בנייה ידנית של מיקרו-מערך רקמות בשיטת הקלטת ובמיקרו-מערך כף יד

מיקרו-מערך הרקמה, או TMA, הוא כלי מחקר חשוב שמרכיב פיסות רקמה קטנות ומופתיות המכונות ליבות רקמה מגושי רקמה משובצים בפורמלין קבוע, המכונים בלוקים של תורמים, לגוש פרפין יחיד. שיטת הקלטת היא שיטת בנייה ידנית לחלוטין ההופכת את תהליך הבנייה על ידי יציקת הבלוק סביב ליבות זקופות ולכן היא תואמת לבלוקים לא אידיאליים של תורמים ומשתמשת במיקרו-מערכים ידניים חד פעמיים זולים וזמינים באופן נרחב. זרימת העבודה הרב-שלבית של תהליך זה תודגם על ידי מר לי ויסנר וד"ר ברנדון לארסן.

אחד המושגים החשובים ביותר שיש לזכור בעת בניית בלוקי TMA הוא העובדה שרקמות בבלוקים משובצים של פרפין קבוע פורמלין הן למעשה מבנים תלת-ממדיים. פיתחנו כאן אנימציה שתעזור להסביר את הרעיון הזה. מה שאתם רואים כאן הוא אנימציה המתארת בלוק רקמה משובץ פרפין קבוע פורמלין המציג את האופי התלת-ממדי של אותה רקמה בתוך הבלוק.

אתה יכול לראות כי הרקמה נראית בחלק העליון של הבלוק ואת האזור הזה הוא די גדול. אם היינו מסוגלים לקבל ראיית רנטגן, כביכול, ולראות דרך הבלוק, היינו עשויים לראות שהרקמה אינה למעשה בעלת צורה אחידה עמוק יותר בתוך הגוש הזה, כמעט כמו קרחון באוקיינוס, שבו מה שאתם רואים על פני השטח אולי לא באמת מייצג את מה שנמצא מתחת. בתוך גוש הרקמה הזה עשויות להיות חתיכות רקמה נוספות שאינן נראות על פני השטח.

יתכנו אזורים של נמק או מוות של רקמות במרכז אותה רקמה עמוק יותר. פתולוג צריך למעשה לבדוק את החלק הדו-ממדי הזה מהחלק העליון של אותו גוש רקמה ואז לבאר את השקופית כדי להראות את האזורים המכילים את הרקמה המעניינת ולא כולל נמק או סוגים אחרים של רקמות שאינם באמת מעניינים. כדי להקל על דגימת הליבה הנכונה של הרקמה, הפתולוג צריך לעשות שלושה דברים.

ראשית, באמצעות עט סימון שקופיות, הפתולוג יסמן את הרקמה המעניינת בשקופית, כך שניתן יהיה להימנע מרקמות אחרות. שנית, אם ישנם אזורים בתוך אותו תחום עניין שיש להימנע מהם, הפתולוג יכול להשתמש באותו עט סימון כדי לטשטש את אותם אזורים שאין לדגום. ולבסוף, רצוי באמצעות צבע אחר של עט, הפתולוג צריך לסמן את אותם אזורים שהם אידיאליים בתוך אזור העניין של דגימת ליבה ובניית TMA.

חשוב לזכור שכאשר התהליך הזה נעשה, הרכב הרקמה עשוי להשתנות עמוק יותר בתוך המקום שבו מתקבלת דגימת ליבה, ואנחנו נראה את זה כאן באנימציה, שמיקום הליבה יקבע את ההרכב של אותה ליבה, שישתנה לפי עומק הרקמה ומה קיים בתוך אותו בלוק. לדוגמה, כאן הליבה הראשונה שאנחנו ממחישים היא לכידת חלק מהרקמה בחצי העליון שלה, אבל עמוק יותר בתוך הבלוק כבר אין רקמה במקום שממנו מתקבלת הליבה הזו, ולכן רק שעוות פרפין נדגמה. הליבה השנייה שהמחשנו כאן תפסה רקמה לכל אורכה מכיוון שהרקמה נמצאת לאורך כל העומק של אותו בלוק באותו מיקום.

