Name: הדמיה תלת מימדית של המטריצה החוץ תאית של הכבד במודל עכבר של דלקת כבד לא אלכוהולית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: חקור הדמיה תלת מימדית של מטריצה חוץ תאית בכבד במודל עכבר של דלקת כבד לא אלכוהולית. שיטה זו משפרת הבנת דינמיקת ECM ומסייעת בחקר פיברוזיס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים להיסוק פארק על העזרה הטכנית. מחקר זה נתמך על ידי מימון מהמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, ל- NJT), המכון הלאומי להזדקנות (NIA), NIH (1R01AG060726, ל- NJT). אנו מודים לג'ון מלהולנד וקיטי לי ממתקן הדימות למדעי התא במרכז בקמן על הסיוע הטכני בהדמיה במיקרוסקופ של שני פוטונים.

ניסויים בבעלי חיים מבוצעים על פי נהלי הניסוי שאושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUCs) של אוניברסיטת סטנפורד ובית החולים לענייני חיילים משוחררים בפאלו אלטו. עכברים זכרים בני 6-8 שבועות C57BL/6J הוזנו בצ'או או בתזונה של מזון מהיר בתוספת סירופ תירס עתיר פרוקטוז 4.2% (ראו טבלת חומרים) במי שתייה במשך 14 שבועות5. העכברים הוחזקו בכלובים סטנדרטיים במחזור חושך/אור של 12 שעות.
1. הכנה כירורגית ונהלים של זילוח הכבד
<ol><li>שקול את העכבר לפני ההליך.</li>
	<li>מרדימים את העכבר על ידי מתן קטמין (90 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים) באמצעות הזרקה תוך צפקית. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין על ידי צביטת בוהן לפני שתמשיך לשלב הבא. הערה: אין צורך באיזופלורן כאן מכיוון שמדובר בניתוח שאינו הישרדותי.</li>
	<li>יש לגלח את אזור הגחון באמצעות קוצץ שיער ולחטא את העור באתנול 70%. הנח את העכבר על גבו, ולשתק את הרגליים על לוח הניתוחים עם קלטת.</li>
	<li>לאחר אישור מחדש של עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן, השתמש במספריים של מאיו ומלקחיים אדסון (ראה טבלת חומרים) כדי לבצע חתך של 3 ס"מ לרוחב בבטן התחתונה ולאחר מכן חתך של 5 ס"מ אנכית מהבטן התחתונה לתהליך הקסיפואיד. היזהר לא לפתוח את חלל החזה.</li>
	<li>לאחר פתיחת הצפק, מניחים בעדינות את המעיים משמאל לבעל החיים, ומרימים את האונה הימנית של הכבד עם מוליך עם קרני ריון (ראו טבלת חומרים) כדי לחשוף את הווריד הפורטלי.</li>
	<li>צנתור את הווריד הפורטלי באמצעות צנתר 24 G IV. הכנס את הצנתר לקצה הדיסטלי של וריד הפורטל. הניחו את קצה הצנתר לפני שווריד הפורטל מסתעף לאונות הכבד.</li>
	<li>למשוך את המחט מיד כאשר הצנתר נכנס לווריד. בדוק כי הצנתר ממוקם כראוי בתוך הווריד על ידי ניקוב הכבד עם PBS באמצעות מזרק 1mL דרך הצנתר. הערה: עם זילוח PBS, כל האונות צריכות להתכווץ מיד. אם הצנתר ממוקם כראוי, דם ורידי יזרום במהירות דרך הצנתר.</li>
	<li>השתמש במלקחיים מיקרו של Dumont, מחזיק מיקרו-מחט Castroviejo, ותפר 4-0 (ראה טבלת חומרים) כדי להניח תפר מתחת להסתעפות של וריד הפורטל ותפר שני 1 ס"מ מתחת כדי לאבטח את הצנתר.</li>
</ol>2. דה-צלולריזציה של רקמות
<ol><li>חבר את הצנתר לצינור סיליקון (~ 1 מ 'אורך, 3 מ"מ קוטר פנימי וקוטר חיצוני 4.1 מ"מ) עם מחבר Luer. חברו את צינורות הסיליקון למשאבה פריסטלטית ולמאגר המכיל מים שעברו דה-יוניזציה (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>הסר בזהירות את בועות האוויר בתוך הצינור והימנע מיצירת בועות חדשות במהלך הזילוח. הגדר את המשאבה הפריסטלטית בתפוקת זרימה של 0.2 מ"ל/דקה (כלומר, 288 מ"ל/24 שעות).</li>
