Name: באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: למד שיטת הדמיה ברזולוציה גבוהה לחקר דינמיקת גדילת חרוטי אקסון וצמיחתם במוח עוברי עכברים. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח התנהגות אקסונים בהקשר פיזיולוגי ומסייע בחקירת מנגנוני פלסטיות עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות למריה יוג'ניה ברניס על צילום הנהלים. אנו מודים גם לאמילי ברנסייד, אמילי הנדלי, ת'ורבן פיטרלה, מקס שלסקי וסינה שטרן על שקראו את כתב היד ודנו בו. אנו אסירי תודה לעוזרות הטכניות הבולטות שלנו, ג'סיקה גונייה, בלנקה רנדל ואנה-טואן פאם. אנו מכירים בתמיכה החשובה של מתקן מיקרוסקופ האור של DZNE ומתקן בעלי החיים. עבודה זו נתמכה על ידי Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), הקרן הבינלאומית למחקר בפרפלגיה (IRP) וכנפיים לחיים (עד F.B). F.B. הוא חבר באשכול המצוינות ImmunoSensation2, SFBs 1089 ו- 1158, והוא חתן פרס רוג'ר דה ספולברך.

<ol><li>Schelski, M., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+polarization%3A+From+spatiotemporal+signaling+to+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).</li>
<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li>
<li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+axon+guidance%3A+are+we+nearly+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li>
<li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+local+actin+instability+in+axon+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The role of local actin instability in axon formation.</a> Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).</li>
<li>Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+linker+proteins+regulate+neuronal+polarization+through+microtubule+and+growth+cone+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).</li>
<li>Witte, H., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+cytoskeleton+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of the cytoskeleton during neuronal polarization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).</li>
<li>Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+stabilization+specifies+initial+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.</a> Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).</li>
<li>Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+elasticity+regulates+cell-type+specific+RHOA+signaling+and+neuritogenesis+of+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons.</a> Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).</li>
<li>Santos, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+of+CNS+neurons+in+three+dimensions+is+amoeboid+and+independent+of+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions.</a> Cell Reports. 32 (3), 107907(2020).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+and+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics and nerve growth.</a> Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).</li>
<li>Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+reorganization+underlying+growth+cone+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility.</a> Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).</li>
<li>Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+promotes+integrin+adhesion+dynamics+necessary+for+chemotropic+turning+of+nerve+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).</li>
<li>Turney, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+stimulates+axon+outgrowth+through+negative+regulation+of+growth+cone+actomyosin+restraint+of+microtubule+advance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+control+of+radial+glia+proliferation+and+scaffolding+during+cortical+development+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341(2020).</li>
<li>Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+cone+cytoskeleton+in+axon+outgrowth+and+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).</li>
<li>Dupraz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA+controls+axon+extension+independent+of+specification+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain.</a> Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).</li>
<li>Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro%2C+ex+vivo+and+in+vivo+techniques+to+study+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Namba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneering+axons+regulate+neuronal+polarization+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).</li>
<li>Shah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+GTPases+are+master+regulators+of+neural+cell+polarity+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex.</a> Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).</li>
<li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+confocal+imaging+of+migrating+neurons+in+organotypic+slice+culture+of+embryonic+mouse+brain+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).</li>
<li>de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+motility+is+essential+for+initial+axon+formation+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).</li>
<li>Sakakibara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+centrosome+translocation+and+microtubule+organization+in+neocortical+neurons+during+distinct+modes+of+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization.</a> Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).</li>
<li>Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+microtubule+dynamics+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).</li>
<li>Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+microtubule+dynamics+at+excitatory+presynaptic+boutons+in+primary+hippocampal+neurons+and+acute+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100342(2021).</li>
<li>Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+neck+plasticity+regulates+compartmentalization+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).</li>
<li>Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+CNS+during+development+and+disease%3A+insights+from+in+vivo+and+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell-axonal+growth+cone+interactions+in+neurodevelopment+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 203(2020).</li>
<li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).</li>
<li>Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/">http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</a> (2021).</li>
<li>ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html">http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html</a> (2021).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

