Name: הזרקת תאי אוסטאוסרקומה אינטראטיביאלית להפקת אוסטאוסרקומה אורתוטופית ומודלים של עכבר גרורות ריאות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: למד כיצד ליצור מודלים עכבריים לאוסטאוסרקומה ראשונית וגרורות ריאתיות באמצעות הזרקה תוך-שוקית של תאי אוסטאוסרקומה. שיטה זו מחקה את מאפייני ההתפתחות הקליניים של הגידול ומאפשרת חקר התנהגות הגידול ובדיקת טיפולים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ(1) תוכנית מו"פ המפתח הלאומית של סין (2018YFC1704300 ו-2020YFE0201600), (2) הקרן הלאומית למדעי הטבע (81973877 ו-82174408).

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים של אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית. עכברי BALB/C אתיקמיים זכרים בני ארבעה שבועות התאקלמו במשך שבוע לפני הניתוח להזרקה אורתוטופית של תאי אוסטאוסרקומה. עכברים שוכנו בכלובי עכברים מאווררים בנפרד עם חמישה עכברים לכלוב במחזור אור / כהה של 12 שעות עם גישה לליביטום מודעה להזנת SPF ומים סטריליים.
1. הכנת תאים
<ol><li>ביום של תא osteosarcoma (143B-לוציפראז) הזרקה, לשטוף 80%-90% תאים רציפים בתרבית צלחת תרבית תא 10 ס"מ פעמיים עם PBS (pH 7.4) ו trypsinize עם 1.5 מ"ל של 0.25% טריפסין במשך 3 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 6 מ"ל של 10% מדיה MEM המכילה סרום כדי להרוות את הטריפסין, ולאסוף את התאים בצינור צנטריפוגות של 15 מ"ל. הערה: קו תא 143B-לוציפראז מתקבל מקו תא 143B transfect עם וקטור pLV-לוציפראז23.</li>
	<li>שאפו 20 μL של השעיית תאים לתוך החדר של צלחת ספירת תאים ולחשב ריכוז תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>צנטריפוגה התאים ב 800 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשאוף את supernatant עם פיפטה resuspened את גלולה התא במטריצת קרום מרתף 8.5 מ"ג / מ"ל (ראה טבלת חומרים) לריכוז סופי של 2 x 107 תאים / מ"ל.</li>
	<li>שמירה על התאים על קרח, להביא אותם לחדר הניתוח. יש להשתמש בתאים בתוך 2 שעות. הערה: כדי למנוע מינונים הזרקה לא מדויקים (לדוגמה, בשל החלל המת במזרקים), השעיית תא נוספת מוכנה (בדרך כלל פעמיים את הנפח הנדרש של השעיית התא). מטריצת ממברנת המרתף נשמרת על קרח כל הזמן מכיוון שיש לה מאפיין קרישה מעל טמפרטורת החדר24.</li>
</ol>2. ניתוח להזרקה אורתוטופית של תאי האוסטאוסרקומה
הערה: כלי הניתוח מוצגים באיור 1.
<ol><li>עכברים גודלו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן. כל ההליכים נעשו בארון אספטי עם כלים סטריליים.</li>
	<li>להרדים את העכברים על ידי חשיפתם 2% איזופלוריין ו 98% חמצן (קצב זרימת חמצן, 2 L / min).</li>
	<li>החל כמות קטנה של משחה עיניים על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה. הערה: בצע את ההליך כולו באזור מאוורר היטב. לפני הזרקת תאי אוסטאוסרקומה, ודא כי כל עכבר נמצא תחת הרדמה עמוקה על ידי צביטת בוהן; אם לעכבר עדיין יש תגובות, כגון עווית או אידיוט, המתן זמן רב עד שהתגובות לעיל ייעלמו.</li>
	<li>שמור כל עכבר בתנוחה סופית. החזק את הקרסול של העכבר באמצעות האגודל והאצבע המורה ולחטא את אתר ההזרקה של השוקה עם 70% ספוגית אתנול. הערה: כדי להחזיק בחוזקה את קרסול העכבר, הן את האגודל והן את קצות האצבעות הן בעלות חשיבות רבה עבור ההליכים הבאים.</li>
	<li>סובבו את מפרק הקרסול של כל עכבר כלפי חוץ כדי להזיז את השוקה והשוקית, וכופפו את מפרק הברך למצב מתאים עד שרמת השוקה הפרוקסימלית (החלק העליון של השוקה) נראית בבירור דרך העור (איור 2A).</li>
