פלואורסצנטיות בין פאתית בהכלאה במקום היברידיות של מריחות מח עצם של מיאלומה נפוצה

היישום של פלואורסצנטיות בהכלאת Situ הנקראת FISH לריבוד הסיכון הגנטי במיאלומה נפוצה הוא חיוני. החלק הקריטי של דוחות דגים הוא לא כל התאים nucleated, אבל תאי פלזמה clonal מטוהרים במיוחד או מזוהים על ידי מיון עם חרוזים מגנטיים נגד CD138 או סימון עם קאפה ציטופלסמית או אימונוגלובולין שרשרת אור למבדה עם בדיקות דגים הנקראות cIg FISH. דג אינטרפאזה לאחר מיון תאי פלזמה או cIg FISH מתברר להיות משמעותי באבחון של מיאלומה נפוצה, בשל שיעור נמוך יחסית של תאי פלזמה במח העצם.

עם זאת, לשיטות אלה יש כמה חסרונות כולל תהליכים מורכבים, דרישות דגימה גבוהות ועלויות ניסיוניות גבוהות. תאי פלזמה יכולים להיות ממוקמים במהירות במריחת מח עצם. בהתבסס על כך, אנו משתמשים דגים מריחת מח עצם לגילוי של תאי מיאלומה נפוצים.

מחקר זה נערך על פי עקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים דז'ונגנן באוניברסיטת ווהאן. הדגימות נאספו מחולה מיאלומה נפוצה במחלקה להמטולוגיה, בית החולים דז'ונגנן באוניברסיטת ווהאן בסין. מניחים את 0.2 המיליליטר הראשונים של תמיסת מח העצם על מגלשת זכוכית חד פעמית נקייה, מורחים את מריחות מח העצם לעובי אחיד וזנבות חדים על ידי הסרה מהירה של מח העצם ואז לייבש אותו באופן טבעי.

לכסות את סרטי מח העצם עם מיליליטר אחד של תמיסת רייט-Giemsa במשך כ 10 שניות בטמפרטורת החדר. הוסף מיליליטר אחד של מאגר פוספט לשקופיות, נדרש טיפול כדי למנוע מתמיסת הצבע להתייבש או לזרום מהמגלשות. מערבבים את תמיסת הצבע בעדינות ושומרים עליה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

יש לשטוף את המגלשות במים נקיים ולייבש אותן באוויר בטמפרטורת החדר. השתמש מיקרוסקופיה אור קדימה כדי לזהות תאי פלזמה ממאירים, תאי הפלזמה צריכים להיות מפוזרים היטב. עכשיו מה שאנחנו רואים בשטח הוא תאי הפלזמה אשר מפוזרים למדי.

זהו תא פלזמה גרעינית בינוקלארי טיפוסי. לכסות את האזור ההיברידי עם פתרון קבוע במשך 10 דקות כדי לשנות צבע ולתקן תאי פלזמה. יש לשטוף את המגלשה במים שעברו דה-יוניזציה ולייבש אותה באוויר בטמפרטורת החדר.

מחממים צנצנת המכילה פעמיים חיץ SSC ל 56 מעלות צלזיוס באמבט מים. לשטוף את מריחת מח העצם מוכן במאגר SSC מחומם מראש פעמיים SSC במשך 10 דקות ואחריו טבילה לתוך מים deionized בטמפרטורת החדר. מייבשים את הכתם בשיפוע אתנול 70%85% ו-100% אתנול כל אחד למשך דקה אחת.

יבש את למרוח באוויר במשך 10 דקות. ראשית להוסיף TP53 על centromere של תערובת בדיקה כרומוזום 17 לאזור הכלאה ולכסות אותו עם להחליק כיסוי ללחוץ בעדינות פינצטה מחודדת בסדר כדי להסיר בועות אוויר מלמטה. לאטום את כל הצדדים של להחליק כיסוי עם מלט גומי כדי להבטיח לחץ טוב.

לאחר התגבשות של מלט הגומי החלקה הונחה על denaturation מכונת FISH אוטומטי בוצע ב 78 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ואחריו הכלאה ב 37 מעלות צלזיוס לילה. תרים את השקופית ממכונת הדגים. השתמשו בפינצטה מחודדת עדינה כדי להסיר את בטון הגומי בעדינות.

טבול את השקופית פעמיים SSC בטמפרטורת החדר במשך כדקה או שתיים כדי לשטוף את החלקת הכיסוי. לשטוף את השקופית ב 68 מעלות צלזיוס חימום מראש חוצץ באמבט מים במשך שתי דקות. לשטוף את השקופיות עם פעמיים SSC באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך דקה אחת.

מוגדר ממש בחושך להתייבש ביסודיות במשך 10 דקות ב 10 מיקרוליטר של DAPI לאזור ההיברידי, לכסות עם פתק כיסוי. הצג שקופית היברידית באמצעות מסנן מתאים להגדיר על מיקרוסקופ פלואורסצנטי, להשתמש במסנן אופטי פלואורופור כחול מונוכרומטי כדי לבחון את עוצמת פלואורסצנטיות של גרעין התא. קח תמונות גרעין תא תחת ערכת מסננים של DAPI.

CEP17 היה מסומן עם פלואורסצנטיות ירוקה. השתמש מסנן אופטי פלואורופור ירוק ספקטרום כדי לבחון את המיקום של CEP17. קח את תמונת אותות CEP17 תחת ערכת מסננים ירוקה.

הגן TP53 תויג בפלואורסצנטיות כתומה. השתמש במסנן אופטי פלואורופור כתום ספקטרום כדי לצפות TP53, לקחת תמונת אותות TP53 מתחת לערכה, למזג את שלוש התמונות האלה לתוך שלם ולבדוק אם יש חריגות מספריות. בתא בין-פאתי רגיל, שני אותות כתומים וירוקים נצפים בתוך גרעין עם פלואורסצנטיות כחולה המציינת זוג אחד של כרומוזומים רגילים 17.

התוצאות הראו את המורפולוגיה והגנטיקה של מוח העצם בחולה מיאלומה נפוצה. איור A הראה כי 15% מתאי הפלזמה במריחת מח עצם נמצאו גדולים וכהים יותר וגרעין יחד עם כמויות גדולות של ציטופלסמה מהרגיל. איור B הראה תמונה בקנה מידה אפור של נציג על ידי תא פלזמה מגורען במריחת מח עצם.

איור C הראה ארבעה אותות כתומים וארבעה ירוקים בגרעין בין-פאזי אחד של תא פלזמה המצביע על כך שארבעה עותקים של כרומוזום 17 היו מקומיים בגרעין. איור D הראה כי קריוגרמה כרומוזום חריג של חולה זה אישר שני זוגות של כרומוזומים 17 בגרעין אחד. מריחות מח עצם הרבה יותר קל להשיג מאשר דגימות מח עצם נוגד קרישה כי קבלת מח עצם anticoagulated דורש הליכים מורכבים כדי להשיג את הגרעין.

בהתאם לכך, הקמנו שיטה משכנעת עבור דג מריחת מח עצם לגילוי של תאי מיאלומה נפוצים.