האופן שבו אצטרובלים של גדילה חשים ומגיבים לסביבתם כדי לתאם הרחבה והכוונה בו-זמנית של אקסון עדיין נתון לוויכוח 3,18. מחקרים חלוציים במצעים דו-ממדיים סיפקו הצצה למנגנונים המולקולריים הבסיסיים היוצרים את הכוחות המניעים את דינמיקת חרוט הצמיחה במהלך היווצרות אקסון, צמיחה וניווט 2,10,11,12,19. לאחרונה, מחקרים במטריצות תלת-ממדיות חשפו כמה השפעה יש למימד שלישי בהתנהגות של חרוט הצמיחה וכתוצאה מכך בצמיחת אקסון 8,9. עם זאת, המנגנונים המורכבים המנחים את דינמיקת חרוט הצמיחה in vivo עדיין צריכים להיבדק ביסודיות.
הכנת תרביות פרוסות אורגנוטיפיות ממוחות IUE או EUE נמצאת בשימוש נרחב ומתועדת היטב. זה הפך לסטנדרט זהב המאפשר למדענים לקבל תובנות על ההתפתחות וההתנהגות של נוירונים ברקמת המוחהחיה 20,21. ואכן, טכניקה זו נוצלה בהצלחה בשילוב עם טכניקות הדמיה שונות ברזולוציה גבוהה כדי לדמיין תהליכים מולקולריים ספציפיים ואירועים מורפולוגיים באתרם. מחקרים כאלה כוללים, בין היתר, היווצרות אקסון והרחבה19,22, נדידה עצבית בקליפת המוח 19,22,23,24, דינמיקה של סנטרוזומים 25,26, דינמיקה של מיקרוטובול27, כמו גם הדינמיקה התפקודית של תאים טרום-תאיים ופוסט-סינפטיים28,29.
פרוטוקול זה מטפל בפער בנויירוביולוגיה הניסויית, ומדמיין את דינמיקת חרוט הגדילה של התפתחות נוירונים בקליפת המוח באתרם, בתרביות פרוסות מוח חריפות ex vivo , ובכלים לניתוח הנתונים המתקבלים.
תרביות פרוסות מוח חריפות נוצלו כדי לקבוע פרוטוקול זה מכיוון שהן (1) עם תרגול כלשהו, קלות ליצירה; (2) להציג מערכת נגישה לחקר אצטרובלים גדילתיים המוטמעים בסביבה מעין פיזיולוגית מלאה, אך שקופים מספיק כדי לאפשר הדמיה של תאים חיים ברזולוציה גבוהה; (3) ניתן להרחיב לשימושו עם מספר עצום של קווי עכבר מהונדסים; (4) בשילוב עם IUE או EUE, מספקים פוטנציאל כמעט בלתי מוגבל לספק כלים מולקולריים להערכת הביצועים של אצטרובלים ואקסונים של גדילה in vivo תחת משטרי אובדן/רווח של תפקוד, יחד עם כתבים פלואורסצנטיים ובדיקות שלד ציטוסקלטון.
מתודולוגיה זו תוארה בהקשר של EUE ו- IUE. למרות שעדיין מדובר בשיטה אמינה ביותר, EUE הביאה לעלייה בשכיחות של פרוסות מוח שהראו רשת RG לא מאורגנת בהשוואה לאלה שהתקבלו עם IUE כשיטת אספקה (איור 4C). הפרעות במערך RG משפיעות מאוד על הנדידה העצבית ועל דפוס התארכות האקסון30,31. אלה הם פרמטרים מרכזיים המנבאים היכן למצוא אקסונים לניתוח בזמן נתון ואת סוג הסביבה שהם מנווטים בה. פרוסות מוח עם רשת RG משובשת באופן משמעותי בדרך כלל פוגעות בריבוד נוירונים בקליפת המוח. זה, בתורו, מייצר אקסונים עם מסלולים כאוטיים. לכן, מומלץ מאוד לשלוט בשלמות המבנית של רשת RG. באופן מעניין, שלמות מבנית ירודה מתואמת עם גיל מוגבר של המוח העוברי. ואכן, השפעות כאלה בעוברי E12.5-E13.5 צעירים יותר בדרך כלל לא נצפו19.
הפרוטוקול הנוכחי הוא יסודי ופשוט. עם זאת, ישנם כמה צעדים קריטיים שבהם יש לנקוט בזהירות ובתשומת לב מיוחדת כדי להשיג תוצאות אופטימליות. אלה צוינו במפורש בפרוטוקול וכוללים (1) כוונון כמות הדנ"א המשמשת באלקטרופורציה כדי לקבל תיוג דליל; (2) הימנעות מנזק במהלך מיצוי המוח; (3) שליטה בטמפרטורת האגרוז במהלך מעטפת המוח; (4) פתרון בעיות באחוזים האידיאליים של אגרוז עבור מוחות בגיל נתון; ו-(5) בחירה של פלואורופורים, שהניסיון שלהם עוקב אחריהם. במהלך אופטימיזציה של הפרוטוקול, נבדקו הביצועים של מספר פלואורופורים בהדמיית תאים חיים באתרם. גרסאות GFP מונומריות EGFP ו-NeonGreen להכנת הפלסמידים המתויגים של LifeAct ו-Lyn נבחרו לפרוטוקול זה (איור 5A,B). בנוסף, גרסת ה-RFP mScarlet נבדקה ונמצאה מתאימה מאוד למערך זה (הנתונים לא מוצגים). כמו כן נבדקו tRFP (דימר) ו-ZsGreen (טטרמר) (איור 5C ווידאו משלים 1, מימין). פלואורופורים סופר-בהירים אלה המתקפלים במהירות מומלצים כאשר השיטה דורשת יצירת אותות פלואורסצנטיים מהירים לאחר מסירת DNA.
פרקטיקה נפוצה בשימוש בתרביות פרוסות היא שימוש בפרוסות ממוחות שונים כדי לבחון שליטה ומצבי ניסוי. זה מייצג מקור אינהרנטי של שונות לא רצויה. כאן נעשה שימוש במערכת ביטוי המאפשרת שינוי בלתי תלוי של תאי עצב שכנים וביטוי של כתבים לזיהוי. שימו לב שבהדגמה זו (איור 5C), לא היו הבדלים בין תאי עצב המבטאים אף אחד מהפלואורופורים. עם זאת, כדוגמה, תערובת פלסמידים כזו בשילוב עם קו עכברים מהונדס בעל גן רגיש ל-Cre יתויגו עם נוירוני tRFP (רגישים ל-Dre) שנשארו כסוג פראי. לעומת זאת, ה-ZsGreen (גם הוא רגיש ל-Cre) יתייג את הנוירונים הרקומבינציה. לפיכך, אצטרובלים של שני הגנוטיפים השונים, וככל הנראה גם פנוטיפים, יכולים להיחקר זה לצד זה בו זמנית באותה פרוסת מוח.
לוקליזציה של אקסונים ומדוכים צמיחה לניתוח היא שיקול חשוב. נוירונים בקליפת המוח מקוטבים בזמן שהם נודדים באופן רדיאלי מאזור החדר (VZ) לעבר הצלחת בקליפת המוח (CP). במהלך תהליך זה, נוירונים יוצרים תהליך מוביל (דנדריט עתידי) ותהליך נגרר שיהפוך לאקסון, ובסופו של דבר יצטרף לאקסונים חלוציים באזור הביניים (IZ), ויקים דרכי אקסון32. לכן, כדי ללכוד חרוטים של גדילה אקסונאלית, ההדמיה נעשתה על סיבים אקסונאליים ב-IZ, כולל אקסונים היוצאים מה-CP ואקסונים שנוצרו מוקדם שכבר קשורים לחבילות אקסונליות; או בסופו של דבר, בסיבים שחוצים את ה-IZ ומתרחבים מתחתיו (איור 7).
פרוטוקול זה מאפשר לבצע הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד של נוירונים בתוך פרוסות אורגנוטיפיות. מבחינה היסטורית, פיזור אור היה בעיה משמעותית שעמדה בפני הדמיה בעת הדמיה של דגימות עבות. במהלך שני העשורים האחרונים, התקדמות נרחבת בטכנולוגיות אופטיות אפשרה הדמיה של דגימות עבות. כאן, מטרה למרחק עבודה ארוך שימשה כדי לדמיין מבנים קטנים יותר טוב יותר, כגון אצטרובלים צמיחה. באופן בלתי נמנע, פרוטוקול זה אינו לוכד אירועים מפורטים יותר כגון זרימת אקטין מדרדרת או דינמיקה של מיקרוטובול. המטרה למרחק עבודה ארוך, המחייבת צמצם נומרי נמוך יותר (NA), שומרת על מידע מפרוסות עבות. עם זאת, ניתן היה גם להתאים את הפרוטוקול הזה לשימוש עם מטרות של מרחק עבודה קצר יותר. זה דרש העברה חלקה של פרוסות לתבשיל עם תחתית זכוכית כדי לשמור על שלמות המבנה. עם זאת, שימוש בשיטה זו הביא להישרדות קצרה יותר - ~ 15 שעות - עקב אובדן חילופי גזים (נתונים שלא הוצגו). שלא כמו תרבויות דו-ממדיות, אצטרובלים של גדילה בתלת-ממד תופסים נפח גדול יותר ודורשים פיצוי תנועה-תוצר בציר z. כדי להגדיל את היכולת לצלם אירועים מפורטים, יש להשתמש בטכנולוגיה קונפוקלית מודרנית. לכן, מומלץ להשתמש במנוע z-stack בסריקה מהירה, כגון z-Galvo הזמין במיקרוסקופים קונפוקליים רגישים ביותר33.
יש לציין כי פרוטוקול זה מציג שלוש מגבלות עיקריות. ראשית, לעתים קרובות מאתגר לשלוט ברמות הביטוי/מספר התאים המבטאים של כל פלסמיד נתון in vivo. זה מציג שונות בין כל הפרוסות גם כאשר שומרים על אותו ריכוז פלסמיד. לכן, הבחירה של האלמנטים הרגולטוריים בווקטורי הביטוי המשמשים חייבת להיות קבועה מראש בזהירות. שנית, הדמיה של אירועים מפורטים באמצעות תוספות ממברנה אינה אפשרית כיום. ניתן להתגבר על מגבלה שנייה זו עם העדכונים המתודולוגיים שהוצעו בפסקה הקודמת. לבסוף, אצטרובלים גדילה רגישים מאוד לאור ויכולים להפוך במהירות לפומבינציה. לכן, הדמיה תכופה של אצטרובלים גדילה, במשך 5 דקות בלבד באמצעות מיקרוסקופים לסריקת לייזר, יכולה לעתים קרובות למוטט את אצטרובל הצמיחה. בהקשר זה, ניתן להתאים התקדמות חדשה במכשירים שנוצרו במיקרוסקופיה של יריעות אור להדמיה ארוכת טווח של פרוסות המוח34.
פרוטוקולים כאלה צפויים לפתוח אפיקי מחקר חדשים, ולאפשר הבנה טובה יותר של מה שנדרש כדי שחרוט גדילה יקרא ויגיב לעבר סביבת in vivo מורכבת, וחשוב מכך, כדי לפענח את המכניקה של משחק הגומלין המתוחכם הזה.