	<li>חבר את המחט למזרק 1 מ"ל וכוון את קצה המחט לכיוון אתר ההזרקה. ודא כי מחט המזרק מקבילה לציר הארוך של השוקה.<ol>
<li>באופן מלעורי להכניס את המחט דרך או בסמוך לרצועה פיקת הברך כפי שהוא עובר דרך העור / כמוסת המפרקים; th0en, לסובב את המזרק (1/2 עד 3/4-עיגול) כדי לקדוח חור דרך פלטפורמת השוקה לכיוון הקצה הדיסטלי של השוקה (חלל medullary) להזרקת תאי אוסטאוסרקומה עם מזרק מיקרו נפח (איור 2B, C). הערה: סיבוב סימולטני של השוקה יכול להיות מורגש בעת הקידוח אם קצה המחט מדויק. ודא את הצורך נע קדימה עם סיבוב המזרק במקום להידחף ישירות קדימה עד כמחצית המחט הוא בשוקה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בדוק אם מחט המזרק עשתה תנועה בולטת לתוך תעלת medullary כדי להבטיח קידוח מוצלח. הערה: בצע בדיקת רנטגן (ראה טבלת חומרים) כדי לאשר את המיקום הנכון של המחט ולאסוף את התמונות.</li>
	<li>טען את ההשעיה של תאי אוסטאוסרקומה 143B (משלב 1.5) למזרק מיקרו-נפח והחלף את מזרק 1 מ"ל בשוקה במזרק מיקרו-נפח טעון בתא 143B (איור 2D). להזריק לאט ~ 10 μL (להתעלם פתרון קיים מראש במחט) של השעיית תא 143B לתוך השוקה של כל עכבר אתימי (כ 2 x 105 תאים) מבלי להפעיל לחץ גבוה.</li>
	<li>לחץ על אתר ההזרקה עם ספוגית כותנה במשך 20-30 שניות כאשר מזרק מיקרו נפח מוסר.</li>
	<li>מחזירים כל עכבר לכלוב נקי ומפקחים מקרוב עד שהעכבר מתאושש לחלוטין מהרדמה (כ-10 דקות).</li>
	<li>נטר את הגידול ב-vivo באמצעות מערכת הדמיית רנטגן. מדוד את הקוטר הארוך יותר (א) ואת הקוטר הקצר (ב) של מסת הסרטן מדי שבוע עם קליפר לחישוב נפח הגידול (V): V = 1/2 x a x x b2. הערה: להרדים את העכברים על ידי חשיפתם 2% איזופלוריין ו 98% חמצן. העכברים היו מורדמים להדמיית רנטגן. הזרקת אינטרטיביה של לוציפראז או חלבון פלואורסצנטי המסומן כתאי אוסטאוסרקומה מאפשרת מעקב אחר נגעי אוסטאוסרקומה ראשוניים ומטאסטטיים. הערה: נקודות קצה הומאניות של העכברים עם אוסטאוסרקומה עקב גידול של גרורות הברך והריאות התבססו על הקריטריונים הבאים: (1) ציון מצב הגוף, (2) סף הרזיה של 20%, (3) קוטר מקסימלי ממוצע של גידולים של 2 ס"מ, או (4) התנהגות בעלי חיים מוגבלת מאוד.</li>
</ol>3. בדיקה פתולוגית (איסוף דגימת אוסטאוסרקומה גרורתית ראשונית וריאותית לניתוח)
<ol><li>שישה שבועות לאחר הזרקת תאי אוסטאוסרקומה, להקריב את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם לאחר חשיפתם עבור שאיפת CO2 .</li>
	<li>שמור את העכבר בתנוחה סופית ולמתוח את שתי הגפיים האחוריות.</li>
	<li>הפרד את כל הרגליים הנושאות אוסטאוסרקומה מאזור המפשעה. הערה: ודא שכל הרגליים מופרדות מאותו אתר אנטומי.</li>
	<li>הכן את הדגימה היסטולוגית של רגליים הנושאות אוסטאוסרקומה על ידי הסרת העור, השרירים והרגליים, ולאחר מכן תקן את הדגימה של כל עכבר בצינור 50 מ"ל עם פתרון פורמלין של 20 מ"ל (10%) למשך 24 שעות, ואחריו הסרה בפתרון 10% EDTA למשך 14 ימים עם שינוי חיץ מזדמן.</li>
	<li>הטמע את הדגימה בפרפין והכן מדורים לבדיקה היסטולוגית לאחר עבודה25 שפורסמה בעבר.</li>
	<li>להפריד בעדינות את הריאות ולשים אותם לתוך צינור 50 מ"ל מלא פתרון פורמלין 20 מ"ל (10%). לאחר 24 שעות, להעביר את הריאות של כל עכבר לתוך צינור 15 מ"ל עם 70% אתנול. הטמע את הריאות בפרפין עבור המטוקסילין ואאוזין (H&E) מכתים ומבחן אימונוהיסטוכימיה25.</li>
</ol>

