Name: פלואורסצנטיות בין פאתית בהכלאה במקום היברידיות של מריחות מח עצם של מיאלומה נפוצה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: למד שיטת FISH במריחות מח עצם לזיהוי תאי מיאלומה נפוצה באמצעות חרוזים מגנטיים נגד CD138. הפרוטוקול משפר דיוק אבחון ומפחית עלויות ניסוייות לעומת שיטות מסורתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה נתמך על ידי קרן החדשנות של WNLO 2018WNLOKF023.

מחקר זה נערך על פי עקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים דז'ונגנן של אוניברסיטת ווהאן (מס ' 2019065). הדגימות נאספו מחולה MM במחלקה להמטולוגיה, בית החולים דז'ונגנן של אוניברסיטת ווהאן (סין).
1. הכנת מריחות BM
<ol><li>מניחים את פתרון ה-0.2 מ"ל הראשון של BM על מגלשת זכוכית חד פעמית נקייה.</li>
	<li>מורחים את כתמי BM לעובי אחיד עם זנבות חדים על ידי הסרה מהירה של ה- BM. לאחר מכן, יבש באופן טבעי.</li>
	<li>לכסות את סרטי BM עם 1 מ"ל של פתרון רייט-Giemsa עבור כ 10 שניות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של מאגר פוספט לשקופיות. הערה: יש להקפיד למנוע מתמיסת הצבע להתייבש או לזרום מהמגלשות.</li>
	<li>מערבבים את תמיסת הצבע בעדינות ושומרים עליה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שוטפים את המגלשות במים נקיים ומייבשים אותן באוויר בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>השתמש במיקרוסקופיה של אור קדמי כדי לזהות מחשבים ממאירים. המחשבים צריכים להיות מפוזרים היטב.</li>
</ol>2. דגים טרום עיבוד של כתמי BM
<ol><li>לכסות את האזור ההיברידי עם פתרון קבוע במשך 10 דקות כדי לשנות צבע ולתקן את המחשבים.<ol>
<li>להכנת פתרון קבוע טרי, יש לערבב מתנול עם חומצה אצטית קרחונית ביחס נפח של 3:1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שטפו את המגלשה במים שעברו דה-יוניזציה (dH2O) וייבשו אותה באוויר בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מחממים צנצנת המכילה 2x SSC חוצץ עד 56 °C (56 °F) באמבט מים. יש לדלל את המאגר ל-20x SSC לפני השימוש.<ol>
<li>כדי להכין 20x SSC, לערבב ביסודיות 176 גרם של נתרן כלורי ו 88 גרם של נתרן ציטראט עם 800 מ"ל של dH2O. למדוד את ה- pH ולהתאים ל- pH 5.3 ± 0.2. לאחר מכן, הוסף dH2O כדי להביא את אמצעי האחסון הסופי ל- 1 L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את משטח BM מוכן במאגר 2x SSC שחומם מראש במשך 10 דקות, ואחריו לטבול אותו לתוך מים deionized בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מייבשים את המריחה בשיפוע אתנול (70%, 85%, ו-100% אתנול, כל אחד למשך דקה אחת). מייבשים את ההמרחה במשך 10 דקות.</li>
</ol>3. BM למרוח דגים ושטיפה
הערה: כל השלבים בוצעו בחדר חשוך כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית.
<ol><li>הוסף את תערובת הבדיקה TP53/centromere של כרומוזום 17 (CEP17) לאזור ההיברידיות וכסה אותה בהחלקת כיסוי. לחץ בעדינות עם פינצטה מחודדת עדינה כדי להסיר בועות אוויר מלמטה.</li>
	<li>לאטום את כל הצדדים של כיסוי כיסוי עם מלט גומי כדי להבטיח הידוק טוב.</li>
	<li>לאחר התגבשות של מלט הגומי, מניחים את השקופית על מכונת FISH אוטומטית. בצע denaturation ב 78 °C (78 °F) במשך 5 דקות, ואחריו הכלאה ב 37 °C (50 °F) לילה.</li>
	<li>תרים את השקופית ממכונת הדגים. השתמש פינצטה מחודדת עדינה כדי להסיר את מלט הגומי בעדינות.</li>
	<li>יש לטבול את המגלשה ב-2x SSC בטמפרטורת החדר למשך כדקה או שתיים כדי לשטוף את המכסה.</li>
	<li>לשטוף את השקופית ב 68 °C (68 °C) מחומם מראש 0.4x SSC / 0.3% NP-40 חוצץ באמבט מים במשך 2 דקות.<ol>
<li>הכן פתרון 0.4x SSC/0.3% NP-40 על ידי ערבוב יסודי של 20 מ"ל של 20x SSC (pH 5.3) עם 950 מ"ל של dH2O. לאחר מכן, מוסיפים 3 מ"ל של NP-40 ומערבבים היטב עד להמסה מלאה. מדוד את ה- pH והתאם ל- 7.0-7.5 עם NaOH. לאחר מכן, הוסף dH2O כדי להביא את אמצעי האחסון הסופי של הפתרון הכולל ל- 1 L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את השקופיות עם 2x SSC באמבט מים 37 °C (37 °F) במשך 1 דקות. מוגדר זקוף בחושך להתייבש ביסודיות במשך 10 דקות.</li>
	<li>הוסף 10 μL של DAPI לאזור ההיברידי וכסה עם כיסוי.</li>
</ol>4. ניתוח הדגים והדמיה
<ol><li>הצג את השקופית ההיברידית באמצעות ערכת מסננים מתאימה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
	<li>השתמש במסנן אופטי פלואורופור כחול מונוכרומטי כדי לבחון את עוצמת הפלואורסצנטיות של גרעין התא. קח תמונות גרעין תא תחת ערכת מסננים של DAPI.</li>
	<li>השתמש בבדיקת צנטרומר כרומוזום כדי להראות כמה כרומוזומים תא מכיל. תווית CEP17 עם פלואורסצנטיות ירוקה. השתמש במסנן אופטי פלואורופור ירוק ספקטרום כדי לבחון את המיקום של CEP17. צלמו תמונת אותות CEP17 מתחת לערכת המסננים הירוקה.</li>
	<li>סמן את הגן TP53 בפלואורסצנטיות כתומה. השתמש במסנן אופטי פלואורופור כתום ספקטרום כדי לצפות TP53. קח תמונת אותות TP53 מתחת לערכה זו.</li>
	<li>מזג את שלוש התמונות הללו ובחן אותן לאיתור חריגות מספריות. הערה: בתא בין-פאזי רגיל, שני אותות כתומים ושני אותות ירוקים נצפים בתוך גרעין עם פלואורסצנטיות כחולה, המציינים זוג אחד של כרומוזום 17 רגיל (איור 1).</li>
</ol>