הליבה השלישית תפסה חלק מהרקמה ואז תפסה חלק משעוות פרפין במרכז שבו לא הייתה קיימת רקמה ואז תפסה עוד קצת רקמה בקצה התחתון שלה, שם הייתה רקמה בחלק התחתון של אותו בלוק. לאחר השלמת סקירת הפתולוגיה, ערכו את הרשימה הסופית של בלוקי התורמים שישמשו בבניית TMA, ולאחר מכן צרו מפת TMA. מפת ה-TMA היא מתווה סכמטי שבו הליבות ימוקמו ב-TMA שהושלם ובמקטעי הרקמה המותקנים בשקופיות שנחתכו מה-TMA שנוצר.

למטרות כיוון, ודא שמפת ה- TMA נמנעת מהצבת ליבות במטריצה אחידה כגון מטריצה של שלושה על שלושה או ארבעה על ארבעה וכוללת לפחות סמן כיוון אחד. מכיוון ששיטת הקלטת הופכת את תהליך הבנייה על ידי שפיכת שעווה מותכת סביב הליבות ההפוכות, הדבר מחייב יצירת מפה שנייה המכונה מפת בנייה שהיא תמונת מראה של מפת TMA. מפת הבנייה מראה היכן יש למקם כל ליבה במהלך הבנייה על מנת להופיע במיקום הנכון ב- TMA שהושלם.

לאחר שהמפות נוצרו, הכינו את תבנית הבסיס TMA המתכתית. כדי להנחות את מיקום הליבה, השתמש ברשת חד-פעמית של בדיקת נייר. חותכים את רשת משבצות הנייר לגודל ומצמידים פיסת נייר דבק כפול לחלק האחורי של הרשת.

מניחים את הרשת ואת הסרט לתוך מגש המתכת ומוסיפים חתיכה שנייה של סרט הדבקה כפול על גבי הרשת. שכבו את מגלשת ה-H&E שנסקרה על ידי הפתולוגיה על בלוק רקמת ה-FFPE כדי להיות מנוקבת והשתמשו בסימוני הפתולוג כדי לזהות היכן יש לנקב את בלוק הרקמה. באמצעות אגרוף ליבה ידני כף יד, חד פעמי או לשימוש חוזר, אגרוף את בלוק התורם FFPE באזור המתאים.

אם אתם משתמשים באגרוף ליבה לשימוש חוזר, ודאו שהוא מנוקה לפני ואחרי כל אגרוף טישו. הוציאו את הליבה מהאגרוף המרכזי. השתמש בחריקת מחט כדי למקם את הליבה הנפלטת על הכוונת של הרשת המכוסה בנייר דבק כפול.

ודא שהליבה ממוקמת באופן הפוך וזקוף כך שקצה הרקמה של הליבה יוצר קשר עם הקלטת ונמצא במיקום הנכון כפי שמצוין על ידי מפת הבנייה. חזרו על הפעולה עד שכל בלוקי התורמים יתווספו והליבות יוצבו בעמדות המתאימות להם. לאחר שכל הליבות נמצאות במקומן, סמן קלטת פלסטיק והנח אותה על גבי בסיס המתכת המכיל את הליבות.

גובה הליבות לא יעלה על עומק מגש המתכת מכיוון שליבות גבוהות יוטות או יתמוטטו כאשר הקלטת תונח במקומה. יוצקים בעדינות פרפין מומס דרך הקלטת למגש הליבות. אפשרו לפרפין המותך לעלות על גדותיו כדי להבטיח שאין בועות אוויר בגוף ה-TMA.

ודא שהפרפין מתמלא בחלק העליון של הקלטת כך שהקלטת מוטבעת ומחוברת היטב לבלוק הפרפין לאחר שהתמצקה. אפשרו לבלוק להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ואל תזיזו את הבלוק במהלך תקופה זו. מכניסים את הבלוק למקרר בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות כדי להתמצק לחלוטין.

לאחר ההגדרה המלאה, הפרד בעדינות את תבנית בסיס המתכת והסר את סרט הדבק הכפול מגוש הפרפין. לאחר בניית ה-TMA, השתמשו במיקרוטום כדי לחתוך את ה-TMA החדש. לאחר שהבלוק פונה כראוי, אספו מקטעי רקמות עם פנים מלאות.

מעבירים את החלקים לאמבטיית מים מחוממת מראש ומחליקים את מקטעי הרקמה. לאחר הייבוש, הגישו חלקים מייצגים לצביעת H&E ולכל כתם אימונוהיסטוכימי נוסף שעשוי להידרש. שלח את קטעי ה- TMA המוכתמים לבדיקה פתולוגית.