<ol><li>Bielack, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+in+high-grade+osteosarcoma+of+the+extremities+or+trunk%3A+an+analysis+of+1%2C702+patients+treated+on+neoadjuvant+cooperative+osteosarcoma+study+group+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols.</a> Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+microenvironment+and+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), (2020).</li>
<li>Mirabello, L., Troisi, R. J., Savage, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+incidence+and+survival+rates+from+1973+to+2004%3A+data+from+the+Surveillance%2C+Epidemiology%2C+and+End+Results+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program.</a> Cancer. 115 (7), 1531-1543 (2009).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+and+safety+comparison+of+first-line+chemotherapeutic+agents+%28high-dose+methotrexate%2C+doxorubicin%2C+cisplatin%2C+and+ifosfamide%29+for+osteosarcoma%3A+a+network+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">The efficacy and safety comparison of first-line chemotherapeutic agents (high-dose methotrexate, doxorubicin, cisplatin, and ifosfamide) for osteosarcoma: a network meta-analysis.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 51(2020).</li>
<li>Tsukamoto, S., Errani, C., Angelini, A., Mavrogenis, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+treatment+considerations+for+osteosarcoma+metastatic+at+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Orthopedics%22%5BJournal%5D)">Current treatment considerations for osteosarcoma metastatic at presentation.</a> Orthopedics. 43 (5), 345-358 (2020).</li>
<li>Aljubran, A. H., Griffin, A., Pintilie, M., Blackstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+in+adolescents+and+adults%3A+survival+analysis+with+and+without+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma in adolescents and adults: survival analysis with and without lung metastases.</a> Annals of Oncology. 20 (6), 1136-1141 (2009).</li>
<li>Ek, E. T., Dass, C. R., Choong, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonly+used+mouse+models+of+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Commonly used mouse models of osteosarcoma.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).</li>
<li>Castillo-Tandazo, W., Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+in+the+post+genome+era%3A+Preclinical+models+and+approaches+to+identify+tractable+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma in the post genome era: Preclinical models and approaches to identify tractable therapeutic targets.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (5), 343-352 (2019).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+immunology+and+immunotherapy+of+canine+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1258, 199-221 (2020).</li>
<li>Cobb, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+osteosarcoma+in+the+rat+as+a+model+for+osteosarcoma+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced osteosarcoma in the rat as a model for osteosarcoma in man.</a> British Journal of Cancer. 24 (2), 294-299 (1970).</li>
<li>Walkley, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+mouse+osteosarcoma%2C+dependent+on+p53+loss+and+potentiated+by+loss+of+Rb%2C+mimics+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Conditional mouse osteosarcoma, dependent on p53 loss and potentiated by loss of Rb, mimics the human disease.</a> Genes & Development. 22 (12), 1662-1676 (2008).</li>
<li>Entz-Werlé, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+apc%3Btwist+double-mutant+mice%3A+a+new+model+of+spontaneous+osteosarcoma+that+mimics+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Targeted apc;twist double-mutant mice: a new model of spontaneous osteosarcoma that mimics the human disease.</a> Translational Oncology. 3 (6), 344-353 (2010).</li>
<li>Erstad, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+and+heterotopic+murine+models+of+pancreatic+cancer+and+their+different+responses+to+FOLFIRINOX+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+for+osteosarcoma+in+the+mouse%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs for osteosarcoma in the mouse: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 7 (51), 85650-85674 (2016).</li>
<li>Maloney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratibial+injection+causes+direct+pulmonary+seeding+of+osteosarcoma+cells+and+is+not+a+spontaneous+model+of+metastasis%3A+A+mouse+osteosarcoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Intratibial injection causes direct pulmonary seeding of osteosarcoma cells and is not a spontaneous model of metastasis: A mouse osteosarcoma model.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).</li>
<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+reproducible+osteosarcoma+rat+model+using+orthotopic+implantation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique.</a> Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).</li>
<li>Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+is+essential+for+the+selection%2C+growth+and+metastasis+of+human+renal+cell+cancer+in+nude+mice+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected].</a> Cancer Metastasis Reviews. 9 (2), 149-165 (1990).</li>
<li>Leacock, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+transgenic+model+of+Ewing%27s+sarcoma+reveals+conserved+mediators+of+EWS-FLI1+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 95-106 (2012).</li>
<li>Sharma, S., Boston, S. E., Riddle, D., Isakow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+of+the+proximal+tibia+in+a+dog+6+years+after+tibial+tuberosity+advancement%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma of the proximal tibia in a dog 6 years after tibial tuberosity advancement.</a> The Canadian Veterinary Journal. 61 (9), 946-950 (2020).</li>
<li>Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+human+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for human osteosarcoma.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 221-236 (2014).</li>
<li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cantharidin+inhibits+osteosarcoma+proliferation+and+metastasis+by+directly+targeting+miR-214-3p%2FDKK3+axis+to+inactivate+%CE%B2-catenin+nuclear+translocation+and+LEF1+translation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cantharidin inhibits osteosarcoma proliferation and metastasis by directly targeting miR-214-3p/DKK3 axis to inactivate β-catenin nuclear translocation and LEF1 translation.</a> International Journal of Biological Sciences. 17 (10), 2504-2522 (2021).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphyllin+I+suppresses+human+osteosarcoma+growth+by+inactivation+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+pathway+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Polyphyllin I suppresses human osteosarcoma growth by inactivation of Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7605(2017).</li>
<li>Lamar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRC+tyrosine+kinase+activates+the+YAP%2FTAZ+axis+and+thereby+drives+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).</li>
<li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. , 3-18 (2014).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrine+inhibits+prostate+cancer+via+activation+of+the+unfolded+protein+response%2Fendoplasmic+reticulum+stress+signaling+and+reversal+of+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition.</a> Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).</li>
<li>Fridman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+tumor+growth+of+both+primary+and+established+human+and+murine+tumor+cells+in+athymic+mice+after+coinjection+with+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel.</a> Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).</li>
<li>Kocatürk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e51967(2015).</li>
<li>Paschall, A. V., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54040(2016).</li>
<li>Hildreth, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+primary+bone+tumors+and+bone+metastasis+with+solid+tumor+graft+implantation+into+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61313(2020).</li>
<li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Models of bone metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4260(2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הזרקה אורתוטופית של תאי אוסטאוסרקומה היא מודל אידיאלי לחקר הפונקציה והמנגנון של גורמים ספציפיים ב- osteosarcoma carcinogenesis ופיתוח כדי להעריך את היעילות הטיפולית. כדי למנוע הבדלים בצמיחת הגידול, רוב תאי האוסטאוסרקומה הפעילים ב 80%-90% במפגש עם אותו מספר מוזרקים בקפידה לתוך השוקה של כל עכבר, וזמן טריפסיניזציה התא נשלט בקפדנות מבלי להשפיע על הכדאיות של התא. כמו גושי תאים להשפיע על ספירת תאים המובילים מספרי תאים לא מדויקים מוזרק לתוך השוקה של כל עכבר, ההשעיה התא צריך להיות מעורב כראוי למעלה ולמטה עם פיפטה כדי למנוע היווצ...