נוירונים הם תאים מקוטבים מאוד המייצגים את היחידה החישובית הבסיסית במערכת העצבים. הם מקבלים ופולטים מידע המסתמך על מידור של אתרי קלט ופלט: דנדריטים ואקסונים, בהתאמה1. במהלך הפיתוח, אקסונים מתרחבים תוך ניווט בסביבה מורכבת מדהימה כדי להגיע ליעדם. ניווט האקסון מונחה על ידי חרוט הצמיחה, מבנה חושי הממוקם בקצה האקסון המתפתח. חרוט הצמיחה אחראי על איתור רמזים סביבתיים ותרגומם לארגון מחדש מרחבי דינמי של השלד הציטוסקלטוןשלו 2,3. התגובות המורפו-מכניות המתקבלות מורות לחרוט הגדילה להתארך או לסגת מהרמז המפעיל, מה שמוביל לתמרוני אקסון ספציפיים.
ההבנה הנוכחית של הרחבת אקסון ודינמיקת חרוט גדילה נובעת ממחקרים המעריכים צמיחת אקסון על פני מצעים דו-ממדיים (דו-ממדיים) 2,4,5,6,7. מחקרים חלוציים אלה זיהו יחסי גומלין מתוחכמים בין אצטרובלים של גדילה למצעי גדילה וחשפו הבדלים בולטים התלויים במאפייני המצע כגון דבקות וקשיחות 8,9. בהנחיית תובנות אלה, הושערו רמזים סביבתיים חוץ-תאיים כדי להכתיב את צמיחת האקסון, כאשר שלד חרוט הצמיחה ביצע צמיחה זו 2,10,11,12. יש לציין כי נוירונים יכולים להרחיב אקסונים במצעים שאינם דביקים (למשל, פולי-ליזין, פולי-אורניתין)13. יתר על כן, קשיחות המצע יכולה להשפיע על קצב גדילת האקסון ללא תלות בקומפלקסים של דבקות תאים8. לפיכך, חקר דינמיקת חרוט גדילה במצעים דו-ממדיים בלבד אינו יכול להעריך במדויק את מאזן הכוחות הנובעים מהאינטראקציה של אצטרובלים של גדילה אקסונאלית עם סביבות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית, כגון אלה שנמצאו ב- vivo.
כדי להתגבר על המגבלות של המבחנים הדו-ממדיים, נחקרו דינמיקות של צמיחת אקסון וצמיחה של חרוטים במטריצות תלת-ממדיות 8,9. מטריצות אלה מציבות הקשר פיזיולוגי רב יותר, אך מאפשרות לחקור מנגנונים פנימיים של צמיחת אקסון. היא מאפשרת בדיקת חרוט גדילה באופן חד-תאי במגוון מצבים וטיפולים פרמקולוגיים9. בסביבות תלת-ממדיות כאלה, אקסונים הציגו דינמיקה ייחודית של שלד ציטוסקטלי וגדלו מהר יותר מאלו שנצפו בתאי עצב בתרבית דו-ממדית9. מחקרים אלגנטיים אלה הדגימו את השפעתו של ממד נוסף על הארגון מחדש של שלד חרוט הצמיחה, וכתוצאה מכך על התנהגותו.
למרות היתרונות לכאורה שמציגות מטריצות תלת-ממדיות על פני משטחים דו-ממדיים בתמיכה בהתפתחות עצבית דמוית-יליד ובצמיחת אקסון, הן עדיין פיגום סינתטי פשוט שאינו יכול לשקף את המורכבות של הדינמיקה שנצפתה ברקמת מערכת העצבים המרכזית (CNS). כאן, מסירת פלסמידי כתבים על ידי אקס רחם ובאלקטרופורציה של רחם שולבה עם תרבית פרוסות אורגנוטיפיות במוח והדמיה ברזולוציה סופר-רזולוציה חיה באתרה כדי לנתח דינמיקה של חרוט גדילה בהקשר פיזיולוגי. מתודולוגיה זו מאפשרת הדמיה של אקסונים מתפתחים תוך התנסות בתלת-ממדיות של סביבות in vivo ובמורכבות ההרכב הפיזיקוכימי שלהן. לבסוף, מתוארים נהלים ידידותיים למשתמש למדידת צמיחת אקסון ודינמיקת חרוט צמיחה באמצעות תוכנות מורשות וציבוריות נפוצות.

