Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לגילוי תרכובות ביו-אקטיביות נגד רעילות עצבית בתיווך פוליגלוטמין

כמודל רב עוצמה של בעלי חיים במחקרים ניווניים של מערכת העצבים ובמחקרים התנהגותיים, ניתן להשתמש ב-C.elegans כדי לסנן ולהעריך ביעילות תרכובות רעילות נגד רעילות עצבית של פוליגלוטמין באמצעות מודלים דמויי מחלת הנטינגטון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא פרופיל ושילוב של פנוטיפים מרובים במודלים שונים של C.elegans. גם למעשה כמו מודלים C.elegans משמשים בשיטה זו.

היא אכן מספקת גודל לסינון ולחקירת מועמדים טיפוליים לעיכובים ניווניים אחרים של מערכת העצבים ואכן לעיכובים אחרים. אנא שימו לב לטמפרטורות המשמשות בגדילת C.elegans ובצעו את הבדיקה בשלבים הנכונים של התפתחות נמית. מי שידגימו את הנוהל יהיו ג'יאנג ייאי, שיואה יואה וואנג צ'יאנגצ'יאנג, שלושה סטודנטים לתארים מתקדמים.

התחל בהעברת 300 עד 500 זחלי L1 מסונכרנים של נמטודות AM141 לכל באר של צלחת באר 48 עם 500 מיקרוליטר של מדיום S המכיל זן OP50 של E.coli וחמישה מיליגרם למיליליטר אסטרגלן. אטמו את הצלחת עם פרפילם ודגרו ב-20 מעלות צלזיוס ו-120 סיבובים לדקה למרווחי הזמן הרצויים. מעבירים את הנמטודות בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר ושוטפים עם חיץ M9 שלוש פעמים על ידי צנטריפוגה כדי להסיר את תאי OP50 הנותרים.

לאחר מכן, השהה את הנמטודות AM141 במאגר M9. כעת, העבירו 10 עד 15 נמטודות לכל באר בלוח באר 384, קבעו 10 בארות שכפול לכל טיפול והוסיפו 10 מיקרוליטרים של 200 מילימולר נתרן אזיד לכל באר כדי לשתק את הנמטודות על ידי מתן אפשרות להן להתיישב לתחתית. הנח את הצלחת במערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה כדי לקבל תמונות פלואורסצנטיות.

פתח את תוכנת רכישת התמונות והגדר את הפרמטרים המוזכרים בכתב היד של הטקסט. נתח את נתוני התמונה על-ידי פתיחת חלון הנתונים של לוח הסקירה ובחירת לוח הבדיקה לניתוח תמונה. לחץ פעמיים על באר בדיקה כדי להציג את התמונה שלה.

לאחר מכן בחר את גרעיני הספירה כשיטת הניתוח ולחץ על כפתור קביעת ההגדרות. הגדר את תמונת המקור מערוץ FITC ובחר באלגוריתם הרגיל. הגדר את הפרמטרים לניתוח תמונות כמתואר בכתב היד של הטקסט ובדוק אותם כדי לייעל את שיטת הניתוח.

שמור את ההגדרות והפעל את הניתוח על כל הבארות. ייצא את סך הגרעינים כמספר הכולל של אגרגטים Q40:YFP בכל באר. לספור את מספר הנמטודות בכל באר ולחשב את המספר הממוצע של Q40:YFP אגרגטים לכל נמטודה בכל קבוצה.

לאחר מכן, חשב את מדד העיכוב. כדי להכין נמטודות לבדיקת הנוירוטוקסיות של polyQ, העבירו 300 עד 500 זחלי L1 מסונכרנים של נמטודות HA759 לכל באר של צלחת באר 48 עם 500 מיקרוליטרים של מדיום S המכילים זן OP50 של E.coli וחמישה מיליגרם למיליליטר אסטרגלן. לאחר איטום הצלחות, דגירה, קציר, והרחקת הנמטודות במאגר M9 כפי שהוכח קודם לכן.