אוסטאוסרקומה היא סרטן העצמות העיקרי הנפוץ ביותר בקרב ילדים ומתבגרים 1,2, אשר בעיקר חודר לרקמה שמסביב, ואפילו גרורות לריאות כאשר החולים מאובחנים. גרורות ריאתיות הן האתגר העיקרי לטיפול באוסטיוסרקומה, ושיעור ההישרדות של חמש שנים של חולי אוסטאוסרקומה עם גרורות ריאתיות נשאר נמוך כמו 20%-30%-30%3,4,5. עם זאת, שיעור ההישרדות של חמש שנים של אוסטאוסרקומה ראשונית הוגדל לכ -70% מאז שנות השבעים עקב כניסתו של כימותרפיה6. לכן, יש צורך דחוף כדי להבין את המנגנון הבסיסי של אוסטאוסרקומה קרצינוגנזה וגרורות ריאתיות לפתח טיפולים חדשניים. היישום של מודלים עכבר המחקים בצורה הטובה ביותר את התקדמות osteosarcoma בבני אדם הוא בעל משמעות רבה7.
מודלים בעלי חיים osteosarcoma נוצרים על ידי ספונטני, המושרה הנדסה גנטית, השתלה, וטכניקות אחרות. מודל האוסטאוסרקומה הספונטני משמש לעתים רחוקות בשל זמן היווצרות הגידול הארוך, שיעור התרחשות הגידול הלא עקבי, תחלואה נמוכה ויציבות ירודה 8,9. למרות מודל osteosarcoma המושרה נגיש יותר להשיג מאשר osteosarcoma ספונטני, היישום של מודל osteosarcoma המושרה מוגבל כי הגורם המעורר ישפיע על microenvironment, הפתוגנזה, ואת המאפיינים הפתולוגיים של osteosarcoma10. מודלים מהונדסים עוזרים להבין את הפתוגנזה של סרטן שכן הם יכולים לדמות טוב יותר את הסביבות הפיזיולוגיות והפתולוגיות האנושיות; עם זאת, מודלים בעלי חיים מהונדסים יש גם את המגבלות שלהם בשל הקושי, לטווח ארוך, ועלות גבוהה של שינוי מהונדס. יתר על כן, אפילו במודלים המקובלים ביותר של בעלי חיים מהונדסים שנוצרו על ידי p53 ושינוי גנים Rb, רק 13.6% מהסרקומה התרחשה בארבע עצמות הגפיים11,12.
השתלה היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לייצור מודלים גרורתיים גרורתיים ראשוניים ורחוקים בשנים האחרונות בשל התמרון הפשוט שלה, קצב היווצרות הגידול היציב והומוגניותטובה יותר 13. ההשתלה כוללת השתלה הטרוטופית והשתלות אורתוטופיות על פי אתרי ההשתלה. בהשתלה הטרוטופית של אוסטאוסרקומה, תאי האוסטאוסרקומה מוזרקים מחוץ לאתרי האוסטאוסרקומה העיקריים (עצם) של בעלי החיים, בדרך כלל מתחת לעור, תת עורית14. למרות ההשתלה ההטרוטופית היא פשוטה ללא צורך לבצע ניתוח בבעלי חיים, האתרים שבהם תאי osteosarcoma מוזרקים אינם מייצגים את המיקרו-סביבה של אוסטאוסרקומה אנושית בפועל. השתלה אורתוטופית אוסטאוסרקומה היא כאשר תאי האוסטאוסרקומה מוזרקים לעצמות של בעלי חיים, כגון שוקה15,16. בהשוואה לשתלים ההטרוטופיים, שתלי אוסטאוסרקומה אורתוטופיים מאופיינים בתקופת דגירה קצרה, צמיחה מהירה ואופי שוחק חזק; לכן, הם מודלים בעלי חיים אידיאליים עבור מחקרים הקשורים osteosarcoma17.
בעלי החיים הנפוצים ביותר הם עכברים, כלבים ודגי זברה18,19. המודל הספונטני של osteosarcoma משמש בדרך כלל בכלבים כי osteosarcoma הוא אחד הגידולים הנפוצים ביותר בכלבים. עם זאת, היישום של מודל זה מוגבל בגלל זמן היווצרות הגידול הארוך, שיעור הגידול הנמוך, הומוגניות ירודה ויציבות. דגי זברה משמשים לעתים קרובות לבניית מודלים מהונדסים או נוקאאוט גידול בגלל הרבייה המהירה שלהם20. אבל גנים של דגי זברה שונים מהגנים האנושיים, ולכן היישומים שלהם מוגבלים.
עבודה זו מתארת את ההליכים המפורטים, אמצעי זהירות, ותמונות מייצגות לייצור osteosarcoma העיקרי בשוקה עם גרורות ריאתי באמצעות הזרקת intratibia של תאי osteosarcoma בעכברים אתימיים. שיטה זו יושמה כדי ליצור את osteosarcoma העיקרי בשוקת העכבר להערכת יעילות טיפולית, אשר הראה רבייה גבוהה21,22.