<table><tbody><tr><td>Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>עז נגד עכבר</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>עז נגד עכבר</td></tr><tr><td>נוגדן נגד וימנטין</td><td>סיגמא-Aldrich</td><td>V2258-.2ML</td><td>עכבר חד שבטי, שיבוט LN-6, תוסף נוזל מיימת</td></tr><tr><td>B27</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>Betadine</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Biozym Sieve GP Agarose</td><td>Biozyme</td><td>850080</td><td></td></tr><tr><td>Braunol, Spr&uuml; hflasche</td><td>B. Braun</td><td>3864073</td><td></td></tr><tr><td>בופרנורפין (Temgesic)</td><td>GEHE Pharma</td><td>345928</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMZ חולץ אלקטרודות חד-צדדי</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח חשמלי</td><td>אנדים</td><td>NA</td><td>ProClip UltraEdge דגם סופר 2 מהירויות</td></tr><tr><td>אנרופלוקסצין (Baytril)</td><td>באייר</td><td>3543238</td><td>2,5% (wt/vol)</td></tr> <tr><td>קצות פיפטה של Eppendorf microloader</td><td>FischerScientific</td><td>10289651</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>תכולת צבע &ge; 85%</td></tr> <tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>פיג'י 2.1.0</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>מספריים עדינים</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>ToughCut/Straight/9 ס"מ</td></tr><tr><td>FluoroDish תרבית תאים צלחת</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount הרכבה מימית בינונית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>MedPex</td><td>3705391</td><td>5%</td></tr> <tr><td>תוסף GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td>סידן, מגנזיום, ללא פנול אדום</td></tr><tr><td>סרום סוס</td><td>Pan-Biotech</td><td>P30-0711</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.7.2</td><td>Bitplane</td><td>NA</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Virbac</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח איזוטונית פתרון</td><td>B. Braun</td><td>8609261</td><td>0.90%</td></tr> <tr><td>Leica VT1200 S vibratome</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 עם Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Venusberg Apotheke</td><td>8890217</td><td>5 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>עכברים</td><td>Janvier Labs</td><td>NA</td><td>C57BL/6JRj</td></tr><tr><td>מיקרו-אדסון מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>צנצנת אחסון מיקרופיפטה</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>&nbsp; 16.16.27</td></tr><tr><td>מיקרוסופט אקסל</td><td>מיקרוסופט</td><td>NA</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td></tr><tr><td>תרבית תאים מילי-תאית הכנס</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>30&nbsp; מ"מ, PTFE הידרופילי, 0.4&nbsp; ומיקרו; m</td></tr><tr><td>Moria כפות מחוררות</td><td>Fine Science</td><td>Tools 10370-18</td><td></td></tr><tr><td>Moria Spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium, מינוס פנול אדום</td><td>תוסף ThermoFisher Scientific</td><td>12348017</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan-2</td><td>Pan-Biotech</td><td>P07-11010</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Abcam</td><td>ab138478</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט Olsen-Hegar עם מספריים</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>p-tub-alpha-1-Dre</td><td>Addgene</td><td>133925</td><td></td></tr><tr><td>p-tub-alpha-1-iCre</td><td>Addgene</td><td>133924</td><td></td></tr><tr><td>p-tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td><td>Addgene</td><td>175437</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td><td>Addgene</td><td>175438</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td><td>Addgene</td><td>175257</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle Kit v2</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-ALL</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה פלטינה</td><td>הרווארד</td><td>מכשירים 45-0487</td><td>1 מ"מ / 3 מ"מ</td></tr><tr><td>QIAGEN מקסי קיט</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>רפלקס פצע סגירת קליפ</td><td>World Precision Instruments</td><td>500344-10</td><td>7 מ"מ</td></tr><tr><td>Sekundenkleber Pattex Mini Trio</td><td>Lyreco</td><td>4722659</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורציה גל מרובע ECM830</td><td>הרווארד מכשיר</td><td>W3 45-0052</td><td></td></tr><tr><td>גזה סטרילית</td><td>בראון אסקינה</td><td>9031216</td><td></td></tr><tr><td>משחת עיניים סיכה סטרילית</td><td>Bayer Vital</td><td>PZN1578675</td><td></td></tr><tr><td>כפפות כירורגיות סטריליות</td><td>Sempermed</td><td>14C0451</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>רוט</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>סופרמיד 5-0 תפרי משי כירורגיים</td><td>B. Braun</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית דקים בקיר</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vannas מספריים קפיציים</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 באר זכוכית תחתונה</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

במהלך ההתפתחות העצבית, אקסונים מנווטים בסביבה קליפת המוח כדי להגיע ליעדם הסופי וליצור קשרים סינפטיים. אצטרובלים גדילה - המבנים החושיים הממוקמים בקצות הדיסטליים של פיתוח אקסונים - מבצעים את התהליך הזה. חקר המבנה והדינמיקה של חרוט הגדילה חיוני להבנת ההתפתחות האקסונאלית והאינטראקציות עם מערכת העצבים המרכזית (CNS) הסובבת אותה ומאפשרות לה ליצור מעגלים עצביים. זה חיוני כאשר מתכננים שיטות לשילוב מחדש של אקסונים במעגלים עצביים בעקבות פגיעה במחקר בסיסי ובהקשרים פרה-קליניים. עד כה, ההבנה הכללית של דינמיקת חרוט הצמיחה מבוססת בעיקר על מחקרים של נוירונים שעברו תרבית בשני ממדים (דו-ממדיים). למרות שהם ללא ספק בסיסיים לידע הנוכחי של דינמיקה מבנית של חרוט גדילה ותגובה לגירויים, מחקרים דו-ממדיים מציגים באופן שגוי את הסביבה התלת-ממדית הפיזיולוגית (התלת-ממדית) שבה נתקלים מדוכים של גדילה עצבית ברקמת CNS שלמה. לאחרונה, ג'לים של קולגן שימשו כדי להתגבר על חלק מהמגבלות הללו, מה שאפשר לחקור את ההתפתחות העצבית בתלת-ממד. עם זאת, הן סביבות דו-ממדיות סינתטיות והן סביבות תלת-ממדיות חסרות רמזי איתות בתוך רקמת מערכת העצבים המרכזית, המכוונים את ההרחבה ואת איתור הנתיב של אקסונים מתפתחים. פרוטוקול זה מספק שיטה לחקר אקסונים ואצטרובלים גדילה באמצעות פרוסות מוח אורגנוטיפיות, שבהן אקסונים מתפתחים נתקלים ברמזים פיזיקליים וכימיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. על ידי שילוב של כוונון עדין באלקטרופורציה של רחם ואקס רחם כדי לספק בדלילות כתבים פלואורסצנטיים יחד עם מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד, פרוטוקול זה מציג צינור מתודולוגי להדמיה של דינמיקת אקסון וחרוט גדילה באתרם. יתר על כן, כלול תיאור מפורט של ערכת כלים של ניתוח נתוני הדמיה ארוכי טווח ותאים חיים.

