בדיקות אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים של גליומה מפושטת בקו האמצע בילדים

גליומה מפושטת בקו האמצע היא גידול פולשני מאוד במוח. שיטה זו מסייעת לחקור בזמן אמת כיצד תאי DMG נודדים ופולשים בהקשר תלת-ממדי עם תובנות ספציפיות על התפקיד הפוטנציאלי של מולקולת היצמדות מרכזית. על ידי שימוש בריאגנט תיוג ונוגדן ספציפי נגד CD44, אנו יכולים לחקור על ידי הדמיה של תאים חיים את הביטוי של CD44 על קרום הפלזמה על תאי DMG גם בנדידה תלת ממדית ופלישה.

היישום של טכניקה זו הדגיש את התפקיד הפוטנציאלי של CD44 בתנועתיות של תאים אלה, מה שמרמז על כך שהוא יכול לייצג מטרה מולקולרית פולשנית בעלת ערך. כדי להתחיל, rehydrate את ALR על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מים סטריליים ולערבב את הפתרון על ידי pipetting. מערבבים את הנוגדן עם ה-ALR בתווך TSM בצלחת מרובת בארות תחתונה עגולה או בצינור ענבר ומגנים עליו מפני אור.

הכינו כמות מספקת של המדיום כדי להוציא 25 מיקרוליטר לבאר בריכוז פי שלושה מהבדיקה הסופית ולאחר מכן דגרו בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לדלל BSR בתווך TSM בריכוז 1.5 מילימולרי כדי לקבל ריכוז סופי של 0.5 מילימולר בסוף הבדיקה. לאחר מכן בעדינות ובאיטיות להסיר 75 מיקרוליטר של המדיום מכל באר, הימנעות לגעת בתחתית הבאר שבו NS יושב ולבדוק את נוכחותו של NS חזותית.

הוסף בעדינות 25 מיקרוליטר של קומפלקס נוגדנים BSR ו- ALR לכל באר ולתת קומפלקס נוגדנים ALR להתערבב עם המדיום במשך שתיים עד שלוש דקות. באמצעות מיקרוסקופ הפוך, ודא שכל NS ממוקם במיקום מרכזי בתחתית הבאר. הימנע היווצרות של בועות על ידי הסרתם באמצעות מחט.

מניחים את הצלחת על קרח במשך חמש דקות כדי לתת לתחתית הצלחת להתקרר. יש להוציא 75 מיקרוליטר BMM לכל באר על ידי הנחת קצה P200 מקורר מראש על הקיר הפנימי של הבאר, תוך הימנעות מהיווצרות בועות ונגיעה בתחתית הבאר. השאירו את הצלחת על קרח למשך חמש דקות כדי לתת ל-BMM להתערבב עם המדיום.

באמצעות מיקרוסקופ הפוך, בדוק את המיקום של NS. ואם לא קיים באופן מרכזי, צנטריפוגו את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס ב 180 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר מכן העבירו את הצלחת במכשיר ניתוח התא החי הממוקם בתוך האינקובטור שנקבע על 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו -95% לחות. ברגע שהבארות מצופות ב-BMM, חותכים קצה P200.

קח 50 מיקרוליטר של מדיום התא ו- NS מכל באר שנבחרה והעבר אותו לבאר תחתית שטוחה מצופה. בדוק את הנוכחות ואת המיקום של NS בכל באר חזותית. מוסיפים בעדינות 50 מיקרוליטר של נוגדן BSR ו- ALR מדולל לכל באר, ומחכים שתיים עד שלוש דקות כדי לתת לריאגנטים להתערבב.

ובאמצעות מיקרוסקופ הפוך, ודא שרוב NS המשוכפל ממוקם במיקום מרכזי בבאר. לאחר הבטחת היעדר בועה, העבר בעדינות את הצלחת במכשיר ניתוח התא החי כפי שהודגם קודם לכן. בתוכנת המכשיר לניתוח תאים חיים, בחר את האפשרות לוח זמנים לרכישה, ולאחר מכן לחץ על כרטיסיית הפלוס ובחר סרוק לפי לוח הזמנים כדי לסרוק את הלוחות עם מרווחים כפי שהוזכר בכתב היד של הטקסט.