<table><tbody><tr><td>מונה תאים אוטומטי</td><td>שנחאי סימו ביולוגי טכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>IC1000</td><td>ספירת תאים</td></tr><tr><td>מכונת הרדמה</td><td>שנזן RWD חיים טכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>R500IP</td><td>הציוד של עכברי הרדמה</td></tr><tr><td>BALB / c עכברים אתימיים</td><td>שנחאי SLAC מעבדה בעלי חיים ושות', בע"מ</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>מטריצת קרום מרתף</td><td>בעלי חיים שנחאי Uning Bioscience Technology Co., Ltd</td><td>356234, BD, Matrigel</td><td>תאי מתלה מחדש</td></tr><tr><td>מערכת הדמיה ביולומינסנציה</td><td>שנחאי Baitai Technology Co., Ltd</td><td>Vieworks</td><td>עוקבת אחר צמיחת הגידול וגרורות ריאתיות, אם תא ההזרקה מסומן על ידי</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה לוציפראז (15 מ"ל)</td> <td>שנחאי YueNian ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>&nbsp; 430790,</td><td>צנטריפוגה</td>קורנינג התאים</tr><tr><td>isoflurane</td><td>שנזן RWD חיים טכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>VETEASY</td><td>עכברי הרדמה</td></tr><tr><td>MEM מדיה</td><td>שנחאי YueNian ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>LM-E1141</td><td>תרבית תאים בינונית</td></tr><tr><td>מזרק מיקרו נפח</td><td>שנחאי תעשיית יונים גבוהה ומסחר ושות', בע"מ</td><td>0-50 &mu; L</td><td>להזריק תאים מדויקים לתוך השוקה</td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאגר</td><td>פוספט Beyotime Biotechnology</td><td>ST447</td><td>לשטוף את תאי האוסטאוסרקומה האנושיים</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרקים</td><td>שאנדונג Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd</td><td>קידוח 20200411</td><td></td></tr><tr><td>קו תאים 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td>קו תאים אוסטאוסרקומה</td></tr><tr><td>טריפסין (0.25%)</td> <td>שנחאי YueNian ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>25200056, טיפול</td><td>בטריפסין של Gibco בתאים</td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>ST798</td><td>צביעת תאים להערכת</td></tr><tr><td>וקטור פעילות (pLV-luciferase)</td> <td>שנחאי YueNian ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>VL3613</td><td>פלסמיד</td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>שנחאי YueNian ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>11668027, תרמו פישר</td><td>מגיב פלסמיד</td></tr><tr><td>הדמיית רנטגן מערכת</td><td>ברוק (בייג'ינג) טכנולוגיה ושות', בע"מ</td> FX <td>PRO</td><td>תמונות רנטגן התקבלו כדי לזהות צמיחת גידול</td></tr></tbody></table>