תוצאות מייצגות המתקבלות עם זרימת העבודה של השיטה המתוארת מוצגות. בהדגמה הנוכחית נעשה שימוש בעכברי E15.5, אם כי פרוטוקול זה ניתן להתאמה בקלות כמעט לכל הגילאים העובריים, החל מ-E11 ועד לסוף E17. בפרוטוקול זה, או אלקטרופורציה של רחם לשעבר (EUE; איור 2A, 2C-I) או באלקטרופורציה של רחם (IUE; איורים 2B,C ו-2J-Q) שימשו להעברת פלסמידים לתוך תאי העצב הקדמוניים המצפים את החדרים הצדדיים. אבות אבות אלה הם המקור לתאי עצב מקרינים קליפתיים עתידיים (CPN)15,16. תערובות פלסמיד הוכנו כדי להניע ביטוי דליל וספציפי לנוירון של דינמיקה ממוקדת ממברנה (Lyn)-mNeonGreen (איור 1A) או של LifeAct משופרת (E)GFP (איור 1B) כדי להעריך את ההתנהגות הכוללת ואת הדינמיקה של אקטין במדורי גדילה, בהתאמה. יתר על כן, תערובת פלסמידים שמטרתה לתייג נוירונים בודדים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (ZsGreen) (איור 1C) של טורבו(t)-RFP או zoanthus sp. (ZsGreen) (איור 1C). זה מקל על ניטור של התנהגות חרוט גדילה מתאי עצב שכנים עצמאיים.
כריתת מוח מעוברים אלקטרופוזיים היא צעד מכריע שיש לבצע בזהירות כדי להשיג פרוסות באיכות גבוהה, תוך שמירה על מבנה המוח המקומי. מכשירי דיסקציה וויברטום הוכנו מראש ועוקרו בקפידה אתנול (איור 3A,B). לאחר מכן, ראשי העוברים החשמליים נותחו בקפידה והמוחות הופקו. כאן מוצגת כריתה מייצגת של מוחות מהעוברים שעברו EUE ב-E15 (איור 3C-F) ו-E12.5 (איור 3G-J). מוחות עטופים מיד במטריצת אגרוז, פרוסים ומונחים על ממברנת PTFE בתוך צלחת זכוכית תחתונה לדגירה (איור 3K-M).
המצב הבריאותי של פרוסות המוח הוא נקודה משמעותית לשליטה כדי להבטיח תוצאות אמינות. בדיקה חזותית לכל זיהום בוצעה מדי יום. בנוסף, לאחר שהתרבית הושלמה, פרוסות המוח קבועות ונתונות לאימונוהיסטוכימיה. כאן,4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) שימש כדי לשלוט בארגון התאים הכולל ובכתמי וימנטין כדי לחשוף את ארגון גליה; במיוחד, פיגום גליה רדיאלי (RG). בדרך כלל, פרוסות מוח מתורבתות בהצלחה שמקורן ב-IUE או ב-EUE מראות התפלגות תאית תקינה כפי שהיא מתגלה על-ידי DAPI ומערך מאורגן במקצת של RG עם תהליכי יצירת קשר עם פיאלים בעלי אוריינטציה אפית17 (איור 4A,B בהתאמה). מדי פעם נצפות הפרעות בולטות בפיגומי RG בפרוסות מוח מתורבתות, במיוחד באלה שמקורן באלקטרופורציה של EUE (איור 4C). פרוסות מוח עם פיגום RG לא מאורגן במיוחד מראות נדידה עצבית לקויה וצמיחת אקסון פגומה (לא מוצגת). לפיכך, שליטה בפיגום RG היא שיטה קלה לאחר תרבית כדי למיין את הנתונים המתקבלים מפרוסות מוח אמינות.
פרוסות מוח שמקורן ב-IUE או ב-EUE עם תערובת פלסמידים המבטאת Lyn-mNeonGreen גורמת לסימון דומה של נוירונים דלילים. CPN פירמידאלי מייצג המבטא את Lyn-mNeonGreen ואת ההתנהגות הדינמית של חרוט הצמיחה שלו מוצג כדוגמה (איור 5A ווידאו משלים 1, למעלה משמאל). בנוסף, נוירונים סומנו באמצעות פלסמיד המבטא גשושית אקטין כדי לנתח את הדינמיקה של אקטין של אצטרובלים של גדילה אקסונאלית באתרם (איור 5B וסרטון משלים 1, משמאל למטה). ניסויים באתרם בוצעו גם עם עיצוב פלסמיד בעל ביטוי פלואורופור כפול של Cre/Dre (איור 1C ווידאו משלים 1, מימין). tRFP או ZsGreen fluorophores בפלסמיד זה יכולים להיות מופעלים באופן ספציפי ואינדיבידואלי על ידי רקומבינאזות של Dre או Cre, בהתאמה, בתאי עצב שכנים (איור 5C). מערך ניסיוני זה מאפשר ניתוח זה לצד זה של אצטרובלים גדילה מתאי עצב מבוקרים עם נוירונים מותאמים שכנים (כל אובדן או רווח נתון של תפקוד). זה עוקף את השונות הנובעת מהשימוש בפרוסות שונות לבדיקת תנאי בקרה וניסוי.
קימוגרפים שנוצרו מהסרט המוקלט נותחו, שמהם ניתן להשיג בקלות פרמטרי גדילה דינמיים כגון פעילות בולטת לאורך זמן ואורך גדילה (איור 6A). שימו לב שהתאמה פשוטה ברזולוציה הזמנית של קיטועי הזמן מאפשרת מדידה של מהירות התארכות האקסון במשך 2 שעות (איור 6A). יתר על כן, ניתן להשיג בקלות את השונות של נפח חרוט הצמיחה לאורך זמן - מדד לפעילות דינמית כללית של חרוט גדילה - במקרה זה באמצעות תוכנה מורשית (איור 6B ואיור 6E,F). זה יכול לשמש כדי להעריך את המהירות של הליכון אקטין ואת האיזון של filopodia / lamellipodia במהלך פעילות חקר חרוט גדילה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig01.jpg"> איור 1: סכמות של הפלסמידים המשמשים בפרוטוקול. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. מידע רלוונטי לגבי רכיבי פלסמיד ומקורו של פלואורופור נמצא בקופסאות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig02.jpg"> איור 2: זרימת עבודה של אקס רחם ובהתחשמלות ברחם של עכברי E15.5. (A) הקמת תחנת ניתוח לאלקטרופורציה של רחם לשעבר. (ב) הקמת תחנת ניתוח לאלקטרופורציה ברחם. (C) קרני רחם שנמשכו מחוץ לחלל הבטן של העכבר המרומם. (ד) מיצוי עובר משקע הרחם. (ה) הקרבת עוברים על ידי טרנסקציה מלאה של חוט השדרה באמצעות חתך אלכסוני; שים לב שעריפת ראשים נמנעה. (F) מיקום העובר במחזיק והזרקת תערובת דנ"א/ירוק מהיר לחדר הצדדי השמאלי. (ז,ח) מקם את ראש העובר בין אלקטרודות פינצטה פלטינה עם הקתודה (חץ אדום) מעל קליפת המוח בזווית של 60°. (I) מיקום זרועות העובר (חצים שחורים) מחוץ למחזיק כדי למנוע החלקה של העובר במהלך ההליך. (J) סיבוב העובר בתוך שק הרחם כדי לחשוף את הראש. (ק,ל) הזרקת