	<li>יש לערבב תחילה עם מים שעברו דה-יוניזציה (~ 50 מ"ל / עכבר) למשך שעתיים. צבע הכבד ישתנה מאדום לצהוב במהלך הזילוח. הערה: תוקף בעל החיים יפוג לאחר 10 דקות של זילוח.</li>
	<li>החליפו את תמיסת הזילוח לנתרן דאוקסיכולאט 0.5% (wt/vol) (DOC, ראו טבלת חומרים) והמשיכו למשך הלילה (18 שעות, ~250 מ"ל/עכבר). הכבד יהפוך לבן בסוף הזילוח (איור 1).</li>
	<li>החליפו את תמיסת הזילוח למים שעברו דה-יוניזציה (~ 50 מ"ל/עכבר) ונתזה למשך שעתיים.</li>
	<li>השתמשו במלקחיים זעירים של Dumont ובמספריים מיקרו-קפיציים (ראו טבלת חומרים) כדי לאסוף את הכבד שעבר דה-צלולריזציה ולשטוף אותו בזהירות בצלוחית פטרי עם PBS.</li>
	<li>חתכו את הרקמה הדה-צלולרית לחתיכות קטנות לצורך הדמיה מיידית או הקפיאו בטמפרטורה של -80°C לאנליזה ביוכימית נוספת כגון ספקטרומטריית מסות טנדם, ELISA או כתם מערבי.</li>
</ol>3. הכנת שקופיות להדמיה (במיקרוסקופ פלואורסצנטי מולטיפוטון/קונפוקל)
<ol><li>מעבירים חתיכה קטנה של כבד נטול תאים (<3 x 3 x 3 מ"מ) לשקופית מיקרוסקופ ומניחים את הרקמה באמצע.</li>
	<li>הוסף 10 μL של אמצעי הרכבה נגד דהייה (ראה טבלת חומרים) לרקמה עם פיפטה כדי למנוע התייבשות רקמות.</li>
	<li>מכסים את הרקמה בזכוכית כיסוי ומפעילים כוח קטן כדי לשטח את הדגימה. אטמו את שולי זכוכית הכיסוי בלק חסר צבע ושקוף (איור 2). הערה: בשל קיבוע שני הפוטון הזקוף דרך המיקרוסקופ, נעשה שימוש בזכוכית כיסוי על הדגימה. עם זאת, ניתן למקם דגימות באופן שונה אם משתמשים במיקרוסקופ הפוך.</li>
</ol>4. רכישת תמונות
<ol><li>הניחו טיפת שמן טבילה על החלק העליון של זכוכית הכיסוי והניחו את המגלשה על מחזיק המגלשה במיקרוסקופ. מנמיכים את עדשת האובייקט עם שמן 20x עד שהיא באה במגע עם שמן הטבילה.</li>
	<li>עבור לערוץ הסגול (405 ננומטר), הפעל את התריס והתמקד בדגימה. נווט ומקם את תחום העניין להדמיה. כבה את התריס לפני המעבר לרכישת תמונה באמצעות אור לייזר.</li>
	<li>עבור לפקד המחשב והפעל את הלייזר של שני פוטונים. הפעילו תחילה את הלייזר הדו-פוטוני (איור 3A), ואז הפעילו את בקר הלייזר הדו-פוטוני (ראו טבלת חומרים) ואת התריס (איור 3B,C). ודא שהספק המוצא גבוה מ- 2.5 ואט. הפחת את עוצמת הלייזר כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית. בחר והתאם גלאים (הן מכפילי אור והן היברידיים) כדי להתאים לפלואורופורים שנבחרו. הערה: הדמיה של שני פוטונים בוצעה באורך גל עירור של 860 ננומטר. שתי תעלות נבחרו עבור תמונות קולגן SHG ושני פוטונים מעוררים פלואורסצנטיים (TPEF), בהתאמה. ערוץ אחד המתאים לטווח אורכי גל של 415-445 ננומטר זיהה את המבנה המפורט של קולגן מאותות SHG. ערוץ נוסף כיסה את הטווח של 465-669 ננומטר לאיסוף אותות TPEF.</li>
	<li>בחר רכישות תמונה בו-זמניות או רציפות. התאם את חור הסיכה לערך הגבוה ביותר. התאם את אורכי הגל של הלייזר, הרווח, ההספק וההסטה. התאימו את זמן השהייה של הפיקסלים, את גודל הפיקסלים, הממוצע ואת הזום (איור 4A).</li>
	<li>גלול בבקר z של המחשב והגדר את ממדי z, הגדר את נקודות ההתחלה והסיום, ובחר את מספר התמונות הנתון באמצעי אחסון (z-stack). רכוש תמונות. הערה: כאן נבחר נפח Z של 20 מיקרומטר וגודל של 1 מיקרומטר Z-step (איור 4B).</li>
</ol>