הזרקת תאי אוסטאוסרקומה אינטראטיביאלית להפקת אוסטאוסרקומה אורתוטופית ומודלים של עכבר גרורות ריאות

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

Osteosarcoma הוא סרטן העצם העיקרי הנפוץ ביותר אצל ילדים ומתבגרים, עם ריאות כאתר גרורתי הנפוץ ביותר. שיעור ההישרדות של חמש שנים של חולי אוסטאוסרקומה עם גרורות ריאתיות הוא פחות מ -30%. לכן, השימוש של מודלים עכבר מחקה את התפתחות osteosarcoma בבני אדם הוא בעל משמעות רבה להבנת המנגנון הבסיסי של קרצינוגנזה osteosarcoma וגרורות ריאתי לפתח טיפוליים חדשניים. כאן, נהלים מפורטים מדווחים כדי ליצור את מודלים עכבר גרורות אוסטאוזרקומה ריאות העיקרי באמצעות הזרקת intratibia של תאי osteosarcoma. בשילוב עם bioluminescence או מערכת הדמיה חיה רנטגן, מודלים אלה עכבר חי מנוצלים כדי לפקח ולכמת את צמיחת osteosarcoma וגרורות. כדי להקים מודל זה, מטריצת קרום מרתף המכילה תאי osteosarcoma נטען במזרק מיקרו נפח והוזרק לתוך שוקה אחת של כל עכבר אתימי לאחר שהיה מורדם. העכברים הוקרבו כאשר האוסטאוסרקומה העיקרית הגיעה למגבלת הגודל בפרוטוקול שאושר על ידי IACUC. הרגליים הנושאות אוסטאוסרקומה והריאות עם נגעי גרורות הופרדו. מודלים אלה מאופיינים בתקופת דגירה קצרה, צמיחה מהירה, נגעים חמורים ורגישות בניטור התפתחות נגעים גרורתיים ראשוניים ובריאתיים. לכן, אלה הם מודלים אידיאליים לחקר הפונקציות והמנגנונים של גורמים ספציפיים אוסטאוסרקומה קרצינוגנזה וגרורות ריאתיות, מיקרו-סביבה של הגידול, והערכה של היעילות הטיפולית ב- vivo.