דנ"א/תערובת ירוקה מהירה לחדרים הצדדיים של העובר דרך דופן הרחם. (M) למקם את ראש העובר בין אלקטרודות פינצטה פלטינה עם קתודה (חץ אדום) מעל קליפת המוח בזווית של 60°. (N) חתך שרירים תפור באמצעות תפר נעילת ריצה. (O) חתך עור תפור באמצעות תפר מופרע. (P) אבטחת הפצע באמצעות קליפסים כירורגיים וחיטוי באמצעות בטאדין. (Q) מיקום העכבר בכלוב ההתאוששות עם אור התחממות אינפרא אדום רחוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig03.jpg"> איור 3: מיצוי של מוחות E15.5 ו-E12.5 והליך תרבית פרוסות אורגנוטיפיות. (A) כלים המשמשים להליך מיצוי המוח. (B) הקמת תחנת תרבות אורגנוטיפית. (ג-ו) מיצוי מוח E15.5. (ג'י-ג') מיצוי מוח E12.5. קווים מנוקדים מדגישים את מיקום החתכים. חצים אדומים מצביעים על כיוון המשיכה על ידי מלקחיים. (K) הטמעת המוח בצלחת של 3 ס"מ המכילה אגרוז נמוך של 3%, ומשאירה מרווח אגרוז של 1-2 מ"מ מתחת למוח. (L) אוסף של פרוסת מוח של 150 מיקרומטר. (M) מיקום פרוסות המוח על קרום PTFE מוסיף משותק בצלחת של 35 מ"מ באמצעות סרט פרפין (חץ כחול). סימון כוכבים אדומים מציין איסוף פרוסות מוח נתון מוויברטום (L) והעברתו לממברנת PTFE (M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig04.jpg"> איור 4: מבנה תאי גליה רדיאליים שמורים בפרוסות אורגנוטיפיות בריאות. תמונות קונפוקליות של פרוסות מוח E17.5 החושפות מערך RG (וימנטין; ירוק) וארגון תאים כולל (DAPI; מגנטה) בעקבות IUE (A) ו- EUE (B,C). שים לב להפרעות החזקות במערך ה- RG שעשויות לנבוע מדי פעם מ- EUE (C). הגדלות מתאימות למסגרות המנוקדות באדום באיור הראשי: סרגלי קנה מידה, 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig05.jpg"> איור 5: הדמיה באתרה של דינמיקת חרוט הצמיחה בפרוסות אורגנוטיפיות חריפות. (א,ב) נוירונים ואצטרובלים הגדילה המתאימים שלהם מסומנים עם Lyn-mNeonGreen ו- LifeAct-GFP, בהתאמה. כוכב אדום המסמן חרוט גדילה של לין-mNeonGreen המבטא נוירון. כוכבית כחולה המסמנת חרוט גדילה של LifeAct-GFP המבטאת נוירון. (C) נוירונים שכנים המסומנים במערכת הפלסמיד הכפולה המכילה tRFP (magenta) ו-ZsGreen (ירוק) ומדובי הגדילה המתאימים להם. אצטרובלים צמיחה שצולמו (מימין) היו מחוץ למסגרת שנלכדה (משמאל), והתקבלו זמן קצר לאחר שרכשו את קונוס הצמיחה; סרגלי קנה מידה, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2.jpg"> איור 6: ניתוח של מהירות גדילת אקסון ונפח חרוט גדילה. (B) שחזור של וידאו z-stack של חרוט גדילה באמצעות תוכנת ניתוח התמונה (למעלה) ואותו חרוט גדילה המודגש באמצעות כלי מדידת המשטחים (להלן). (C) גרפים המראים שינויים במהירות הגדילה לאורך זמן עבור מספר אקסונים. (D) מהירות הצמיחה הממוצעת של אקסונים מכמתת ב-(C). (E) גרף המציג את השינויים בנפח חרוט הצמיחה לאורך זמן. (ו) הנפח הממוצע של אצטרובלים גדלים בכימות ב-(E); סרגל קנה מידה, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig07.jpg"> איור 7: נדידה רדיאלית וקיטוב עצבי של נוירונים בקליפת המוח הפירמידלית. דיאגרמה הממחישה את התפתחותם של נוירונים בקליפת המוח הפירמידלית (ורודה) הנודדים באופן רדיאלי מאזור החדר הנבטי (VZ) לעבר פני השטח של פיה. מונחה על ידי תהליכי גליה רדיאליים (אפור), נוירונים מקוטבים נודדים יוצרים תהליך מוביל, דנדריט עתידי ותהליך נגרר, אקסון עתידי, שממשיכים להתרחב כלפי מטה לכיוון אזור הביניים (IZ). קופסאות אדומות מקווקו מייצגות את האזורים בקליפת המוח שבהם צולמו אצטרובלים של גדילה. באופן ספציפי ב- IZ, אזור תת-חדרי (SVZ), או צרורות אקסון מצטרפים (ירוק). האיור נוצר באמצעות כלי מבוסס אינטרנט, BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פלסמיד</td>
			<td>ריכוז (מיקרוגרם/מיקרול)</td>
			<td>שימוש מיועד</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-STOP-LOX-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>0.25</td>
			<td rowspan="3">תיוג של חלבון ממוקד ממברנה (Lyn)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>0.125</td>
			<td>סימון אקטין נימה (F-אקטין) במדוכים של גדילה</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-rox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="5">תיוג עצמאי של שתי אוכלוסיות של נוירונים שכנים</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-Dre</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: רשימת הפלסמידים המשמשים בפרוטוקול. שם, ריכוז ושימוש מכוון בכל פלסמיד מנוצל.
סרטון משלים 1: הדמיה באתרה של דינמיקת חרוט הצמיחה בפרוסות אורגנוטיפיות חריפות. דינמיקה של אצטרובלים לצמיחה המסומנים ב-Lyn-mNeonGreen (למעלה משמאל) וב-LifeAct-GFP (משמאל למטה). אצטרובלים גדילה שכנים מסומנים באופן דיפרנציאלי עם מערכת הפלסמיד הכפולה המכילה tRFP (מגנטה; מימין למעלה) ו-ZsGreen (ירוק; מימין למטה). מרווח הדמיה, 2.5 שניות. סרגלי קנה מידה, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/Supplementary_Video_1.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה וחזקה לחקר גדילת אקסון באתרו ודינמיקת חרוט גדילה. הוא מתאר כיצד להכין פרוסות מוח חריפות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ex vivo ומספק צינור ניתוח ידידותי למשתמש.

