Name: מודל שחיקה אפיתליאלית לחקר ריפוי פצעי הקרנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: למד כיצד ליצור מודל שחיקה אפיתליאלית בקרנית עכברים לחקר ריפוי פצעים ודלקת הקרנית. שיטה זו מייצרת פצעים מדויקים וברי-השבה מבלי לפגוע בממברנת הבסיס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון: נתמך על ידי: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., ו- R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.), ומענק סיגמא שי בסיוע למחקר (P.K.A.). התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות, או סיגמא שי.

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת יוסטון ובמכללת ביילור לרפואה. ההנחיות שפורטו בהצהרת האגודה למחקר בראייה וברפואת עיניים (ARVO) בדבר השימוש בבעלי חיים בראייה ובמחקרי עיניים, בוצעו בטיפול בעכברים ובשימוש בהם.
1. הכנה
<ol><li>הכנת תמיסת פלואורסצין<ol>
<li>יש להכין תמיסת פלואורסציין של 1% על ידי המסת 10 מ"ג של מלח נתרן פלואורסציין ב-1 מ"ל של מלח סטרילי או מי מלח סטריליים 1x פוספטים (PBS). הערה: הכינו תמיסת נתרן פלואורסציין ביום השימוש או יום לפני כן כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי. כאשר מכינים זאת יום לפני השימוש, יש לאחסן את תמיסת הפלואורסצין במרחק של 4 מעלות צלזיוס מהאור. עוטפים צינורות בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנת תמונות.</li>
		<li>חלקו את התמיסה לאליפוטים המתאימים לשימוש בניסוי אחד. 1-1.5 μL של תמיסת פלואורסציין משמש לכל עכבר לכל נקודת זמן. השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את נפח ה- aliquot המתאים לניסוי יחיד: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63112/63112eq01.jpg"> הערה: לדוגמה, אם שישה עכברים נחקרים בניסוי יחיד עם גודל פצע מנוטר בחמש נקודות זמן, נפח האליקוט המתאים לניסוי יחיד זה יהיה: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63112/63112eq02.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת קוקטייל קטמין/קסילאזין להרדמה של עכברים.<ol>
<li>כדי להכין 10 מ"ל של קוקטייל, יש לערבב 2.0 מ"ל של קטמין (100 מ"ג/מ"ל) עם 1.0 מ"ל של קסילאזין (20 מ"ג/מ"ל), ולהוסיף 7.0 מ"ל של PBS סטרילי. מכינים קוקטייל קטמין/קסילאזין יום לפני או ביום הניתוח. הערה: יש להשתמש בכל הפתרונות בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין אחרת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הרדמה
<ol><li>שקלו את העכבר (עכברי C57BL/6 wildtype בני 8-12 שבועות) כדי לקבוע את הכמות המתאימה של חומר הרדמה למתן. השתמש בטכניקת ריסון העכבר בשתי ידיים כדי לרסן ולטפל בעכברים להזרקת ההרדמה18. יש לתת קטמין/קוקטייל קסילאזין תוך-צפקינלי (i.p.) בריכוז סופי של 80 מ"ג/ק"ג של קטמין ו-8 מ"ג/ק"ג קסילאזין.</li>
	<li>יש להמתין עד שתושג הרדמה מלאה לפני ביצוע פציעת קרנית בעכבר. להעריך את עומק ההרדמה על ידי הערכת רפלקס הדוושה לאחר צביטה בבוהן. כאשר הרדמה נאותה מושגת, העכבר לא צריך לזוז על צביטה הבוהן. הערה: מכיוון שעכברים מאבדים במהירות את חום הגוף במהלך ההרדמה, חשוב לספק מקור חום לעכברים כדי למנוע היפותרמיה. הניחו את העכברים על מקור חום (כרית חימום) בשלבי ההרדמה וההחלמה.</li>