<ol><li>Friedman, S. L., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+fibrosis%3A+2022+unmet+needs+and+a+blueprint+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future.</a> Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).</li>
<li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence%2C+incidence%2C+and+outcomes+of+non-obese+or+lean+non-alcoholic+fatty+liver+disease%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).</li>
<li>Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fibrosis+development+in+non-alcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).</li>
<li>Arteel, G. E., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+matrisome+-+looking+beyond+collagens%5BTitle%5D)+AND+%22JHEP+Reports%22%5BJournal%5D)">The liver matrisome - looking beyond collagens.</a> JHEP Reports. 2 (4), 100115(2020).</li>
<li>Jiang, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonphagocytic+activation+of+NOX2+is+implicated+in+progressive+non-alcoholic+steatohepatitis+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging.</a> Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).</li>
<li>Dehnad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGER1+downregulation+associates+with+fibrosis+in+non-alcoholic+steatohepatitis+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cirrhotic+human+liver+extracellular+matrix+3D+scaffolds+promote+smad-dependent+tgf-beta1+epithelial+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition.</a> Cells. 9 (1), 83(2019).</li>
<li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alterations+in+the+extracellular+matrix+composition+guide+the+repair+of+damaged+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue.</a> Scientific Reports. 6, 27398(2016).</li>
<li>Mattei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanostructure+and+composition+of+highly+reproducible+decellularized+liver+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices.</a> Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).</li>
<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).</li>
<li>Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+cancer%3A+A+strained+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and cancer: A strained relationship.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356(2020).</li>
<li>Cox, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+matrix+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The matrix in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).</li>
<li>Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tissue+engineering+as+an+emerging+alternative+for+liver+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+for+liver+bioengineering+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079(2015).</li>
<li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+system+for+liver+tissue+mimicking+hepatic+plates+for+improvement+of+human+hepatocyte+%28C3A%29+function+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity.</a> BioMed Research International. 2020, 6354183(2020).</li>
<li>Shimoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+scaffolds+promote+liver+regeneration+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12543(2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים בנוגע למאמר זה.

הפרוטוקול הנוכחי מראה כי דה-צלולריזציה באמצעות זילוח DOC באתרו בקצב זרימה נמוך משמרת את מבני הקולגן התלת-סלילי והפיברילרי הטבעי, ומספקת פלטפורמה אמינה וחסכונית ללכידת עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס כבד NASH. למרות שדה-צלולריזציה בוצעה בכבדים רגילים ופיברוטיים לפני זיהוי רכיבי ECM או יצירת פיגומים ביולוגיים לתרבית תאים, הדינמיקה של עיצוב מחדש של ECM בפיברוזיס בכבד לא נחקרה היטב 8,9,10. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לערוך השו...

מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) היא מחלת הכבד הנפוצה ביותר, המשפיעה על 20%-25% מהאוכלוסייה הבוגרת. 25% מחולי NAFLD מתקדמים לסטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH), שם הסיכון לשחמת, אי ספיקת כבד וקרצינומה הפטוצלולרית עולה1. ב-20 השנים הבאות, ההערכה היא כי NASH יהיה אחראי ל-2 מיליון מקרי מוות הקשורים לכבד בארה"ב2. מכיוון שאין טיפולים מאושרים, יש צורך דחוף לפענח את המנגנונים הגורמים לפיברוזיס בכבד בחולי NASH ולפתח טיפול ממוקד3.
המטריצה החוץ תאית (ECM) היא מיקרו-סביבה דינמית ומורכבת המפעילה תקשורת דו-כיוונית עם תאים כדי לווסת את הומאוסטזיס רקמות4. ECM הכבד מורכב מאלמנטים מבניים כגון פרוטאוגליקנים, קולגן, פיברונקטין (fibronectin), אלסטין וחלבונים לא מבניים אחרים (למשל, אולפקטומדין וטרומבוספונדין) כדי לספק תמיכה פיזית ומבנית4.
פיברוזיס בכבד היא תגובה כרונית לריפוי פצעים לנזק לכבד של אטיולוגיות שונות, כולל NASH3. היא נובעת מחוסר איזון בתהליך העיצוב מחדש הדינמי של מטריצת ECM ומאופיינת בעודף חלבונים מבניים בכבד הפגוע4. פיברוגנזה תלויה בתקשורת התא-תא הדינמית בין סוגים שונים של תאי כבד. תאי סטלט בכבד (HSCs), כאשר הם מופעלים, מתמיינים לתאים דמויי מיופיברובלסטים המבטאים, נודדים ומתרבים של אקטין שריר חלק ומסנתזים חלבוני ECM כפעולה לסגירת פצעים. HSCs פעילים הם התאים המרכזיים מייצרי הקולגן בכבד1.
המנגנון המולקולרי של עיצוב מחדש של ECM, דפוסי פיברוזיס והקשר שלהם לאירועים תאיים אינם ברורים. עדיין נדרשת הבנה טובה יותר של מבנה ה-ECM התלת-ממדי (3D), למרות שטכניקות ספקטרומטריית מסות סייעו לנתח את הרכב החלבונים ECM4. באופן מסורתי, כתם הטריכרום של מאסון, הכתמים האדומים של פיקרו סיריוס והדמיית הדור ההרמוני השני (SHG) בוצעו על קטעי כבד דקים דו-ממדיים (דו-ממדיים). דפוס הפיברוזיס הטיפוסי של NASH נקרא "חוט תרנגולת", אשר משתרע לאזור 3 והוא פיברוזיס perisinusoidal/pericellular 5,6. עם זאת, חסרים מחקרים המתמקדים במבנה התלת-ממדי של הכבד הטבעי, במיוחד אלה שאינם כרוכים בחתך רקמות. גישות הדמיה חזקות לזיהוי דפוסים ומאפיינים של פיברוזיס במהלך עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס בכבד יחזקו באופן משמעותי את ההבנה של מנגנוני NASH ויזהו מטרות טיפוליות חדשות.
כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פרוטוקול מהיר ויעיל הותאם להדמיה של ECM הכבד המקורי באמצעות דה-צלולריזציה7. דה-צלולריזציה של כל הכבד היא גישה להסרת התוכן התאי בכבד תוך שמירה על רשת ECM תלת-ממדית מקורית באמצעות זילוח חומרי ניקוי. עכברים הוזנו בצ'או או בדיאטת מזון מהיר (FFD) במשך 14 שבועות. דה-צלולריזציה בוצעה לאחר זילוח ורידים פורטלי באתרו עם חומר ניקוי עדין וספיקות נמוכות כדי לשמר מבני קולגן תלת-סליליים ופיברילריים מקומיים. מיקרוסקופ שני פוטונים יושם כדי לנתח שינויים במבני קולגן ב- ECM. התמונות התלת-ממדיות של מבנה ה-ECM המקורי בכבדים רגילים ובכבדי NASH שוחזרו ונותחו. ביצוע דה-צלולריזציה של זילוח באתרו וניתוח הפיגום במיקרוסקופ של שני פוטונים מספק פלטפורמה מעשית ובמחיר סביר לדמיין את העיצוב מחדש הדינמי של ECM בכבד.

<table><tbody><tr><td>4-0 מונוקריל לא צבוע 1 x 18 אינץ' P-3</td><td>מונוקריל</td><td>Y494G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 תפר</td><td>פישר מדעי</td><td>10-000-649</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true</td></tr><tr><td>הזרקת AnaSed (קסילזין)</td><td>AnaSed</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>תרופה זו לשימוש על ידי או בהוראת וטרינר מורשה.</td></tr><tr><td>BD INSYTE AUTOGUARD I.V. קטטר עם טכנולוגיית BC</td><td></td><td></td><td></td></tr> BD 382612 <tr><td>דיאטת צ'או</td><td>Envigo</td><td># 2918</td><td>דיאטת בקרה. נוסחה קבועה, תזונה שאינה ניתנת לחיטוי המיוצרת עם מרכיבים באיכות גבוהה ומיועדת לתמוך בהריון, הנקה וצמיחה של מכרסמים.</td></tr><tr><td>דיאטת מזון מהיר (AIN76A דיאטה מערבית)</td><td>בדיקת דיאטה</td><td>1810060</td><td></td></tr><tr><td>https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf ערכת כתמי המטוקסילין ואאוזין</td><td>vectorlabs</td><td>H-3502</td><td>https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html</td></tr><tr><td>ערכת ניתוח חולדה מדעית של קנט</td><td>פישר מדעי</td><td>13-005-205</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit</td></tr><tr><td>הזרקת קטמין הידרוכלוריד</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06 - 10 מ"ל - בקבוקון.</td><td>KetaVed נחקר קלינית בפרימטים תת-אנושיים בנוסף למינים המפורטים תחת ניהול ומינון.</td></tr><tr><td>Leica SP5 זקוף קונפוקל, מחבר</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td>Luer מרובה פוטונים</tr><tr><td>(תא עצירה תלת כיווני עם SPIN-LOCK&reg;)</td><td>bbraun</td><td>D300</td><td>https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html</td></tr><tr><td>Picrosirius ערכת כתמים אדומים</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24901</td><td></td></tr><tr><td>https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 זהורית קצה מוליך</td><td>puritan</td><td>25-806 1PR</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולט</td><td>sigmaaldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>סירופ</td><td>www.target.com</td><td>24 אונקיות נוזל</td><td>https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801</td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית במהירות משתנה</td><td>INTLLAB</td><td>BT100</td><td>https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade הרכבה וקטור בינוני</td><td>מעבדות</td><td>H-1000-10</td><td>https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html</td></tr></tbody></table>