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

כיצד אקסונים מנווטים את מטריצת מערכת העצבים המרכזית המורכבת היא שאלה בסיסית בנויירוביולוגיה. פרוטוקול זה מאפשר לחקור את גדילת האקסון ואת דינמיקת חרוט הצמיחה בסביבה הפיזיולוגית עם הדמיה ברזולוציה גבוהה. פרוטוקול זה מתאר צינור ידידותי למשתמש מקצה לקצה להעברת דנ"א במוח העוברי של העכבר, הכנות לפרוסות אורגנוטיפיות באיכות גבוהה ומדריך צעד אחר צעד לרכישה וניתוח תמונה.למרות שתוכנן במקור לחקור את הדינמיקה של אקסון במערכת העצבים המרכזית העוברית, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לאפשר תרבות אורגנוטיפית והדמיה של פלסטיות אקסון לאחר מצבים טראומטיים או פתולוגיים. הפרוטוקול עצמו פשוט יחסית. עם זאת, השגת הסימון הראשון שלה ושימור של מבנים מוחיים הם נקודות קריטיות.לכן, שלבי האלקטרופורציה, כריתת המוח והחיתוך דורשים טיפול נוסף. הדגמת ההליך תועיל, והדוקטורנטית היא מהמעבדה של Bracket. לאחר שהרדימו עכבר נקבה בהריון, עשו חתך כדי לשלוף את שתי קרני הרחם באמצעות ניצן כותנה ספוג במי מלח חמים או מלקחיים, ותפסו בזהירות את הרווחים בין העוברים.לאחר מכן מניחים את העוברים על גזה רטובה. לאחר חיתוך פתיחת שק הרחם, הסר כל עובר. מניחים את העוברים בצלחת של 10 ס"מ המכילה HBSS בתוספת גלוקוז על קרח.עבור אלקטרופורציה של רחם לשעבר, הרימו עובר והניחו אותו במחזיק. לאחר מכן החדירו בזהירות את נימי הזכוכית המכילים את התערובת הירוקה המהירה של הדנ"א דרך גולגולת העובר לתוך החדר הצדדי, והזיקו שניים עד שלושה מיקרוליטרים של תערובת פלסמיד הדנ"א לכל חדר. לאחר מכן, החזק את ראש העובר בין אלקטרודות פינצטה פלטינה בזווית המתאימה כדי לכוון לאזור המוח הרצוי, כאשר הקתודה פונה לאזור שאליו מיועדת העברת הדנ"א.שכן באלקטרופורציה של רחם, לאחר משיכת קרני הרחם והנחת העוברים על גזה רטובה כפי שהוכח קודם לכן, השתמש בקצות האצבעות כדי לסובב בעדינות את העובר בתוך הרחם עד לאיתור התפרים הלמבדואידליים והסגיטליים. לאחר מכן החדירו בזהירות את נימי הזכוכית המכילים את התערובת הירוקה המהירה של הדנ"א דרך דופן הרחם וגולגולת העובר לתוך החדר הצדדי, והזיקו שניים עד שלושה מיקרוליטרים של תערובת הפלסמידים של הדנ"א לתוך אחד מהחדרים או שניהם לפי הצורך עם מקסימום של שני מיקרוליטרים לכל חדר. לאחר ההזרקה, החזק את ראש העובר בין אלקטרודות פינצטה פלטינה בזווית המתאימה כדי לכוון את אזור המוח הרצוי כאשר הקתודה פונה לאזור שאליו מיועדת העברת הדנ"א.לאחר שכל העוברים הנדרשים עברו אלקטרופורציה, השתמשו בניצן כותנה ספוג מלוח כדי להניח בעדינות את קרני הרחם בחזרה לתוך חלל הבטן. לתפור את חתכי השריר והעור באמצעות 5-0 חומר תפר, ואז לאבטח את הפצע באמצעות קליפסים תפרים, ולחטא את הפצע על ידי ריסוסו עם בטאדין. הניחו את העכבר בחזרה בכלוב ההתאוששות ושמרו על חום באמצעות נורית התחממות אינפרה-אדומה רחוקה למשך 20 דקות לפחות לאחר ההחלמה.לתקן את ראש העובר תחת מיקרוסקופ דיסקציה. לאחר מכן הסר את העור בגולגולת על ידי חיתוך לאורך קו האמצע החל מבסיס הראש לכיוון האף. מקלפים את העור בגולגולת לרוחב ויוצרים מרווח גדול מספיק כדי שהמוח יוסר.לאחר מכן, כדי להסיר את המוח להכניס את הקצה הסגור של מספריים דיסקציה סטרילית מתחילים מתחת לנורת חוש הריח ונעים לכיוון גזע המוח. לאחר מכן חתכו את גזע המוח וחתכו פיסות רבות של קרום המוח בצורה רופפת סביב המוח. באמצעות כפית מחוררת, מרימים את המוח ומסירים את הנוזל העודף על ידי דשדוש תחתית הכף כנגד נייר טישו יבש.לאחר מכן הניחו את המוח בצלחת אגרוזה על קרח. לאחר מכן, באמצעות כפית קטנה יותר מערבבים את האגרוז במשך 10 שניות לקירור אחיד, ואז מתמרנים את המוח לאמצע המנה מניחים אותו אופקית עם הצד הגבי למעלה ומבטיחים שהוא מכוסה לחלוטין באגרוז מכל הכיוונים. הרימו בעדינות את גוש האגרוס מתחנת העבודה של Vibratome ויבשו את החלק התחתון על ידי דשדוש נייר טישו.לאחר מכן הניחו את הבלוק על האזור המודבק של מחזיק הדגימה כשהצד הרוסטרלי של המוח פונה כלפי מעלה, והניחו את מחזיק הדגימה על הקרח. אפשרו לדבק להתייבש למשך דקה אחת. חותכים את המוח לפרוסות קורונליות בזווית של 15 מעלות.לאחר מכן, באמצעות מריתות נקיות, אספו את פרוסות המוח והניחו אותן על קרום PTFE המשותק בצלחת תחתונה מזכוכית בקוטר 35 מילימטרים באמצעות Parrafin. אספו עד חמש פרוסות מוח לכל ממברנה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר מסירים את תמיסת הגלוקוז העודפת HBSS מסביב לפרוסות על הממברנה ומשאירים את הפרוסות יבשות למחצה, ואז מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מדיית פרוסות מוכנות מראש ישירות לחלל שמתחת לממברנה ומדגרים את הפרוסות ב-35 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.להדמיית גדילת אקסון, אתרו אזור קליפת המוח עם צפיפות תאים נמוכה עד בינונית. בעוד להדמיית דינמיקת חרוט גדילה, אתר חרוט גדילה באזור המיידי או באזור התת-חדרי של קליפת המוח. לאחר מכן הגדר גודל מחסנית Z.לצמיחת אקסון בערימת Z גדולה, קבעו גודל צעד של שני מיקרומטרים ועבור מדוכים לצמיחה בערימת Z קטנה יותר, קבעו גודל צעד של מיקרומטר אחד. לניתוח נתונים, פתח את קובץ התמונה בפיג'י על-ידי לחיצה על הקובץ, לאחר מכן פתח ובחירת התמונה. השג את ההקרנה בעוצמה המרבית של חלוף הזמן על ידי לחיצה על התמונה, ואחריה ערימות, הקרנת Z והקרנת עוצמה מקסימלית.עברו את פגרת הזמן ואתרו אקסון הולך וגדל. לאחר המיקום, ציירו קו דרך האקסון הגדל, החל מקצה האקסון במסגרת הראשונה ועקבו אחר האקסון לאורך כל פגרת הזמן. לאחר מכן, שרים את התוסף kymo פרוס מחדש לרוחב.הגדר את קנה המידה של הקימוגרף על ידי מעבר לתמונה, ולאחר מכן מאפיינים. לאחר הגדרת המרחק במיקרומטרים, ורוחב הפיקסלים והזמן בשניות או דקות, וגובה הפיקסל, עבור לניתוח ולחיצה על מדידה. כדי למדוד את עוצמת הקול של חרוט הצמיחה, פתח את קובץ התמונה בתוכנת ניתוח התמונה על ידי לחיצה על קובץ, פתח ובחירת הקובץ המעניין.לאחר מכן, בחר את אשף הוספת משטחים חדשים בשלב הראשון, תחת הגדרות אלגוריתם, בחר מקטע רק אזור מעניין, ובשלב השני, חתך את המסגרת כך שתתאים לכל חרוט הצמיחה בכל המסגרות. בשלב הבא בשלב השלישי, שמור על הסף בעוצמה מוחלטת ובשלב הרביעי, ודא שכל אזור חרוט הצמיחה נמצא בסף. ואז בשלב החמישי, תחת סוג מסנן בחר מספר voxels LMG לאחד.בחר בלחצן הפעלה כדי לבצע את כל שלבי היצירה וסיים את אשף הוספת משטחים חדשים. לבסוף, בכרטיסיה נתונים סטטיסטיים בחלק העליון של חלון האשף, בחר ערכים ונפח ספציפיים תחת הכרטיסייה המפורטת. בדרך כלל, פרוסות מוח מתורבתות בהצלחה שמקורן באלקטרופורציה של רחם או אקס רחם מראות התפלגות תאית תקינה ומערך מאורגן של גליה רדיאלית עם תהליכי מגע פילו מכוונים.לעיתים נצפו אלקטרופורציה של אקס רחם המסומנת בהפרעות בפיגומי הגליה הרדיאליים ובפרוסות המוח המתורבתות, מה שהופך את צביעת הבקרה הזו לזמינה. נוירון פירמידאלי מקרין קליפת המוח הייצוגי המבטא את Lyn-mNeonGreen ואת ההתנהגות הדינמית של חרוט הגדילה שלו מוצג כאן. בנוסף, תאי עצב סומנו באמצעות גשושית פלסמיד המבטאת אקטין כדי לנתח את הדינמיקה של אקטין של אצטרובלים של גדילה אקסונאלית באתרם.ניסויים באתרם בוצעו גם עם פלואורופור כפול של cre dre המבטא תכנון פלסמידי, שבו tRFP או ZsGreen fluorophores יכולים להיות מופעלים באופן ספציפי ובנפרד על ידי רקומבינאזות dre או cre, בהתאמה בתאי עצב שכנים. מתוך קימוגרפים, פרמטרי צמיחה דינמיים כגון מהירות גדילה עבור מספר אקסונים ונפח חרוט גדילה לאורך זמן מתקבלים בקלות. ניתן להשתמש בכך כדי להעריך את המהירות של הליכון אקטין ואת האיזון בין פילופודיה ללמלפודיה במהלך פעילות חקר חרוט גדילה.חשוב לשמור על מבנה המוח ולכוונן את ריכוזי הפלסמידים כדי להשיג תיוג דליל. זה חיוני להדמיה מדויקת של אקסונים ומדוכים גדילה בקליפת המוח. בהתאם לפלזמות הנבחרות ולרקע הגנטי, פרוטוקול זה מאפשר למשתמשים לשנות נוירונים או את הסביבה שבה הם גדלים ומאפשר מגוון רחב של מחקרים.על ידי מתן גישה ברזולוציה גבוהה לנוירונים באתרם, טכניקה זו מאפשרת למדעני מוח לחקור את האינטראקציה הדינמית בין אצטרובלים גדילה לבין מדדי מערכת העצבים המרכזית הן ברמה המורפולוגית והן ברמה המולקולרית.