</ol>3. יצירת פצע הקרנית
<ol><li>פצעו את עין ימין או שמאל בלבד. שמרו על עקביות עם העין (כלומר, שמאלה או ימינה) שנפצעת בעת מעבר מעכבר לעכבר. הערה: מכיוון ששפשופים פוגעים בעצבי הקרנית ומפחיתים את החדות, פציעה בשתי העיניים עלולה לגרום לאי נוחות ופגיעה משמעותית. מאחר שלמשככי כאבים יש פוטנציאל לדכא תגובות דלקתיות, השימוש בהם עשוי להיות מבלבל בניסויים מסוימים שמטרתם להבין את דלקת הקרנית. הימנעות ממשככי כאבים בניסויים בפצעי קרנית אושרה על ידי הוועדה המוסדית שלנו לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).</li>
	<li>כדי ליצור את פצע הקרנית אפיתל<ol>
<li>תחת מיקרוסקופ ניתוח, השתמשו בטרפין בקוטר 2 מ"מ (ראו איור 1) כדי לתחם את מרכז הקרנית, והשאירו את העין פתוחה לרווחה באמצעות האגודל והאצבע המורה כדי להחזיק את העפעפיים. סובבו בעדינות את הטרפין כדי לעשות רושם על אפיתל הקרנית. הערה: יש להקפיד שלא להפעיל לחץ מוגזם בעת שימוש בטרפין מכיוון שהדבר עלול לגרום לניקוב הקרנית. כמו כן, יש להקפיד למקם את הטרפין במרכז. האישונים יכולים לשמש כנקודת ציון לאיתור מרכז הקרנית.</li>
		<li>תחת מיקרוסקופ מנתח, החזיקו את ה-spud של מועדון הגולף הקהה (ראו איור 1) במרחק של כ-45° מפני השטח של הקרנית בתוך האזור התוחם עם הטרפין. בזהירות וברציפות לגרד את האפיתל בתוך האזור התוחם עם spud כדי debride את האפיתל. הערה: אין להפעיל כוח מופרז ב- debridement מכיוון שזה יכול גם לגרום לניקוב הקרנית. עיניהם של עכברים יכולות להתייבש במהלך תהליך הפציעה, מה שמקשה על ההדברה. במקרה כזה, להחיל PBS סטרילי על משטח העין כדי לשמור על הידרציה אופטימלית.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig01.jpg"> איור 1: טרפין 2 מ"מ וספוד מועדון גולף קהה. הטרפין משמש לתיחום אזור מעגלי במרכז הקרנית, ומועדון הגולף spud משמש להסרת האפיתל בתוך האזור התוחם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63112/63112fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
4. מעקב אחר סגירת הפצע ואפיתליזציה מחדש
<ol><li>פיפטה 1-1.5 μL של תמיסת פלואורסציין של 1% על פני השטח הפצועים וקרנית תמונה באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי עם מקור אור כחול.</li>
	<li>רכשו תמונות בדקה הראשונה של תוספת תמיסת הפלואורסצין כדי למנוע התפשטות לאפיתל שמסביב, מה שמוביל להערכת יתר של גודל הפצע. קרניות פצועות מצולמות בזמנים ספציפיים (כלומר, 0 שעות, 12 שעות, 18 שעות, 24 שעות ו-30 שעות) לאחר הפציעה. הערה: בכל נקודות הזמן, ההדמיה מתבצעת בהרדמה; קטמין/קסילאזין משמש בזמן הפציעה בעוד איזופלורן משמש בנקודות הזמן הבאות. עכברים שוכנים בנפרד בכלובים נפרדים למשך כל הזמן של ניטור סגירת הפצע. כאשר הם שוכנים יחד, עכברים נוטים ללקק את עיניו של חבר המלטה, התנהגות שהוכחה כמשפיעה על ריפוי פצעים ברקמות שונות19,20.</li>
	<li>נתח תמונות שצולמו, תוך התחקות אחר אזור הפצע באמצעות תוכנת ניתוח תמונות. אזור הפצע עבור כל נקודת זמן מתבטא כאחוז מאזור הפצע המקורי בשעה 0.</li>
</ol>5. הדמיה וניתוח אימונופלואורסצנטיות