הדמיה תלת מימדית של המטריצה החוץ תאית של הכבד במודל עכבר של דלקת כבד לא אלכוהולית

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

סטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH) היא מחלת הכבד הכרונית הנפוצה ביותר בארצות הברית, המשפיעה על יותר מ -70 מיליון אמריקאים. NASH יכול להתקדם לפיברוזיס ובסופו של דבר לשחמת הכבד, גורם סיכון משמעותי לקרצינומה הפטוצלולרית. המטריצה החוץ תאית (ECM) מספקת תמיכה מבנית ושומרת על הומאוסטזיס בכבד באמצעות אותות מטריתיים. פיברוזיס בכבד נובע מחוסר איזון בתהליך העיצוב מחדש הדינמי של ECM ומאופיין בהצטברות יתר של אלמנטים מבניים ושינויים נלווים בגליקוזאמינוגליקנים. דפוס הפיברוזיס הטיפוסי של NASH נקרא "חוט עוף", אשר בדרך כלל מורכב מפיברוזיס perisinusoidal/pericellular zone 3, בהתבסס על תכונות שנצפו על ידי כתם טריכרום של Masson וכתמים אדומים Picrosirius. עם זאת, טכניקות הדמיה מסורתיות דו-ממדיות (2D) מבוססות שקופיות רקמה אינן יכולות להדגים את השינויים המבניים המפורטים של ECM תלת-ממדי (3D), ומגבילים את ההבנה של עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס בכבד.
העבודה הנוכחית אופטימיזציה פרוטוקול מהיר ויעיל כדי לדמות את מבנה ECM המקורי בכבד באמצעות decellularization כדי להתמודד עם האתגרים לעיל. עכברים הוזנו בצ'או או במזון מהיר במשך 14 שבועות. דה-צלולריזציה בוצעה לאחר זילוח ורידים פורטלי באתרו , וטכניקות המיקרוסקופ הדו-פוטוני יושמו כדי לצלם ולנתח שינויים ב-ECM המקורי. התמונות התלת-ממדיות של הכבד הנורמלי והכבד NASH שוחזרו ונותחו. ביצוע דה-צלולריזציה של זילוח באתרו וניתוח הפיגום על ידי מיקרוסקופ של שני פוטונים סיפקו פלטפורמה מעשית ואמינה לדמיין את העיצוב מחדש הדינמי של ECM בכבד.

סיבי הקולגן זוהו באמצעות יצירה הרמונית שנייה ומיקרוסקופ של שני פוטונים. האות מגיע ממבני הקולגן התלת-סלילי והפיברילרי הטבעי. נוגדנים ספציפיים לא שימשו לניתוח תת-סוגים של קולגן; עם זאת, ניתן להוסיף זאת לטכניקת ההדמיה.
כאשר רקמת הכבד נחקרת ללא דה-צלולריזציה, מאתגר לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה של רשת הקולגן (איור 5A). באק"מ דה-צלולרי, סיבי קולגן (ירוק) נראים מקבילים או שזורים זה בזה (איור 5B). היו הבדלים ב...

הפרוטוקול הנוכחי מייעל את שיטות זילוח / דה-צלולריזציה באתרו של הכבד ושיטות מיקרוסקופיה של שני פוטונים כדי ליצור פלטפורמה אמינה להמחשת הדינמיקה של עיצוב מחדש של מטריצה חוץ-תאית (ECM) במהלך סטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH).