<ol><li>Sonneveld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+multiple+myeloma+with+high-risk+cytogenetics%3A+a+consensus+of+the+International+Myeloma+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group.</a> Blood. 127, 2955-2962 (2016).</li>
<li>Radbruch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competence+and+competition%3A+the+challenge+of+becoming+a+long-lived+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell.</a> Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).</li>
<li>Lai, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+cytogenetics+in+multiple+myeloma%3A+a+study+of+151+patients+including+117+patients+at+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis.</a> Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).</li>
<li>Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+increasing+evidence+for+a+multistep+transformation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process.</a> Blood. 91, 3-21 (1998).</li>
<li>Munsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+recommendations+for+risk+stratification+in+multiple+myeloma%3A+report+of+the+International+Myeloma+Workshop+Consensus+Panel+2%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2.</a> Blood. 117, 4696-4700 (2011).</li>
<li>Gole, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cIg-FISH+On+Patients+with+Multiple+Myeloma+-+A+Modified+and+Simple+Technique+Easily+Incorporated+Into+Routine+Clinical+Service%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service.</a> Blood. 120, 4792-4792 (2012).</li>
<li>Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematology%2C+ICSH+guidelines+for+the+standardization+of+bone+marrow+specimens+and+reports%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Laboratory+Hematology%22%5BJournal%5D)">Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).</li>
<li>Štifter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+evaluation+of+bone+marrow+aspirate+and+biopsy+is+superior+in+the+prognosis+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma.</a> Diagnostic Pathology. 5, 30(2010).</li>
<li>Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+on+direct+hematological+bone+marrow+smears%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears.</a> Pathology. 27, 86-90 (1995).</li>
<li>Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+morphology%2C+esterase+cytochemistry%2C+and+interphase+cytogenetics+of+peripheral+blood+and+bone+marrow+smears%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).</li>
<li>Dunning, K., Safo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultimate+Wright-Giemsa+stain%3A+60+years+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making.</a> Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).</li>
<li>Woronzoff-Dashkoff, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wright-giemsa+stain.+Secrets+revealed%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The wright-giemsa stain. Secrets revealed.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).</li>
<li>McPherson, R. A., Pincus, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Henry%27s+Clinical+diagnosis+and+Management+by+Laboratory+Methods+E-book%5BTitle%5D)+AND+%22Elsevier+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2017).</li>
<li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