<ol><li>המתת חסד עכברים בשיטה שאושרה על ידי IACUC (במקרה זה, מנת יתר של פחמן דו חמצני ואחריה נקע צוואר הרחם) בנקודות הזמן הרצויות לאחר הפציעה.</li>
	<li>קציר את גלגלי העיניים על ידי לחיצה עדינה על הקנטוס הצדדי כדי לעקור את גלגל העין באמצעות מספריים מעוקלים בקשתית. הנחה את המספריים מאחורי גלגל העין לתפוס בחוזקה את עצב הראייה, ולאחר מכן לחתוך את העצב, המאפשר להסיר את גלגל העין.</li>
	<li>קבעו כל גלגל עיניים ב-1 מ"ל של 1x PBS המכיל 2% פרפורמלדהיד למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטפו שלוש פעמים ב-1 מ"ל של 1x PBS למשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ ניתוח, השתמש בלהב כירורגי כדי לבצע חתך בסקלרה, כ-500 מיקרומטר דיסטלי ללימבוס, ולאחר מכן חתך את כדור הארץ. באמצעות מלקחיים, הסר בעדינות את חומר הקשתית מהקרנית, ולאחר מכן חתך בזהירות את הרקמה הסקלרלית, תוך הקפדה להשאיר את הלימבוס שלם.</li>
	<li>בצע ארבעה חתכים רדיאליים חלקיים, כל אחד באורך של כ-1 מ"מ, המשתרעים מהקרנית ההיקפית ועוצרים קצר מהמרכז כדי לאפשר לקרנית להשתטח.</li>
	<li>מחלחלים וחוסמים קרניות ב-1 מ"ל של 2% אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-0.01% TritonX -100 ב-1x PBS למשך 15 דקות ולאחר מכן חוסמים 2% BSA ב-1x PBS למשך 45 דקות נוספות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה של קרניות למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בקוקטייל של נוגדנים מצומדים פלואורוכרום ייחודיים המסומנים ישירות, המוכנים ב-1x PBS המכילים 2% BSA. הערה: נוגדנים ממוקדים לסימון תאים ורקמות ספציפיים בעלי עניין. לדוגמה, אנדותל, נויטרופילים וטסיות דם מסומנים בנוגדנים נגד CD3121,22, אנטי-Ly-6G23,24 ונוגדנים נגד CD4125,26, בהתאמה. 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) מתווסף לקוקטייל הנוגדנים כדי להמחיש גרעינים.</li>
	<li>לאחר הדגירה, יש לשטוף קרניות שלוש פעמים ב-1x PBS למשך 15 דקות כל אחת.</li>
	<li>הר קרניות על שקופית מיקרוסקופ בטיפה של תווך הרכבה פלואורסצנטית נגד דהייה, כיסוי עם כיסוי, ותמונה עם ההגדלה הרצויה (4x עד 100x מטרה) באמצעות מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי. צלם תמונות בעובי מלא של הקרנית באזורים שונים, כפי שמודגם באיור 2A. הערה: תבנית הניתוח המיקרוסקופי המתוארת באיור 2A משמשת לניתוח שינויים אזוריים ספציפיים בדלקת ובחלוקת תאים. גם צביעת DAPI וגם Ly-6G משמשים לזיהוי הנויטרופילים האקסטרווסקולריים. עם צביעת DAPI, לנויטרופילים כדוריים יש גרעין ייחודי בצורת פרסה או סופגנייה (איור 2B).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig02.jpg"> איור 2: אסטרטגיית הדמיית הקרנית וחדירת נויטרופילים לאחר שחיקה מרכזית. (A) ייצוג סכמטי של הקרנית כולה המציג תשעה שדות מיקרוסקופיים בקוטר הקרנית. השטח האפור מייצג את אזור הפצע המקורי. הרוחב של כל אזור הוא 500 מיקרומטר. (B) שימו לב לצורת הפרסה או הסופגנייה המובהקת של גרעיני נויטרופילים עם צביעת DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63112/63112fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