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

NASH היא אחת ממחלות הכבד הכרוניות החשובות ביותר בעולם. זה יכול להתקדם פיברוזיס, שחמת, ובסופו של דבר סרטן הכבד. חקר השינוי הדינמי של ECM ב-NASH יכול לעזור להבין את הפיברוזיס טוב יותר.הדמיה מסורתית אינה יכולה להדגים שינויים במבנה ECM תלת-ממדי, מה שמגביל את ההבנה של תהליך עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס של הכבד. כדי להתחיל, לשקול את העכבר לפני ההליך. לאחר הרדמה, העכבר לגלח את אזור הגחון באמצעות קוצץ שיער ולחטא את העור עם 70% אתנול.הניחו את העכבר על גבו ושתקו את הרגליים על לוח הניתוחים בעזרת נייר דבק. השתמש במספריים של מאיו ומלקחיים אדסון כדי לבצע חתך של שלושה סנטימטרים לרוחב בבטן התחתונה. ואז חתך של חמישה סנטימטרים אנכית מהבטן התחתונה לתהליך הקסיפואיד מבלי לפתוח את חלל החזה.לאחר פתיחת הצפק, מניחים בעדינות את המעיים משמאל לחיה ומרימים את האונה הימנית של הכבד עם מוליך קצוות קרניים כדי לחשוף את וריד הפורטל. כדי לצנתר את הווריד הפורטלי, יש להכניס צנתר IV בעל מד 24 לקצה הדיסטלי של וריד הפורטל. הניחו את קצה הצנתר לפני שווריד הפורטל מסתעף לאונות הכבד.למשוך את המחט מיד כאשר הצנתר נכנס לווריד. בדוק כי הצנתר ממוקם כראוי בתוך הווריד על ידי ניקוב הכבד עם PBS באמצעות מזרק של מיליליטר אחד דרך הצנתר. השתמש במלקחיים מיקרו של Dumont, מיקרו-מחט Castroviejo ותפר 4-0 כדי להניח תפר מתחת להסתעפות של וריד הפורטל ותפר שני סנטימטר אחד מתחת כדי לאבטח את הצנתר.חברו את הצנתר לצינור סיליקון באורך מטר, בקוטר פנימי של שלושה מילימטר ובקוטר חיצוני של 4.1 מילימטר באמצעות מחבר פיתוי. חברו את צינורות הסיליקון למשאבה פריסטלטית ולמאגר מים שעברו דה-יוניזציה. הסר בזהירות את בועות האוויר בתוך הצינור והימנע מיצירת בועות חדשות במהלך הזילוח.הגדר את המשאבה הפריסטלטית בתפוקת זרימה של 0.2 מיליליטר לדקה. יש לעיין תחילה במים שעברו דה-יוניזציה במשך שעתיים וצבע הכבד ישתנה מאדום לצהוב במהלך הזילוח. החליפו את תמיסת הזילוח ל-0.5% נתרן דאוקסיכולאט והמשיכו למשך הלילה והכבד יהפוך לבן בסוף הזילוח.החליפו את תמיסת הזילוח למים נטולי יונים, ונתזה למשך שעתיים. השתמשו במלקחיים מיקרו של Dumont ובמספריים של מיקרוס כדי לאסוף את הכבד נטול התאים ולשטוף אותו בזהירות בצלחת פטרי עם PBS. מעבירים חתיכה קטנה של כבד נטול תאים לשקופית מיקרוסקופ ומניחים את הרקמה באמצע.הוסף 10 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה נגד דהייה לרקמה עם פיפטה כדי למנוע התייבשות רקמות. מכסים את הרקמה בזכוכית כיסוי ומפעילים כוח קטן כדי לשטח את הדגימה. אטמו את שולי זכוכית הכיסוי בלק חסר צבע ושקוף.הניחו טיפה של שמן טבילה על החלק העליון של זכוכית הכיסוי והניחו את המגלשה על מחזיק המגלשה במיקרוסקופ. מנמיכים את עדשת האובייקט עם שמן 20X עד שהיא באה במגע עם שמן הטבילה. עבור לערוץ הסגול באורך גל 405 ננומטר.הפעל את התריס ומקד את הדגימה. נווט ומקם את תחום העניין להדמיה. כבה את התריס לפני המעבר לרכישת תמונה באמצעות אור לייזר.כדי להפעיל את לייזר שני הפוטון, עבור לבקרת המחשב והפעל תחילה את לייזר שני הפוטון. לאחר מכן הפעל את בקר הלייזר והתריס של שני הפוטון, וודא שהספק היציאה גבוה מ- 2.5 וואט. הפחת את עוצמת הלייזר כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית.בחר והתאם גלאים הן מכפילי תמונה והן היברידי כדי להתאים לפלואורופורים שנבחרו. בחר רכישות תמונה בו-זמניות או רציפות. התאם את חור הסיכה לערך הגבוה ביותר.התאם את אורכי הגל של הלייזר, הרווח, העוצמה, קזז את זמן השהייה של הפיקסלים, ממוצע גודל הפיקסלים והזום. גלול בבקר Z של המחשב והגדר את מידות Z. הגדר את נקודות ההתחלה והסיום ובחר את מספר התמונות שניתנו באמצעי אחסון.רכוש תמונות. לאחר ביצוע שני מיקרוסקופיית פוטונים, סיבי קולגן ללא דה-צלולריזציה חשפו תמונה ברזולוציה נמוכה של רשת הקולגן. במטריצה החוץ-תאית הדה-תאית נצפו הבדלים ניכרים במורפולוגיה ובהתפלגות המרחבית בין כבד דיאטת צ'או לכבד דיאטת מזון מהיר.סיבי קולגן ועכברים בדיאטת צ'או הציגו רשת משולבת ומאורגנת היטב, בעוד שהעכברים שקיבלו דיאטת מזון מהיר הראו חבילות קולגן עם פחות קישוריות. המבנה התלת-ממדי של המטריצה החוץ תאית בכבד מראה כי סיבי הקולגן בעכברים שקיבלו דיאטת צ'או הראו רשת מאורגנת היטב, אך לא בעכברי דיאטת מזון מהיר. כדי לאשר את איכות הקולגן הפיברילרי במטריצה החוץ תאית הדה-צלולרית, השקופיות הוכתמו בהמטוקסילין אאוסין ובאדום פיקרוסיריוס (Picrosirius).Hematoxylin ו Eosin להראות כי כל התאים הוסרו. בתמונות הצביעה האדומה של פיקרוסיריוס (Picrosirius), המטריצה החוץ-תאית של העכברים שניזונו מצ'או חשפה רשת מאורגנת היטב. לעומת זאת, עכברים בדיאטת מזון מהיר הראו סיבי קולגן צפופים יותר.בזהירות להסיר את הבועה בתוך צינור לפני זילוח. הבועה תחסום את כלי הדם בכבד ותשפיע על הזלוף.