היישום של דגים לריבוד סיכון גנטי ב- MM הוא חיוני. החלק הקריטי של דוחות FISH הוא לא כל התאים הגרעינים, אבל מחשבים קלונליים מטוהרים או מזוהים במיוחד על ידי מיון עם חרוזים מגנטיים נגד CD138 או סימון עם שרשרת אור אימונוגלובולין ציטופלסמית κ או λ. אינטרפאזה FISH לאחר מיון מחשב או cIg-FISH נמצאה משמעותית באבחון של MM בשל השיעור הנמוך יחסית של מחשבים ב- BM. עם זאת, לשיטות אלה יש כמה חסרונות, כולל תהליכים מורכבים, דרישות דגימה גבוהות ועלויות ניסיוניות גבוהות. חמישים מחשבים יכולים להיות ממוקמים במהירות על ידי קליפר ורנייה שלב מיק...

מיאלומה נפוצה (MM) היא מחלת תאי פלזמה ממאירים (PC) עם הטרוגניות ביולוגית חזקה והבדלים אישיים גדולים ביעילות קלינית, עם תקופות הישרדות הנעות בין חודשים לעשורים. מאפיינים ציטוגנטיים הם אינדיקטורים פרוגנוסטיים חשובים של MM. מערכת ריבוד הסיכון וטיפולים מותאמים אישית המבוססים על מאפיינים גנטיים הפכו לנושאים בעלי עניין רב במחקר קליני על MM1. הסטיות של מחשבים שנבדקו בפלואורסצנטיות בלוח היברידיזציה של סיטו (FISH) של מח העצם (BM) כוללות דל 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t (14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) רווח/הגברה, ומחיקת 1p (CDKN2C).
ציטוגנטיקה מטפאזה סטנדרטית צריכה להיכלל בהערכה הראשונית של חולי MM. למרות kryotyping רגיל G-פס מציע את היתרון של ניתוח כרומוזום שלם, התשואה הנמוכה של שיטה זו מובילה לתוצאות שליליות כוזבות רבות2. באופן מסורתי, מחשבים נתפסו כבלתי מסוגלים במידה רבה לפיצול מכיוון שהם המוצרים הסופיים של בידול לימפוציטים B. הדבר מקשה על השגת תמונות מפוצלות. ניתוח ציטוגנטי משופר ב- MM עם תרביות לטווח ארוך (6 ימים) וגירוי של תרבויות על ידי ציטוקינים עשוי להיות שיטה מבטיחה לזיהוי חריגות ציטוגנטיות בחולי MM שאובחנו לאחרונה3. גם כאשר זמן התרבות היה ממושך עד 6 ימים, עם זאת, חריגות ציטוגנטיות דווחו במדויק ב 30%-50% של חולי MM4. יתר על כן, MM מאופיין בסטיות ציטוגנטיות מורכבות המשקפות את ההטרוגניות הפרוגנוסטית שלו. עם זאת, הרזולוציה של טכנולוגיית פסים כרומוזום מסורתית היא נמוכה, אשר עלול בקלות להוביל לזיהוי חסר של חריגות כרומוזומלי ב- MM.
דג אינטרפאזה, רצוי לאחר CD138-חיובי חרוז מגנטי מבוסס מיון מחשב או סימון עם שרשרת אור אימונוגלובולין cytoplasmic κ/λ, הוא הכרחי בניתוח של MM5,6. מדגם נבחר CD138 חיובי מומלץ מאוד עבור התשואה הממוטבת של תאים סרטניים. עם זאת, כמות מדויקת של סטיות ציטוגנטיות דורשת לפחות 4 מ"ל של BM אנטי-קולוגי למיון מחשב. בנוסף, השילובים של מיון חרוזים אימונומגנטיים CD138 עם FISH או אימונוגלובולין שרשרת אור ציטופלסמית κ /λ עם בדיקות דגים (cIg-FISH) להגדיל עלויות ניסיוניות רבות והם גוזלים זמן רב.