עכשיו, להכין כרית agarose על ידי הוספת שני גרם של agarose ל 100 מיליליטר של חיץ M9 ולחמם את התמיסה במיקרוגל כמעט רותחים. יש לפזר 0.5 מיליליטר של אגרוז מומס על מרכזה של שקופית זכוכית מיקרוסקופית בעובי מילימטר אחד הממוקמת בין שתי חתיכות של לוחות זכוכית בעובי שני מילימטר, ומכסה בשקופית נוספת אנכית. הסירו בעדינות את המגלשה העליונה ברגע שהאגרוז מתקרר ומתמצק.

התחל את בדיקת ההישרדות העצבית של ASH על ידי הוספת טיפה של 20 מילימולר נתרן אזיד על כרית האגרוס ולאחר מכן העברת 15 עד 20 נמטודות HA759 לתוך הטיפה כדי לשתק אותם. מניחים כיסוי מחליק בעדינות על הנמטודות. כעת, שמור את השקופית מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמה דיגיטלית.

בחר עדשה אובייקטיבית פי 40 ומסנן FITC כדי לזהות נוירוני ASH חיוביים ל-GFP באזור הראש של הנמטודות. בחר יותר מ-50 נמטודות בכל קבוצה באופן אקראי כדי לספור את מספר הנמטודות עם נוירוני ASH דו-צדדיים המסומנים ב-GFP באזור הראש שלהם, ולאחר מכן חשב את שיעור ההישרדות של נוירוני ASH. לצורך בדיקת ההימנעות האוסמוטית, חלקו צלחת NGM נטולת מזון לאזורי לכידה רגילים על ידי יצירת קו גליצרול טוחן שמונה באמצע.

לאחר מכן, הפיצו קו נתרן אזיד של 200 מילימולר במרחק של כסנטימטר אחד מקו הגליצרול כדי לשתק את הנמטודות שחוצות את מחסום הגליצרול לאזור המלכודת. העבירו כ-200 נמטודות כל אחת לאזור הרגיל של שלוש צלחות משוכפלות עבור כל קבוצה. לאחר מכן, הוסיפו טיפה של 1% בוטנדיון לאזור המלכודת כדי למשוך את הנמטודות.

מכסים מיד את המכסה של צלחת פטרי ודגירה ב 23 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. ציון מספר הנמטודות בשני האזורים תחת מיקרוסקופ וחישוב מדד ההימנעות. זן הפוליQ המהונדס AM141 מבטא בחוזקה חלבוני היתוך Q40:YFP בתאי שריר דופן הגוף שלו, המזוהים על ידי פרוטוקול הדמיה וניתוח אוטומטי זה, שכמותם ההולכת וגדלה עוכבה על ידי טיפול אסטרגלי המדגים את פוטנציאל ההגנה שלו.

אובדן של פלואורסצנציה של GFP ונוירוני ASH דו-צדדיים באזורי הראש של נמטודות מצביע על מוות עצבי של ASH. ניתן להשתמש בבדיקת הישרדות עצבית זו של ASH כדי להעריך באופן חזותי את ההשפעה הנוירו-פרוטקטיבית של תרכובות בדיקה על נוירונים אלגנטיים של Caenorhabditis. בדיקת ההימנעות הכימו-חושית שימשה לבחינת דגימות הבדיקה היעילות על אובדן תפקודי של נוירוני ASH בתיווך צבירה של polyQ.

מדד ההימנעות של נמטודות HA759 שטופלו באסטרגלאן ב -15 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים עלה ליותר מ -0.6, והדגים השפעה נוירו-פרוטקטיבית של הפוליסכריד נגד ליקויים התנהגותיים. לצורך הערכת היכולת העצבית הכוללת של תרכובות הבדיקה, הנתונים מהמבחנים הבודדים שולבו והוצגו כתרשים מכ"ם המציג את שטח המשולש בקבוצת הטיפול האסטרגלית גדול מזה של קבוצת הביקורת, המציין את ההשפעות האנטי-פוליQ של הפוליסכריד. אנא זכור כי מזון, טמפרטורה ולחות עשויים להשפיע על התנהגותם של C.elegans.