למחברים אין מה לחשוף.

מטרת מאמר השיטות הזה הייתה לתאר פרוטוקול ליצירת פצע שחיקה מרכזי באפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד של מועדון גולף קהה. מודל מורין זה שימש לחקר דלקת הקרנית ותרומתה לריפוי פצעים. סוג זה של מודל יכול לשמש לחקר מנגנוני ריפוי פצעי הקרנית בתנאים פיזיולוגיים רגילים ובפתולוגיות 17,28,29,41,42. המודל שימש לחקר ריפוי פצעי הקרנית בתנאים פתולוגיים כפי שמעיד מחקר על ר...

הקרנית היא החלק הקדמי השקוף של שליש מהעין. הקרנית משרתת מספר פונקציות כולל הגנה על המבנים הפנימיים של העין ויצירת מחסום מבני המגן על העין מפני זיהומים1. חשוב מכך, הקרנית חיונית לראייה, ומספקת כשני שלישים מכוח השבירה של העין 2,3. חיוני לתפקיד הקרנית בראייה הוא השקיפות שלה. עם זאת, בשל מיקומה החיצוני, הקרנית חשופה למגוון רחב של פציעות על בסיס יומיומי שעלולות להוביל לשיבוש בתפקוד המחסום שלה, לאובדן שקיפות ולעיוורון בסופו של דבר. אובדן שקיפות הקרנית הוא גורם מוביל ללקוי ראייה ברחבי העולם 4,5. שחיקות קרנית הן סיבה נפוצה לביקורים בחדר המיון (ER), המהווים מחצית מהמקרים הקשורים לעין המוצגים במיון6. על פי הערכות, יותר ממיליון בני אדם סובלים מפציעות הקשורות לעיניים מדי שנה בארצות הברית7. ריפוי יעיל של פצעי הקרנית בתגובה לפציעות אלה הוא חיוני לשמירה על הומאוסטזיס של הקרנית ולשימור השקיפות ויכולות השבירה שלו. באירועים של פגיעה בריפוי פצעי הקרנית, הקרנית הופכת פגיעה לזיהומים, כיבים וצלקותשל 8,9. כמו כן, הפופולריות הגוברת של ניתוחי שבירה מציבה אתגר טראומטי ייחודי על הקרנית10. בהתחשב בחשיבות הבסיסית של ריפוי פצעי הקרנית לשמירה על שקיפות וראייה של הקרנית, הבנה טובה יותר של תהליך הריפוי הרגיל של פצע הקרנית היא תנאי מוקדם להבנת ריפוי לקוי של פצעי הקרנית הקשורים לזיהומים ולמחלות.
לשם כך פותחו מספר מודלים של בעלי חיים של ריפוי פצעי הקרנית 11,12,13,14,15. מודלים של מורין של ריפוי פצעי הקרנית הוכיחו את עצמם כיעילים בקידום הבנתנו את מנגנוני ריפוי פצעי הקרנית הפועלים בתנאים פיזיולוגיים רגילים. סוגים שונים של פצעי הקרנית שימשו בחקר ריפוי פצעי הקרנית, שכל אחד מהם מתאים לחקר היבטים שונים של תהליך ריפוי הפצע. הסוגים הנפוצים ביותר של מודלים של פצעים המשמשים במחקרי ריפוי פצעים בקרנית הם המודלים המכניים והכימיים של פצעים. פצעי קרנית כימיים, הכוללים בעיקר יצירת כוויות אלקליין על הקרנית, שימושיים לחקר כיבים בקרנית, אטימות וניאו-וסקולריזציה13. פצעי קרנית מכניים כוללים פצעי חיטוי (שחיקה) ופצעי כריתת קרטום 14,15,16. קרום מרתף אפיתל שלם או פרוץ של הקרנית מגדיר פצעי כריתה וקרתית דם, בהתאמה. בפצעי חיטוי, קרום מרתף האפיתל נשאר שלם, בעוד שבפצעי כריתת קרטום, קרום המרתף נפרץ עם חדירה בעיקר לתוך הסטרומה הקדמית. פצעי חיטוי הם השימושיים ביותר לחקר אפיתליאליזציה מחדש, התפשטות תאי אפיתל, תגובה חיסונית והתחדשות עצבים בעקבות פציעת הקרנית. פצעי כריתת קרטקומיה, לעומת זאת, שימושיים ביותר לחקר הצטלקות הקרנית14,15.
כאן מתואר פרוטוקול ליצירת פצע שחיקה מרכזי באפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד של מועדון גולף קהה. מודל ריפוי פצעי הקרנית הפשוט הזה ניתן לשחזור רב ופורסם היטב, וכעת הוא משמש להערכת ריפוי פצעי הקרנית שנפגעו בהקשר של מחלה17.