בדרך כלל, יחס המחשב מוערך תחילה מהבדיקה המורפולוגית של מריחות BM מוכתמות או מקטעי ביופסיה BM7,8. דגימות BM באיכות הגבוהה ביותר (דגימות שאיפה של מח ראשון) משמשות לבדיקות מורפולוגיות, ואילו אלה שנשלחו לדוג או לגילוי אחר הן לעתים קרובות דגימות שאיפה משניות עם יחס גבוה של דילול עם דם היקפי.
כבר בשנות ה-90 של המאה ה-20, מחקרים רבים הראו כי מריחות BM יכולות לשמש ישירות לבדיקות דגים ביניים, שהוכיחו את עצמן כשיטה אמינה וניתן לחזור עליהן9. מחקר אלגנטי המבוסס על מורפולוגיה של תאים וציטוכימיה אסטראז בשילוב עם FISH של דם היקפי וכתמי BM אישר את המשמעות הקלינית הגדולה שלו להבהרת חריגות כרומוזומליות בחולים עם לוקמיה גרנולוציטית ולימפוציטית10.
להלן, אנו מספקים שיטה חדשנית לשיפור ההצלחה של זיהוי דגים interphase בחולי MM.

<table><tbody><tr><td>מכונת FISH אוטומטית</td><td>Leica&nbsp; תאגיד</td><td>S500-24</td><td>סופי Assy Thermobrite 240V</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>אבוט מולקולרי בע"מ</td><td>06J49-001</td><td>DAPI תוכנת</td></tr><tr><td>ניתוח FISH</td> נגד כתמים <td>IMSTAR&nbsp; תאגיד</td><td>IMSTAR</td><td>FISH Analysis Software</td></tr><tr><td>FISH Probe</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>05N56-020</td><td>Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH ערכת בדיקה</td></tr> פיפטה <tr><td>בנפח קבוע</td><td>Eppendorf סין בע"מ</td><td>M33768H</td><td>10&nbsp; מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>פלואורסצנטי</td> מיקרוליטר <td>Olympus Corporation</td><td>BX53</td><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>קדימה תוכנת ניתוח קריוטיפ</td><td>IMSTAR&nbsp; תאגיד</td><td>IMSTAR</td><td>Karyotype ניתוח תוכנה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td>אולימפוס&nbsp; תאגיד</td><td>BX41</td><td>מיקרוסקופ אור קדמי</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>אבוט מולקולרי בע"מ</td><td>07J05-001</td><td>NP-40</td></tr><tr><td>מתלה צביעה מכתמי פלסטיק</td><td>גואנגג'ואו Kaixiu מסחר ושות', בע"מ</td><td>RSJ-501</td><td>&nbsp; 24 שקופיות</td></tr><tr><td>פלסטיק מכתים צביעה טנק</td><td>גואנגג'ואו Kaixiu מסחר ושות', בע"מ</td><td>RSJ-516</td><td>&nbsp; 24 שקופיות</td></tr><tr><td>גומי צמנט</td><td>Marabu&nbsp; GmbH & חברת</td><td>KG FixoGum&nbsp;</td><td>מלט גומי</td></tr><tr><td>SSC</td><td>אבוט מולקולרי בע"מ</td><td>02J10-032</td><td>20&פעמים; אמבט מים SSC</td></tr><tr><td></td><td>שנחאי Boxun רפואי ביו-מכשיר ושות', בע"מ</td><td>DK-8D</td><td>אמבט מים מרובה טמפרטורות</td></tr></tbody></table>