אוסטאוסרקומה אורתופית מוצלחת (ראשונית) ומודלים ריאתיים גרורתיים תלויים בהזרקה האורתוטופית המדויקת של תאי אוסטאוסרקומה. כאן, מודל אוסטאוסרקומה אורתוטופית (ראשונית) באמצעות הזרקת תאי אוסטאוסרקומה intratibial פותחה בהצלחה. איור 3A מציג עכבר מייצג הנושא אוסטאוסרקומה אורתוטופית (ראשונית), ואיור 3B מראה אוסטאוסרקומה אורתוטופית מבודדת (ראשונית) מייצגת. נפח הגידול נמדד פעם בשבוע בקליפר ומחושב כמתואר בשלב 2.11 (איור 3C). צמיחת אוסטא...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקת תאי intratibia osteosarcoma כדי ליצור מודלים עכבר הנושאים אוסטאוסרקומה אורתוטופית ונגעים גרורות ריאתיות.

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...

פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה ליצירת מודלים של עכבר הנושאים אוסטאוסרקומה ראשונית ואת נגעי גרורות ריאתי. על ידי הזרקה intratibial של תאי osteosarcoma, מודל זה מחקה בצורה הטובה ביותר את מאפייני ההתפתחות הקלינית של אוסטאוסרקומה הגידול. מספרים מדויקים של תאי אוסטאוסרקומה מוזרקים ישירות לשוקה באמצעות מזרק מיקרו-וולום, המאפשר שיעורי היווצרות גידולים זהים ונפחי גידולים זהים.ביום של הזרקת תאי osteosarcoma, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. נסה את התאים עם 1.5 מיליליטר של 0.25% טריפסין במשך שלוש דקות. לאחר מכן הוסיפו שישה מיליליטרים של 10% מדיה המכילה סרום MEM.לאסוף את התאים בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. שאפו 20 מיקרוליטרים של השעיית תאים לתוך החדר של צלחת ספירת התאים, וחשבו את ריכוז התא באמצעות מונה תאים אוטומטי. צנטריפוגה התאים ב 800 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לשאוף את supernatant עם פיפטה, resuspend גלולה התא במטריצת קרום מרתף 8.5 מיליגרם למיליליטר, ולהניח אותם על קרח. מקם את העכבר בתנוחה הסופית. החזק את הקרסול של העכבר באמצעות האגודל והאצבע המורה, ולחטא את אתר ההזרקה של השוקה עם 70% ספוגית אתנול.לסובב את מפרק הקרסול של כל עכבר כלפי חוץ כדי להזיז את השוקה ואת השוקית, ולכופף את מפרק הברך למצב מתאים עד רמת השוקה הפרוקסימלי גלוי דרך העור. חבר את המחט למזרק של מיליליטר אחד, וכוון את קצה

intratibial-osteosarcoma-cell-injection-to-generate-orthotopic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

פרוטוקול הרומן שדווח במחקר הנוכחי מאפשר איתור סלקטיבי של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי...

ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב<em&gt; באתרו</em&gt; זלוף של רקמת ריאה וכתמי X-גל של<em&gt; LacZ</emגידול תאים&gt; תייג-

הסרטון מדגים את טכניקת החיסון האורתוטופית לסרטן השד במודל עכבר. טכניקה זו מייצרת שיעור גידול גבוה עם פחות שונות בגודל הגידול וצורתו בהשוואה להזרקה תת עורית או לא ניתוחית.