בחלון התוכנה, צור או שחזר כלי ולאחר מכן לחץ על האפשרות חדש. בחר סוג סריקה ספרואידית, פאזה בתוספת שדה בהיר, ערוצי תמונה ירוקים לבדיקת הפלישה ומטרה 4X. בחר סריקת שכפול דילול, מטרה מסוג 4X ופאזה וירוק עבור בדיקת ההעברה.

בחר את סוג הלוח והגדר את הבארות לסריקה על-ידי הדגשתן במפת הלוחות, ולאחר מכן הגדר את תדירות הסריקה. לחץ על הוסף ללוח זמנים והתחל בסריקה. בחר בכרטיסיה צור הגדרת ניתוח חדשה.

לאחר מכן בחר פלישה ספרואידית או יישום אנלייזר בסיסי לפלישה והגירה בהתאמה בכרטיסייה. בחרו בערוצים המתאימים לפלישה ולהעברה בערוץ התמונה. בחרו כמה תמונות מייצגות משלוש עד ארבע בארות לתצוגה מקדימה ולליטוש הגדרת הניתוח.

עבור מבחן הפלישה, בכרטיסייה הגדרת ניתוח, התאם את הגדרות היישום בשדה הבהיר ובערוצים הירוקים עם ההגדרות המוזכרות בכתב היד של הטקסט כדי ליצור פילוח מדויק בין התאים הספרואידים לתאים הפולשים. עבור בדיקת העברה, התאם את הגדרות היישום כפי שהוזכר בכתב היד של הטקסט בפאזה ובערוצים הירוקים כדי ליצור פילוח מדויק בין המפגש לתאים הירוקים. בדוק שהגדרות הניתוח נכונות עבור NS על ידי לחיצה אקראית על מספר בארות.

בחר את הבארות ונקודות הזמן לניתוח. שמור את הגדרת הניתוח ולחץ על סיום. התמונות הקונפוקליות האימונופלואורסצנטיות המייצגות של ביטוי CD44 בתאים ראשוניים שמקורם בחולה DMG הדגימו את התפקיד של CD44 בנדידת תאים ופלישה.

אימונוכימיה חיה של תאים תלת-ממדיים מאפשרת הדמיה של ביטוי CD44. המסגרות המייצגות של חלוף הזמן הן עבור הגירה והן עבור פלישה מראות את נוכחותו והיעדרו של אות פלואורסצנטי ירוק על אותו תא שנצפה לאורך זמן, דבר המצביע על כך שהביטוי של CD44 מופעל ונכבה בזמן שתאים נודדים ופולשים. תהליכי ההגירה והפלישה מבוצעים במשך 96 שעות, ומראים תאי QCTB-R059 עם רמה גבוהה של CD44.

כימות ביטוי CD44 וגידולו לאורך זמן נמדדו על ידי האות הפלואורסצנטי הירוק הכולל הקשור ל- ALR הן להגירה והן לפלישה. כאשר נוגדן אנטי CD44 משמש על תאים חיים, הוא משפיע על המורפולוגיה של התא, גרימת מעבר מפלישה דמוית מזנכימלית לפלישה דמוית אמבוידים והפחתה של יכולת פולשנית ונדידה של תאים אלה. השלב הקריטי ביותר בשיטה הוא ערבוב של מגיב תיוג עם נוגדן, הוספת התערובת למטריג'ל ולמדיום, וגישה למכשיר הדמיה של תאים חיים.

שיטה זו יכולה להיות מיושמת עוד יותר על ידי שימוש בשני או יותר ריאגנטים תיוג ייחודיים ונוגדנים כדי לחקור את האינטראקציה של תאי DMG בתיווך תאים ישירים ומגע. השיטה שלנו מציעה כלים חדשים לחקור בתלת-ממד את המנגנונים התאיים והמולקולריים של נדידת DMG ופלישה, ומספקת כיוונים חדשים לעיכוב הפנוטיפ החודר שלהם.