פלואורסצנטיות בין פאתית בהכלאה במקום היברידיות של מריחות מח עצם של מיאלומה נפוצה

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

פלואורסצנטיות בזיהוי הכלאה במקום (FISH) היא שיטה הכרחית בריבוד סיכונים גנטיים במיאלומה נפוצה (MM), שהיא אחת ממאירות המטולוגיות הנפוצות ביותר. המאפיין המזהה של MM מצטבר תאי פלזמה ממאירים במח העצם. דוחות דגים עבור MM מתמקדים בעיקר בתאי פלזמה קלונליים מטוהרים או מזוהים, ולא בכל התאים הגרעינים, על ידי מיון עם חרוזים מגנטיים נגד CD138 או סימון עם שרשרת אור אימונוגלובולין ציטופלסמית κ או λ. גרעינים אינטרפאזי מח עצם מתקבלים בדרך כלל מתאי מח עצם טריים. עם זאת, העשרה משביעת רצון של דגימות תאי פלזמה דורשת כמויות גדולות של מח עצם טרי נגד מח עצם, אשר לא ניתן להשיג במקרה של מיצוי מח עצם קשה או ברז יבש מח עצם. בזאת, אנו מקימים שיטה חדשנית כדי לשפר את ההצלחה של זיהוי דגים על כתמי מח עצם מוכתמים או לא מוכתמים. כתמי מח עצם קלים יותר להשגה מאשר דגימות מח עצם נוגדות קרישה.

בהערכה המורפולוגית הראשונית של חולה MM שאובחן לאחרונה, 15% מהמחשבים במריחת BM נמצאו בעלי גרעינים גדולים וכהים יותר יחד עם כמויות גדולות יותר של ציטופלסמה ממחשבים רגילים (איור 2A). הצינור הראשון של BM אנטי-קרישה הפרין שזוהה על ידי טכניקת אימונופנוטיפ חשף רק 2.3% מהמחשבים החריגים חד שבטיים. מיון חרוזים אימונומגנטיים CD138 בשילוב עם FISH או טכניקת cIg-FISH חיוני להשגת תוצאה מדויקת של FISH. עם זאת, BM שאפתנית מוגבלת במקרה של זה להיות ברז יבש. כתמי BM שימשו לבדיקת דגים בין-פאזיים. מחשב בינוקלציה ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיפור ההצלחה של פלואורסצנטיות בין פאזית בזיהוי הכלאה במקום על מריחות מח עצם מחולי מיאלומה נפוצים.

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of ...