<table><tbody><tr><td>נוגדן נגד CD31</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד CD41 BD</td><td>Bioscience, Pharmingen</td><td>553847</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Ly6G</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>551459</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)ThermoFisher</td> <td>מדעי</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 עכברים</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision מיקרוסקופ פלואורסצנטי דה-קונבולוציה בשדה רחב</td><td>GE מדעי</td><td></td><td></td>החיים</tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח מיקרו-מערכות</td><td></td><td></td><td>Leica</td></tr><tr><td>מאזני טעינה אלקטרוניים (סולם שקילה)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>ThermoFisher T038181000CS מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחבט גולף סטפנס</td><td>מכשירים</td><td>S2-1135</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עקומת איריס</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>31212</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>פטרסון וטרינרי</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>קטמין</td><td>פטרסון וטרינרי</td><td>07-890-8598</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>ThermoFisher מדעי</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן פלואורסצאין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>46970</td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי (להב סקייפל)</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>10022-00</td><td></td></tr><tr><td>טרפין</td><td>אינטגרה Miltex</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>TritonX -100</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-295-34</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11923-13</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>פטרסון וטרינרי</td><td>07-808-1947</td><td></td></tr></tbody></table>

מודל שחיקה אפיתליאלית לחקר ריפוי פצעי הקרנית

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

הקרנית קריטית לראייה, ומהווה כשני שלישים מכוח השבירה של העין. חיוני לתפקיד הקרנית בראייה הוא השקיפות שלה. עם זאת, בשל מיקומה החיצוני, הקרנית רגישה מאוד למגוון רחב של פציעות שעלולות להוביל לאובדן שקיפות הקרנית ועיוורון בסופו של דבר. ריפוי יעיל של פצעי הקרנית בתגובה לפציעות אלה הוא חיוני לשמירה על הומאוסטזיס של הקרנית ולשימור שקיפות הקרנית ויכולות השבירה. באירועים של פגיעה בריפוי פצעי הקרנית, הקרנית הופכת פגיעה לזיהומים, כיבים והצטלקות. בהתחשב בחשיבות הבסיסית של ריפוי פצעי הקרנית לשמירה על שקיפות וראייה של הקרנית, הבנה טובה יותר של תהליך הריפוי הרגיל של פצע הקרנית היא תנאי מוקדם להבנת ריפוי לקוי של פצעי הקרנית הקשורים לזיהומים ולמחלות. לקראת מטרה זו, מודלים של מורין של פציעת קרנית הוכיחו את עצמם כיעילים לקידום הבנתנו את מנגנוני ריפוי פצעי הקרנית הפועלים בתנאים פיזיולוגיים רגילים. כאן מתואר פרוטוקול ליצירת שחיקה מרכזית של אפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד מועדון גולף קהה. במודל זה, טרפין עגול בקוטר 2 מ"מ, שמרכזו מעל הקרנית, משמש לתיחום אזור הפצע. מועדון הגולף spud משמש בזהירות כדי debride את האפיתל וליצור פצע עגול מבלי לפגוע בקרום מרתף אפיתל הקרנית. התגובה הדלקתית המתקבלת מתרחשת כמפל מאופיין היטב של אירועים תאיים ומולקולריים שהם קריטיים לריפוי פצעים יעיל. מודל פשוט זה של ריפוי פצעי הקרנית ניתן לשחזור רב ופורסם היטב, וכעת הוא משמש להערכת ריפוי פצעי קרנית שנפגעו בהקשר של מחלות.

איור 3 מראה מיקרוגרף אלקטרוני תמסורת של פצע בקרנית שנוצר עם ספוד מועדון הגולף הקהה, ומדגים כי קרום המרתף האפיתליאלי אכן שלם לאחר פציעה.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg"> איור 3: קרום מרתף אפיתל נשאר שלם לאחר שחיקת הקרנית. מיקרוגרף אלקטרונים של תמסורת של פצע קרנית שנוצר עם מועדון הגולף הבוטה spud. ראשי החצים מצביעים על קרום המרתף שמתחת...

כאן מתואר פרוטוקול ליצירת פצע שחיקה מרכזי באפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד של מועדון גולף קהה. מודל זה של ריפוי פצעי הקרנית ניתן לשחזור רב ומשמש כיום להערכת ריפוי פצעי בקרנית שנפגעו בהקשר של מחלות.