3d-imaging-liver-extracellular-matrix-mouse-model-non-alcoholic

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הדמיה תוך-חיונית יציבה ברזולוציה גבוהה של תאי חיסון בכבד היא מאתגרת. כאן אנו מספקים שיטה רגישה ואמינה ביותר לחקר נדידה ואינטראקציות תאים-תאים של תאים חיסוניים בכבד עכבר לאורך תקופות ארוכות (כ-6 שעות) על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר רב-פוטוני תוך-חיוני בשילוב עם ניטור טיפול נמרץ.

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

מוצג כאן הוא פרוטוקול לבידוד של העכבר hepatocytes מתוך כבדי העכבר למבוגרים באמצעות שונה קולגן הטכניקה הפרו הפרזיה. גם תיאר הוא התרבות ארוכת טווח של hepatocytes בקביעת כריך קולגן תלת-ממד, כמו גם immunolabeling של מרכיבים ציטושלד לחקר היווצרות המרה והתגובה שלה לטיפול.

בידוד וכריך קולגן 3D תרבות של העכבר הראשי Hepatocytes כדי ללמוד את התפקיד של שלד ציטוזה היווצרות של המרה בתוך מחוץ לגופית

פרוטוקול זה מציג מודל ביומימטי תלת מימדי עם תא סטרומה פיברוטית נלווית. מוכן עם הידרוג'לים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ביחסים המחקים את התכונות הביו-פיזיקליות של המטריצה החוץ-תאית הסטרומלית, מתווך פעיל של אינטראקציות תאיות, צמיחת גידולים וגרורות.

מודל ביומימטי לסרטן הכבד לחקר אינטראקציות גידול-סטרומה בסביבה תלת מימדית עם תכונות ביו-פיזיקליות מתכווננות

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בטכניקת אולטרסאונד משופרת כדי לבחון ולכומת באופן לא פולשני שינויים ברקמת הכבד במודלים מכרסמים של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי.