היישום של פלואורסצנטיות בהכלאת Situ הנקראת FISH לריבוד הסיכון הגנטי במיאלומה נפוצה הוא חיוני. החלק הקריטי של דוחות דגים הוא לא כל התאים nucleated, אבל תאי פלזמה clonal מטוהרים במיוחד או מזוהים על ידי מיון עם חרוזים מגנטיים נגד CD138 או סימון עם קאפה ציטופלסמית או אימונוגלובולין שרשרת אור למבדה עם בדיקות דגים הנקראות cIg FISH. דג אינטרפאזה לאחר מיון תאי פלזמה או cIg FISH מתברר להיות משמעותי באבחון של מיאלומה נפוצה, בשל שיעור נמוך יחסית של תאי פלזמה במח העצם.עם זאת, לשיטות אלה יש כמה חסרונות כולל תהליכים מורכבים, דרישות דגימה גבוהות ועלויות ניסיוניות גבוהות. תאי פלזמה יכולים להיות ממוקמים במהירות במריחת מח עצם. בהתבסס על כך, אנו משתמשים דגים מריחת מח עצם לגילוי של תאי מיאלומה נפוצים.מחקר זה נערך על פי עקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים דז'ונגנן באוניברסיטת ווהאן. הדגימות נאספו מחולה מיאלומה נפוצה במחלקה להמטולוגיה, בית החולים דז'ונגנן באוניברסיטת ווהאן בסין. מניחים את 0.2 המיליליטר הראשונים של תמיסת מח העצם על מגלשת זכוכית חד פעמית נקייה, מורחים את מריחות מח העצם לעובי אחיד וזנבות חדים על ידי הסרה מהירה של מח העצם ואז לייבש אותו באופן טבעי.לכסות את סרטי מח העצם עם מיליליטר אחד של תמיסת רייט-Giemsa במשך כ 10 שניות בטמפרטורת החדר. הוסף מיליליטר אחד של מאגר פוספט לשקופיות, נדרש טיפול כדי למנוע מתמיסת הצבע להתייבש או לזרום מהמגלשות. מערבבים את תמיסת הצבע בעדינות ושומרים עליה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.יש לשטוף את המגלשות במים נקיים ולייבש אותן באוויר בטמפרטורת החדר. השתמש מיקרוסקופיה אור קדימה כדי לזהות תאי פלזמה ממאירים, תאי הפלזמה צריכים להיות מפוזרים היטב. עכשיו מה שאנחנו רואים בשטח הוא תאי הפלזמה אשר מפוזרים למדי.זהו תא פלזמה גרעינית בינוקלארי טיפוסי. לכסות את האזור ההיברידי עם פתרון קבוע במשך 10 דקות כדי לשנות צבע ולתקן תאי פלזמה. יש לשטוף את המגלשה במים שעברו דה-יוניזציה ולייבש אותה באוויר בטמפרטורת החדר.מחממים צנצנת המכילה פעמיים חיץ SSC ל 56 מעלות צלזיוס באמבט מים. לשטוף את מריחת מח העצם מוכן במאגר SSC מחומם מראש פעמיים SSC במשך 10 דקות ואחריו טבילה לתוך מים deionized בטמפרטורת החדר. מייבשים את הכתם בשיפוע אתנול 70%85% ו-100% אתנול כל אחד למשך דקה אחת.יבש את למרוח באוויר במשך 10 דקות. ראשית להוסיף TP53 על centromere של תערובת בדיקה כרומוזום 17 לאזור הכלאה ולכסות אותו עם להחליק כיסוי ללחוץ בעדינות פינצטה מחודדת בסדר כדי להסיר בועות אוויר מלמטה. לאטום את כל הצדדים של להחליק כיסוי עם מלט גומי כדי להבטיח לחץ טוב.לאחר התגבשות של מלט הגומי החלקה הונחה על denaturation מכונת FISH אוטומטי בוצע ב 78 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ואחריו הכלאה ב 37 מעלות צלזיוס לילה. תרים את השקופית ממכונת הדגים. השתמשו בפינצטה מחודדת עדינה כדי להסיר את בטון הגומי בעדינות.טבול את השקופית פעמיים SSC בטמפרטורת החדר במשך כדקה או שתיים כדי לשטוף את החלקת הכיסוי. לשטוף את השקופית ב 68 מעלות צלזיוס חימום מראש חוצץ באמבט מים במשך שתי דקות. לשטוף את השקופיות עם פעמיים SSC באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך דקה אחת.מוגדר ממש בחושך להתייבש ביסודיות במשך 10 דקות ב 10 מיקרוליטר של DAPI לאזור ההיברידי, לכסות עם פתק כיסוי. הצג שקופית היברידית באמצעות מסנן מתאים להגדיר על מיקרוסקופ פלואורסצנטי, להשתמש במסנן אופטי פלואורופור כחול מונוכרומטי כדי לבחון את עוצמת פלואורסצנטיות של גרעין התא. קח תמונות גרעין תא תחת ערכת מסננים של DAPI.CEP17 היה מסומן עם פלואורסצנטיות ירוקה. השתמש מסנן אופטי פלואורופור ירוק ספקטרום כדי לבחון את המיקום של CEP17. קח את תמונת אותות CEP17 תחת ערכת מסננים ירוקה.הגן TP53 תויג בפלואורסצנטיות כתומה. השתמש במסנן אופטי פלואורופור כתום ספקטרום כדי לצפות TP53, לקחת תמונת אותות TP53 מתחת לערכה, למזג את שלוש התמונות האלה לתוך שלם ולבדוק אם יש חריגות מספריות. בתא בין-פאתי רגיל, שני אותות כתומים וירוקים נצפים בתוך גרעין עם פלואורסצנטיות כחולה המציינת זוג אחד של כרומוזומים רגילים 17.התוצאות הראו את המורפולוגיה והגנטיקה של מוח העצם בחולה מיאלומה נפוצה. איור A הראה כי 15% מתאי הפלזמה במריחת מח עצם נמצאו גדולים וכהים יותר וגרעין יחד עם כמויות גדולות של ציטופלסמה מהרגיל. איור B הראה תמונה בקנה מידה אפור של נציג על ידי תא פלזמה מגורען במריחת מח עצם.איור C הראה ארבעה אותות כתומים וארבעה ירוקים בגרעין בין-פאזי אחד של תא פלזמה המצביע על כך שארבעה עותקים של כרומוזום 17 היו מקומיים בגרעין. איור D הראה כי קריוגרמה כרומוזום חריג של חולה זה אישר שני זוגות של כרומוזומים 17 בגרעין אחד. מריחות מח עצם הרבה יותר קל להשיג מאשר דגימות מח עצם נוגד קרישה כי קבלת מח עצם anticoagulated דורש הליכים מורכבים כדי להשיג את הגרעין.בהתאם לכך, הקמנו שיטה משכנעת עבור דג מריחת מח עצם לגילוי של תאי מיאלומה נפוצים.