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

פרוטוקול זה משמעותי משום שהוא מודל מצוין לחקר דלקת הקרנית ותרומתה לריפוי פצעים בתנאים נורמליים ופתולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יוצרת פצע אפיתל מדויק וניתן לשחזור מבלי לפרוץ את קרום המרתף. מודל זה של פציעת הקרנית הוא פשוט ומהיר לביצוע.מי שידגים את ההליך יהיה הנסיך אקווה, דוקטורנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להכין תמיסת 1% פלואורסציין על ידי המסת 10 מיליגרם של מלח נתרן פלואורסציין במיליליטר אחד של מלח סטרילי או PBS. לאחר מכן, להרדמה, להכין 10 מיליליטרים של קוקטייל קטמין-קסילאזין על ידי ערבוב שני מיליליטרים של קטמין, מיליליטר אחד של קסילאזין, ושבעה מיליליטרים של PBS סטרילי.לאחר הרדמה של עכבר מסוג C57 שחור מסוג 6 פראי בן 8 עד 12 שבועות, הערך את עומק ההרדמה על ידי הערכת רפלקס הדוושה לאחר צביטה בבוהן. כדי ליצור את פצע הקרנית האפיתליאלי, מניחים את העכבר המרומם תחת מיקרוסקופ דיסקציה. פצעו את עין ימין או שמאל בלבד ושמרו על עקביות כשהעין נפצעת בעת מעבר מעכבר לעכבר.שמור על העין פתוחה לרווחה על ידי החזקת העפעפיים עם האגודל והאצבע המורה. לאחר מכן, באמצעות טרפין סטרילי בקוטר שני מילימטרים, תוחמים את מרכז הקרנית ומסובבים בעדינות את הטרפין כדי ליצור רושם על אפיתל הקרנית. אין להפעיל לחץ מוגזם, שכן זה יכול לגרום לניקוב הקרנית.לאחר מכן, כשהוא אוחז במועדון הגולף הסטרילי הבוטה בזווית של כ-45 מעלות מפני השטח של הקרנית, מפרק את האפיתל על ידי גירוד זהיר ומתמשך בתוך האזור המסומן באמצעות ה-spud. אין להפעיל כוח מופרז ולשמור על הידרציה באמצעות PBS סטרילי במידת הצורך. לניטור סגירת הפצע ואפיתליזציה מחדש, פיפטה 1 עד 1.5 מיקרוליטרים של תמיסת פלואורסציין של 1% על פני השטח הפצועים ומצלמת את הקרנית באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי עם מקור אור כחול.דמיינו את הקרנית הפצועה בזמנים מסוימים לאחר הפציעה. צלם תמונות בדקה הראשונה של תוספת תמיסת פלואורסצין כדי למנוע התפשטות של התמיסה לאפיתל שמסביב, מה שעלול להוביל להערכת יתר של גודל הפצע. לאחר מכן, באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, עקבו אחר אזור הפצע וביטאו את אזור הפצע בכל נקודת זמן כאחוז מאזור הפצע המקורי בשעות האפס.מיקרוגרף אלקטרונים של תמסורת של פצע הקרנית מדגים כי קרום מרתף האפיתל נשאר שלם גם לאחר הפציעה. בעכברים מסוג בר בני 8 עד 12 שבועות, סגירת הפצע הושלמה 24 שעות לאחר הפציעה. תגובה דלקתית לפציעה מאופיינת בהדמיית תאים בלימבוס.מוצג כאן כלי הדם הלימביים של קרנית לא מעוותת עם נויטרופילים חוץ-וסקולריים, ושל קרנית פצועה עם טסיות דם ראוותניות וניוטרופילים 30 שעות לאחר שחיקה. כדי לשחזר בהצלחה פרוטוקול זה, יש להשתמש באותו זן בכל טווח של עכבר, וליצור את גודל ועומק הפצע כמתואר.

an-epithelial-abrasion-model-for-studying-corneal-wound-healing

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מתואר כאן הקמת מודל ניתוח קטרקט מדומה ex vivo רלוונטי מבחינה קלינית שניתן להשתמש בו כדי לחקור מנגנונים של תגובת הפגיעה של רקמות אפיתל בתוך המיקרו-סביבה הטבעית שלהן.

