבדות.
- מתאים לקווי תאים דבקים התומכים בהיווצרות CPE; עשוי להיות נדרש אופטימיזציה עבור נגיפים שאינם גורמים ל-CPE או עבור תאים שאינם דבקים.
- מוגבל לנגיפים הגורמים לאפקט ציטופתי שניתן לזיהוי; אינו מתאים למודלים של זיהום מתמשך או לנגיפים שאינם ציטופתיים ללא התאמה.