interphase-fluorescence-situ-hybridization-bone-marrow-smears

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מתאר את הטכניקה של שאיפת מח עצם מעמוד השדרה האיליאק והכנה לביופסיה. בדוגמה, אנו מבצעים שאיבת מח עצם מחולה לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ובודקים את התאים כדי לבדוק אם יש מחלה שיורית מדידה (MRD), סמן ביולוגי פרוגנוסטי חשוב.

שאיפת מח עצם: שיטה להשגת מח עצם לבחינת מורפולוגיה של התא

המוני רקמות מורכבים, מאיברים לגידולים, מורכבים מאלמנטים הסלולר שונים. אנו הובהר התרומה של פנוטיפים הסלולר בתוך רקמת ניצול עכברים הטרנסגניים ניאון רב שכותרתו בשילוב עם מכתים immunofluorescent multiparameter אחרי unmixing רפאים לפענח מוצא תא, כמו גם מאפייני תא המבוססים על ביטוי חלבון.

כמותיים Multispectral ניתוח בעקבות השתלת רקמות פלורסנט וליזואליזציה של מקורות ניידים, סוגים, ואינטראקציות

מוצגת אסטרטגיה לניתוח כמותי של נתונים היסטולוגיים במח העצם. מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי בקטעי רקמה מביאה לתמונות דו-ממדיות, המנותחות אוטומטית. ניתוחי לוקליזציה משותפת של סוגי תאים שונים מושווים לנתונים מתמונות מדומות, ונותנים מידע כמותי על אינטראקציות תאיות.