in-situ-visualization-axon-growth-growth-cone-dynamics-acute-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מציגים שיטה להכין פרוסות organotypic של אמצע ההיריון עוברי עכברים הדמיה טיפוח זמן לשגות תולדה של עצבים היקפיים.

פורסים תרבות Organotypic של ה-GFP-לבטא עוברי עכברים עבור הדמיה בזמן אמת תולדה של עצבים היקפיים

פרוטוקול זה מתאר assay פרוסה organotypic אופטימיזציה עבור המוח לאחר הלידה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות הדמיה של הגירה neuroblast בזרם נודדות מקורי.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

סרטון זה מדגים את תרבית ex vivo והדמיה של פרוסות אוקולומוטוריות מעוברי עכברים טרנסגניים. העוברים מבודדים ומוטבעים באגרוז. באמצעות ויברטום, פרוסות המכילות את גרעיני oculomotor ואת העיניים מתקבלים. הפרוסות נשמרות בתרבית ומצולמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תרבית Ex Vivo והדמיה של פרוסות אוקולומוטוריות מעוברי עכברים טרנסגניים

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  הדמיה קונפוקלית של נוירונים נודדים בתרבית פרוסה אורגנוטיפית של מוח עכבר עוברי באמצעות In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) סרטון זה מדגים מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן-lapse כדי לצפות בנדידה רדיאלית של נוירונים בקליפת המוח מהאזור התת-חדרי לצלחת קליפת המוח באמצעות פיגומי גליה רדיאליים בפרוסות מוח עובריות של עכבר.

הדמיית זמן-lapse של נדידה רדיאלית של נוירונים בקליפת המוח בפרוסות מוח עובריות של עכבר

הגירת neuroblast היא אירוע מהותי בנוירוגנזה לאחר לידה. אנו מתארים פרוטוקול תיוג יעיל של neuroblasts ידי in vivo electroporation לאחר לידה ולאחר מכן להדמיה של ההגירה שלהם באמצעות זמן לשגות הדמיה של פרוסות מוח חריפות. אנו כוללים תיאור לניתוח כמותי של דינמיקת neuroblast ידי מעקב וידאו.

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

טכניקות מיקרוסקופ אור בשילוב עם מבחנים ביוכימיים מבהירים את המעורבות של אקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסונים תלויי נטרין. שילוב טכניקות זה מאפשר זיהוי של מנגנונים מולקולריים השולטים בהסתעפות האקסון ובשינוי צורת התא.

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

פרוטוקול זה מספק הוראות תצפית ישירה של נוירונים קליפת המוח נודדת. ב electroporation ברחם , תרבות פרוסות organotypic, הדמיה confocal זמן לשגות משולבים ישירות באופן דינמי ללמוד את ההשפעות של overexpression או downregulation של גנים של עניין נודדים נודדות ולנתח את ההבחנה שלהם במהלך הפיתוח.

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להמחשת הקרנה מוטור נוירון, האקסון arborization ב הטרנסגניים Hb9::GFP העכבר עוברי. לאחר immunostaining עבור מוטורי לגלוקוז, השתמשנו גיליון אור זריחה מיקרוסקופ כדי התמונה עוברי עבור ניתוח כמותי עוקבות. פרוטוקול זה חל תהליכים ניווט אחרים תא עצב במערכת העצבים המרכזית.

ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

הvivo לשעבר פרוסה מאפשרת העצב outculמניע העצבים כדי להיות בתמונה בזמן אמת. פרוסות מופקים על ידי הטבעת e 10.5 איי. איי. או. עוברי העוברים ב-agarose, הפרוסות על הרטט, וגדלים בחממה בשלב העליון. התפקיד של מסלולים הדרכה אקסון מוערך על ידי הוספת מעכבי התקשורת התרבות.

לשעבר Vivo Oculomotor ניע את התרבות של מעובריים GFP-הביע עכברים עבור זמן הדמיה של מניע העצבי החיצוני

למד שיטת הדמיה ברזולוציה גבוהה לחקר דינמיקת גדילת חרוטי אקסון וצמיחתם במוח עוברי עכברים. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח התנהגות אקסונים בהקשר פיזיולוגי ומסייע בחקירת מנגנוני פלסטיות עצבית.

באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות

גלה סרטונים נוספים