לצורך אימות TMA, על הפתולוג לסקור את שקופית H&E מגוש ה-TMA ולסקור כל נקודה מעגלית מתחת למיקרוסקופ כדי לראות אם הרקמה המעניינת קיימת. מרכיב קריטי בתהליך הבנייה הוא זיהוי רקמות בעלות עניין בבלוק תורם נתון שממנו יש להשיג את ליבת ה-TMA. העמודה הראשונה באיור זה מציגה תורם למופת H&Es עם סימוני הפתולוג.

העמודה השנייה מציגה את האזור המנוקב של הרקמות המוכתמות H&E. העמודה השלישית מציגה את הרקמה המוכתמת H&E של ליבות ה-TMA שנקטפו מגושי התורמים באזורים המוצגים בעמודות 1 ו-2. הפתולוג יכול לראות את בלוק התורם התואם ואת ליבת ה-TMA H&Es יחד כדי לאמת שתחום העניין נאסף ושהרכב הרקמה זהה.

ישנם שני מדדים עיקריים להשלמת TMA מוצלחת בשיטת הקלטת. הראשון הוא נוכחות של נקודות ליבת רקמה במיקומים הצפויים ובמרחק זה מזה, אשר מוערך על ידי בדיקה חזותית. התמונות המוצגות ב- A ו- B מתארות שני TMAs של שיטת קלטת שהושלמו בהצלחה ואת שקופיות H&E המתאימות.

בדיקות חזותיות של בלוקי TMA אלה מראות שהליבות קיימות ומרווחות באופן קבוע בכל TMA ובמקטעים המתאימים להן. חלק מבעיות הבנייה העיקריות שיכולות להתעורר במהלך תהליך הבנייה של שיטת הקלטת כוללות הפרדת הבלוק והקלטת עקב הסרה מוקדמת של בסיס המתכת לפני התמצקות, כפי שמוצג בתמונה C.הפלת ליבה ו /או מיקום סחף של הליבות המוטבעות כפי שמוצג בתמונה D יכולה להתרחש תוך שפיכה סוערת מדי של הפרפין המותך, אשר עלול להחמיר על ידי סרט מקל דו-צדדי דביק גרוע. איור זה מראה שכתם H&E עבור כל אחת מהליבות הוא TMA למופת.

כל נקודות הליבה מלבד אחת נמצאות ב- H&E. האיור גם מראה כי חלק מהליבות נמצאות כנקודות רקמה מעגליות שלמות, בעוד שאחרות אינן נוכחות לחלוטין. אובדן רקמות כזה אינו נדיר וייתכן שהוא נובע מחסימה לא מספקת הפונה כדי לחשוף את כל הליבות במלואן.

לחלופין, נוכחות של לא שלם או היעדר מוחלט של רקמה עלולה לנבוע מאיכות רקמה ירודה של אותה ליבה, מה שעלול לגרום לאובדן רקמות במהלך תהליך ההכתמה. בתמונה הבאה בוצעו אימונוהיסטוכימיה וכתמי RNA ISH בחתכי ה-TMA כדי לאמת עוד יותר את ה-TMA. כפי שמוצג כאן, ניתן להשתמש במגוון כתמים בהתאם לרקמה המשמשת לבניית ה- TMA.

וימנטין משמש כבקרת איכות. U6 הוא אינדיקטור לאיכות RNA. EBER משמש לקביעת מצב EBV.

ו- CD20 הוא סמן של תאי B כדי לציין את נוכחותם של תאי B. אלה הם כמה כתמים שניתן להשתמש בהם כדי לעזור לאמת את ה- TMA שלך. לאחר צפייה בסרטון זה, עליך להבין כיצד ליצור מיקרו-מערך רקמות באמצעות שיטת הקלטת ומדוע TMAs הם כלי מחקר חשובים לחיסכון בזמן ובמשאבים.

עליכם גם להבין כי בניית TMA אינה תהליך אידיאלי וכי המשך ההנחיה והסקירה הפתולוגית הם מרכיבים קריטיים לא רק במהלך תהליך הבנייה אלא גם עבור מחקרים אימונוהיסטוכימיים המבוצעים על מקטעי TMA על מנת להבטיח שהרקמה המעניינת אכן קיימת בסעיף TMA.