הדמיה תלת מימדית של המטריצה החוץ תאית של הכבד במודל עכבר של דלקת כבד לא אלכוהולית

NASH היא אחת ממחלות הכבד הכרוניות החשובות ביותר בעולם. זה יכול להתקדם פיברוזיס, שחמת, ובסופו של דבר סרטן הכבד. חקר השינוי הדינמי של ECM ב-NASH יכול לעזור להבין את הפיברוזיס טוב יותר.

הדמיה מסורתית אינה יכולה להדגים שינויים במבנה ECM תלת-ממדי, מה שמגביל את ההבנה של תהליך עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס של הכבד. כדי להתחיל, לשקול את העכבר לפני ההליך. לאחר הרדמה, העכבר לגלח את אזור הגחון באמצעות קוצץ שיער ולחטא את העור עם 70% אתנול.

הניחו את העכבר על גבו ושתקו את הרגליים על לוח הניתוחים בעזרת נייר דבק. השתמש במספריים של מאיו ומלקחיים אדסון כדי לבצע חתך של שלושה סנטימטרים לרוחב בבטן התחתונה. ואז חתך של חמישה סנטימטרים אנכית מהבטן התחתונה לתהליך הקסיפואיד מבלי לפתוח את חלל החזה.

לאחר פתיחת הצפק, מניחים בעדינות את המעיים משמאל לחיה ומרימים את האונה הימנית של הכבד עם מוליך קצוות קרניים כדי לחשוף את וריד הפורטל. כדי לצנתר את הווריד הפורטלי, יש להכניס צנתר IV בעל מד 24 לקצה הדיסטלי של וריד הפורטל. הניחו את קצה הצנתר לפני שווריד הפורטל מסתעף לאונות הכבד.

למשוך את המחט מיד כאשר הצנתר נכנס לווריד. בדוק כי הצנתר ממוקם כראוי בתוך הווריד על ידי ניקוב הכבד עם PBS באמצעות מזרק של מיליליטר אחד דרך הצנתר. השתמש במלקחיים מיקרו של Dumont, מיקרו-מחט Castroviejo ותפר 4-0 כדי להניח תפר מתחת להסתעפות של וריד הפורטל ותפר שני סנטימטר אחד מתחת כדי לאבטח את הצנתר.

חברו את הצנתר לצינור סיליקון באורך מטר, בקוטר פנימי של שלושה מילימטר ובקוטר חיצוני של 4.1 מילימטר באמצעות מחבר פיתוי. חברו את צינורות הסיליקון למשאבה פריסטלטית ולמאגר מים שעברו דה-יוניזציה. הסר בזהירות את בועות האוויר בתוך הצינור והימנע מיצירת בועות חדשות במהלך הזילוח.

הגדר את המשאבה הפריסטלטית בתפוקת זרימה של 0.2 מיליליטר לדקה. יש לעיין תחילה במים שעברו דה-יוניזציה במשך שעתיים וצבע הכבד ישתנה מאדום לצהוב במהלך הזילוח. החליפו את תמיסת הזילוח ל-0.5% נתרן דאוקסיכולאט והמשיכו למשך הלילה והכבד יהפוך לבן בסוף הזילוח.

החליפו את תמיסת הזילוח למים נטולי יונים, ונתזה למשך שעתיים. השתמשו במלקחיים מיקרו של Dumont ובמספריים של מיקרוס כדי לאסוף את הכבד נטול התאים ולשטוף אותו בזהירות בצלחת פטרי עם PBS. מעבירים חתיכה קטנה של כבד נטול תאים לשקופית מיקרוסקופ ומניחים את הרקמה באמצע.

הוסף 10 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה נגד דהייה לרקמה עם פיפטה כדי למנוע התייבשות רקמות. מכסים את הרקמה בזכוכית כיסוי ומפעילים כוח קטן כדי לשטח את הדגימה. אטמו את שולי זכוכית הכיסוי בלק חסר צבע ושקוף.

הניחו טיפה של שמן טבילה על החלק העליון של זכוכית הכיסוי והניחו את המגלשה על מחזיק המגלשה במיקרוסקופ. מנמיכים את עדשת האובייקט עם שמן 20X עד שהיא באה במגע עם שמן הטבילה. עבור לערוץ הסגול באורך גל 405 ננומטר.

הפעל את התריס ומקד את הדגימה. נווט ומקם את תחום העניין להדמיה. כבה את התריס לפני המעבר לרכישת תמונה באמצעות אור לייזר.

כדי להפעיל את לייזר שני הפוטון, עבור לבקרת המחשב והפעל תחילה את לייזר שני הפוטון. לאחר מכן הפעל את בקר הלייזר והתריס של שני הפוטון, וודא שהספק היציאה גבוה מ- 2.5 וואט. הפחת את עוצמת הלייזר כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית.

בחר והתאם גלאים הן מכפילי תמונה והן היברידי כדי להתאים לפלואורופורים שנבחרו. בחר רכישות תמונה בו-זמניות או רציפות. התאם את חור הסיכה לערך הגבוה ביותר.

התאם את אורכי הגל של הלייזר, הרווח, העוצמה, קזז את זמן השהייה של הפיקסלים, ממוצע גודל הפיקסלים והזום. גלול בבקר Z של המחשב והגדר את מידות Z. הגדר את נקודות ההתחלה והסיום ובחר את מספר התמונות שניתנו באמצעי אחסון.

רכוש תמונות. לאחר ביצוע שני מיקרוסקופיית פוטונים, סיבי קולגן ללא דה-צלולריזציה חשפו תמונה ברזולוציה נמוכה של רשת הקולגן. במטריצה החוץ-תאית הדה-תאית נצפו הבדלים ניכרים במורפולוגיה ובהתפלגות המרחבית בין כבד דיאטת צ'או לכבד דיאטת מזון מהיר.

סיבי קולגן ועכברים בדיאטת צ'או הציגו רשת משולבת ומאורגנת היטב, בעוד שהעכברים שקיבלו דיאטת מזון מהיר הראו חבילות קולגן עם פחות קישוריות. המבנה התלת-ממדי של המטריצה החוץ תאית בכבד מראה כי סיבי הקולגן בעכברים שקיבלו דיאטת צ'או הראו רשת מאורגנת היטב, אך לא בעכברי דיאטת מזון מהיר. כדי לאשר את איכות הקולגן הפיברילרי במטריצה החוץ תאית הדה-צלולרית, השקופיות הוכתמו בהמטוקסילין אאוסין ובאדום פיקרוסיריוס (Picrosirius).

Hematoxylin ו Eosin להראות כי כל התאים הוסרו. בתמונות הצביעה האדומה של פיקרוסיריוס (Picrosirius), המטריצה החוץ-תאית של העכברים שניזונו מצ'או חשפה רשת מאורגנת היטב. לעומת זאת, עכברים בדיאטת מזון מהיר הראו סיבי קולגן צפופים יותר.

בזהירות להסיר את הבועה בתוך צינור לפני זילוח. הבועה תחסום את כלי הדם בכבד ותשפיע על הזלוף.