הקמת קלינית רלוונטי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; דגם ניתוח קטרקט מוק לחקירת תיקון פצע אפיתל במייקרו-סביבה של ילידים

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי לגרום של שחיקה השטח עינית של העכבר, בצע את לאחר מכן תהליך ריפוי הפצע. הפרוטוקול מנצל burr עינית חלקית להסרת האפיתל פני השטח של העין בעכברים מרדימים.

אפיתל שחיקה הקרנית עם עינית Burr כמודל עבור קרנית ריפוי פצעים

פרוטוקול עבור אקסית vivo איברים הקרנית תרבות מודל שימושי עבור לימודי ריפוי הפצע מתואר. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות של סוכני כדי לקדם ריפוי משובי או רעילות התרופה סביבה מאורגנת multicellular תלת-ממד.

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

כאן, מודלים של בעלי חיים המבוססים על עכבר וארנב מפותחים עבור פגיעה מכנית וכימית של אפיתל הקרנית כדי לסנן טיפולים חדשים ואת המנגנון הבסיסי.

מודלים של בעלי חיים של Ex Vivo ו-In Vivo לפציעות מכניות וכימיות של אפיתל הקרנית

הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השלבים השונים הכרוכים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ניתן לנתח את הקרנית המתחדשת או המשוחזרת במלואה עבור פוטנציאל התחדשות באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה.

חקר התחדשות רקמות ללא צלקות בקרנית אפרוח פצועה עוברית

פרוטוקול זה מתמקד בפגיעה במשטח העין של דגי הזברה באמצעות שחיקה כדי להעריך את סגירת הפצעים הבאים ברמה התאית. גישה זו מנצלת בר עיני כדי להסיר חלקית את אפיתל הקרנית ומשתמשת במיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת כדי לעקוב אחר שינויים במורפולוגיה של התא במהלך סגירת הפצע.

ריפוי פצעים בקרנית דגי זברה: משחיקה לניתוח הדמיה לסגירת פצעים

כאן, אנו מציעים שלוש שיטות שונות לפגיעה בסיבי החישה המעצבבים את הקרנית. שיטות אלה מקלות על חקר התחדשות האקסון בעכברים. שלוש שיטות אלה, הניתנות להתאמה למודלים אחרים של בעלי חיים, אידיאליות לחקר הפיזיולוגיה וההתחדשות של עצבוב הקרנית.

שלוש אסטרטגיות לגרימת קראטיטיס נוירוטרופית והתחדשות עצבית בקרנית מורין

פיתחנו מודל חולדה של דלקת קרנית חמורה באמצעות גרידת אפיתל בקרנית בשילוב עם תפרים בקרנית. המחקר העריך דפוסי דלקת בקרנית, התפשטות אפיתל ושינויים בתאי גזע לימבליים בתנאים דלקתיים.

ביסוס מודל דלקת קרנית חמורה בחולדות המבוסס על גרידת אפיתל בקרנית בשילוב תפרי קרנית

פיתחנו שיטה פולשנית ליצור אוזן איסכמי ארנב מודל הפצע על ידי חלוקת עורק העצבים המרכזית ואת צרור neurovascular גולגולתי. מנהרה תת עורית ואז חותך את כל רקמות תת עורית. הליך זה גורם הפרעה העור מינימלי בטוח לשימוש בבעלי חיים חולי סוכרת.

טכניקה פשוטה לייצור דגם פצע איסכמי

מודל עכברי של ריפוי פצע עורי שניתן להשתמש כדי להעריך את התרכובות טיפוליות בהגדרות פיסיולוגיות וpathophysiological.

מודל עכברי של ריפוי פצע

למד כיצד ליצור מודל שחיקה אפיתליאלית בקרנית עכברים לחקר ריפוי פצעים ודלקת הקרנית. שיטה זו מייצרת פצעים מדויקים וברי-השבה מבלי לפגוע בממברנת הבסיס.

מודל שחיקה אפיתליאלית לחקר ריפוי פצעי הקרנית

גלה סרטונים נוספים