הזרקה אורתוטופית: השתלת תאים סרטניים ספציפיים לרקמה בעכבר בוגר

הסרטן הוא מחלה מורכבת שמושפעת מהרקמות המקיפות את הגידול, כמו גם המתווכים פרו מקומיים ואנטי דלקתיים. לכן, דגמי הזרקת orthotropic, ולא מודלים תת עורי עשויים להיות שימושיים ללמוד התקדמות הסרטן באופן שהפתולוגיה אנושית מחקה טוב יותר.

הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד לחלב שומן Pad של עכברים לחקר התפתחות גידול.

כתב יד זה מספק את ההליך המפורט של הזרקת עורק תוך כסל (IIA), טכניקה להעברת תאים סרטניים במיוחד לרקמות הגפיים האחוריות כולל עצמות כדי ליצור גרורות ניסיוניות בעצמות. למרות שהוקם בתחילה עם מודלים של גידולי שד, ניתן להרחיב פרוטוקול זה בקלות לסוגי סרטן אחרים.

הזרקת עורק Intra-כסל עבור דוגמנות יעילה וסלקטיבי של מיקרוסקופיים עצם גרור

מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של הפרוטוקול וזמינותו גרורות בריאות (פומה). מודל זה מאפשר לחוקרים ללמוד אוסטאוסרקומה גרורתי (OS) גידול תאים של רקמת הריאה באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield או מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדור של pluripotent המושרה בתאי גזע (iPSCs) מ תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית (הסימולטור) החולה נגזר fibroblasts, הבידול של iPSCs באמצעות גזע mesenchymal (MSCs) תאי העצם, מידול vivo tumorigenesis באמצעות תאי העצם של החולה-derived הסימולטור.

מידול אוסטאוסרקומה באמצעות תאי גזע Pluripotent נגזר החולה המושרה תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתיל תאים סרטניים בשד אל תוך כרית שומן החלב פשוטה, פחות פולשנית, אחיזה נוחה בדרך, והוא מודל סרטן השד זה העכבר orthotopic עם סביבה נאותה כרית שומן החלב יכול לשמש כדי לחקור היבטים שונים של סרטן.

הזרקת Orthotopic של תאים סרטניים בשד אל תוך כרית שומן החלב עכברים

מודלים של גרורות בעצמות אינם מפתחים גרורות באופן אחיד או בשכיחות של 100%. הזרקה ישירה של תאי גידול תוך אוסאוסיים עלולה לגרום לתסחיף של הריאה. אנו מציגים את הטכניקה שלנו מידול גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם באמצעות השתלת גידול מוצק לתוך העצם, המוביל לקליטה וצמיחה הניתנים לשחזור.

מידול גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם עם השתלת גידול מוצק השתלת עצם לעצם

כאן, השתלה אורתוטופית סינגנית ואחריה הליך קטיעה של אוסטאוסרקומה עם גרורות ריאות ספונטניות שניתן להשתמש בהן לחקירה פרה-קלינית של ביולוגיה גרורות ופיתוח של טיפולים חדשניים מתואר.

מודל עכברוש אוסטאוסרקומה סנגנית אורתוטופית עם קטיעה כדי לשלוט בקצב גרורות

כתב היד מתאר מתודולוגיה להקמה וכן ניטור גדילה אורכי של גרורות ריאה ספונטניות מגידולי שד בהזרקה אורתוטופית, הניתנת להתערבות בכל שלבי המפל הגרורתי.

ב Vivo הדמיה למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטה לביסוס מודל עכבר קסנוגרפט (PDX) הנגזר ממטופל באמצעות רקמת אוסטאוסרקומה אנושית.

הקמת מודל עכבר Xenograft שמקורו במטופל עם רקמות אוסטאוסרקומה אנושיות

למד כיצד ליצור מודלים עכבריים לאוסטאוסרקומה ראשונית וגרורות ריאתיות באמצעות הזרקה תוך-שוקית של תאי אוסטאוסרקומה. שיטה זו מחקה את מאפייני ההתפתחות הקליניים של הגידול ומאפשרת חקר התנהגות הגידול ובדיקת טיפולים.

הזרקת תאי אוסטאוסרקומה אינטראטיביאלית להפקת אוסטאוסרקומה אורתוטופית ומודלים של עכבר גרורות ריאות

גלה סרטונים נוספים