יישום של אולטראסאונד ו גל גזה אלסטוגרפיה הדמיה במודל חולדה של NAFLD / NASH

מחלות כבד נגרמות על ידי גורמים רבים המקדמים פיברוזיס או שחמת הכבד. השתלה היא האפשרות היחידה להחלים בריאות. עם זאת, בהתחשב במחסור באיברים הניתנים להשתלה, יש לחקור חלופות. המחקר שלנו מציע השתלת פיגומי קולגן ברקמת הכבד ממודל של בעלי חיים.

השתלת פיגומי מטריצת קולגן תלת מימדית כאסטרטגיית התחדשות הכבד

באמצעות מודל עכבר של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) הנגרמת על ידי דיאטה, אנו מתארים את השימוש בטכניקות הדמיה מיקרו-ממוחשבות חדשניות in vivo כשיטה לא פולשנית להערכת שלבי ההתקדמות של NAFLD, תוך התמקדות בעיקר ברשת כלי הדם בכבד בשל מעורבותה המשמעותית בחוסר ויסות כבד הקשור ל- NAFLD.

רומן in vivo טכניקות הדמיה טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת להערכת ההתקדמות של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי

מטרת מחקר זה הייתה לפתח מודל דיגיטלי תלת ממדי חדשני לאבחון מוקדם של פיברוזיס בכבד, הכולל את הנוקשות של כל ווקסל בכבד של המטופל ובכך יכול לשמש לחישוב יחס הפיזור של הכבד של המטופל בשלבי פיברוזיס שונים.

מודל דיגיטלי תלת מימדי לאבחון מוקדם של פיברוזיס בכבד המבוסס על אלסטוגרפיה בתהודה מגנטית

כאן אנו מתארים פלטפורמה המאפשרת הדמיה לא פולשנית in vivo של ספרואידים בכבד המושתלים בחדר הקדמי של עין העכבר. תהליך העבודה משתרע מיצירת ספרואידים מתאי כבד ראשוניים להשתלה בעין העכבר והדמיית in vivo ברזולוציה תאית במיקרוסקופ קונפוקלי.

In Vivo הדמיה של כדורי כבד המושתלים בחדר הקדמי של עין העכבר

מודל עכבר של מחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי (MASLD) עם תפקוד לקוי מטבולי, שינויים בביטוי גנים בכבד ושינויים היסטופתולוגיים בכבד הדומים ל-MASLD אנושי, כולל פיברוזיס המתקדם לפיברוזיס מתקדם שלב 3. מודל זה יכול לשמש במחקרים על פתופיזיולוגיה של MASLD ובמחקרים פרה-קליניים של טיפולים חדשים.

מודל עכבר של מחלת כבד סטאטוטית הקשורה להפרעות בתפקוד מטבולי עם פיברוזיס

פרוטוקול זה מציג כלי הדמיה כבדי רב-פעמי מתקדם (RHIT) למיקרוסקופיה תוך-חיונית (IVM) של עכברים חיים, המשפר את יציבות הרקמות בניסויים מהירים וחריפים. העיצוב המודפס בתלת-ממד של ה-RHIT מציע ייצור, יכולת הרחבה ורב-שימושיות חסכונית, ומאפשר תצפית ממושכת על תהליכים מטבוליים בעכברים בגדלים שונים.

כלי הדמיה כבדית רב-פעמי: כלי רב-פעמי מודפס בתלת-ממד למיקרוסקופיה תוך-חיונית בכבד

פרוטוקול זה מציג צינור הדמיה מקיף להמחשה ומידום מורפולוגיית תאי כוכב כבדיים ברקמת כבד שלמה. גישה זו משלבת תיוג פלואורסצנטי של פיברובלסטים באמצעות גנטיקה של עכברים, הכנת רקמה מבוססת פרפוזיה בכבד במקום , ושיטת ניקוי רקמות iDISCO מותאמת להשגת שקיפות אופטית.

מיפוי מורפולוגיית תאי כוכב כבדיים במודלים של עכברים של פיברוזיס כבד

חקור הדמיה תלת מימדית של מטריצה חוץ תאית בכבד במודל עכבר של דלקת כבד לא אלכוהולית. שיטה זו משפרת הבנת דינמיקת ECM ומסייעת בחקר פיברוזיס.

הדמיה תלת מימדית של המטריצה החוץ תאית של הכבד במודל עכבר של דלקת כבד לא אלכוהולית

גלה סרטונים נוספים