אוטומטי כימות של תא המטופואטיות - אינטראקציות תא סטרומה בתמונות היסטולוגית של עצם Undecalcified

אנו מתארים בדיקת רגישות לתרופות בתפוקה גבוהה עבור תאי מיאלומה נפוצה ראשוניים. הוא מורכב משחזור של מיקרו-סביבת מח העצם (כולל מטריצה חוץ-תאית וסטרומה) בצלחות מרובות בארות, ושיטה לא פולשנית לכימות אורך של כדאיות התא.

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

מיקרוסקופ זריחה intravital (IVFM) של החילונית מוחל בשילוב עם דגמים גנטיים בעלי חיים כדי ללמוד את יונת ואת engraftment של תאים hematopoietic גומחות מח עצם (מוניטור).

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התועלת של הכלאה פלואורסצנטית מרובה באתרה (mFISH) וקריוטיפ ספקטרלי (SKY) בזיהוי סטיות יציבות בין-כרומוזומליות בתאי מח העצם של עכברים לאחר חשיפה לקרינה כוללת של הגוף.

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (mFISH) ו ספקטרלית Karyotyping (SKY) בעכברים מוקרנים

גילוי של מחלה שיורית מינימלית או מדיד (MRD) הוא סמן prognostic חשוב זיקוק הערכת סיכונים, חיזוי relapse ב לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). אלה מקיף הנחיות והמלצות עם שיטות עבודה מומלצות עבור זיהוי עקבי ומדויק וזיהוי של MRD, עשויים לסייע בקבלת החלטות לטיפול יעיל של AML.

פרוטוקולים מקיפה לדוגמה, מח עצם תהליך למדידת מחלה שיורית מדיד, לוקמיה בתאי גזע לוקמיה מיאלואידית חריפה

כאן נתאר פרוטוקול עבור מולטיפלקס immunohistochemical פלורסנט מכתים והדמיה עבור ההתאמה סימולטני של אנטיגנים מרובים הקשורים לסרטן ב לימפומה. פרוטוקול זה ניתן להרחיב את הניתוח colocalization של סמנים ביולוגיים בתוך כל מקטעי רקמת.

מרובבת פלורסנט נוגדן, הדמיה, וניתוח בדגימות היסטולוגית של לימפומה

כאן מוצג פרוטוקול מפורט לבידוד ואפיון אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם ממודלים של תסמונות מיאלודיספלסטיות ולוקמיה מיאלואידית חריפה. טכניקה זו מזהה שינויים בנישת מח העצם הלא המטופויטית, כולל תאי האנדותל והסטרומה המזנכימליים, עם התקדמות המחלה.

זיהוי אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם בתסמונת מיאלודיספלסטית ובלוקמיה מיאלואידית חריפה

כאן, מתוארת שיטה מבוססת ציטומטריית פוספופלואו לניתוח איתות במורד הזרם של מסלולי mTORC1, JAK/STAT5 ו-MAPK בתאי לוקמיה מיאלואידית אנושית חריפה שהושתלו בעכברים ומתקבלים מאספיראטים של מח עצם. רמות p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 ו-p-ERK1/2 נמדדות בו זמנית באמצעות ציטומטר זרימה ספקטרלי מהדור הבא עם רגישות גבוהה.

ציטומטריית פוספו-פלואו תוך-תאית של השתלות קסנו-השתלות שמקורן בלוקמיה מיאלואידית חריפה

למד שיטת FISH במריחות מח עצם לזיהוי תאי מיאלומה נפוצה באמצעות חרוזים מגנטיים נגד CD138. הפרוטוקול משפר דיוק אבחון ומפחית עלויות ניסוייות לעומת שיטות מסורתיות.

פלואורסצנטיות בין פאתית בהכלאה במקום היברידיות של מריחות מח עצם של מיאלומה נפוצה

גלה סרטונים נוספים