כרייה היוריסטית של גנוטיפים היררכיים וגושים של גנום עזר באוכלוסיות חיידקים
7 בדצמבר 2021
פלטפורמה חישובית אנליטית זו מספקת הדרכה מעשית למיקרוביולוגים, אקולוגים ואפידמיולוגים המתעניינים בגנומיקה של אוכלוסיית החיידקים. באופן ספציפי, העבודה שהוצגה כאן הדגימה כיצד לבצע: א) מיפוי מונחה פילוגניה של גנוטיפים היררכיים; 2) ניתוח מבוסס תדרים של גנוטיפים; 3) ניתוחי קרבה וקלונליות; 4) זיהוי של שושלת המבדילה בין לוקים לאביזר.
פרוטוקול אנליטי זה מאפשר מחקר של אוכלוסיות פתוגניות של חיידקים, בקנה מידה גדול. זה חשוב מאוד כי זה משפר את האופן שבו ניתן לבצע חקירות אקולוגיות ואפידמיולוגיות. אבל כדי שזה יקרה, מה שאנחנו צריכים זה כלי אוטומטי וניתן להרחבה, או פלטפורמה חישובית שמאפשרת לנתח אלפים רבים של רצפי גנום בבת אחת.
ProkEvo מתאים לנישה זו, והוא מאפשר ניתוח אוכלוסין חיידקי מעשי בקנה מידה גדול, תוך מיפוי תוכן פאן-גנומי, הסוקר גנוטיפים ותכונות ייחודיות על אותם גנוטיפים לצורך חקירה אקולוגית ואפידמיולוגית. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא השימוש בפלטפורמות חישוביות חזקות, אוטומטיות וניתנות להרחבה, כגון ProkEvo לביצוע כרייה היוריסטית של גנוטיפים היררכיים באוכלוסיות חיידקים. לפרוטוקול האנליטי המוצג כאן היום יש כמה השלכות מעשיות.
אחד מהם הוא להקל על האבחון במובן שיאפשר למפות ולעקוב אחר גנוטיפים חיידקיים בזמן אמת, באופן מדרגי, המאפשר להבחין ולהגדיר שושלות פתוגניות של פתוגנים כדי לעקוב ולמפות את הפתוגנים האלה במסגרות שונות. יישום נוסף הוא להגביר את המעקב השגרתי אחר מעבדות בריאות הציבור וסוכנויות רגולטוריות, אשר נעשה כדי להקל על מעקב אחר פתוגנים במסגרות מסחריות שונות. הפרוטוקול המוצג כאן מספק הדרכה מעשית למיקרוביולוגים, אקולוגים, אפידמיולוגים וכל מי שמתעניין בגנומיקה של אוכלוסיית חיידקים.
ProkEvo היא פלטפורמת קוד פתוח וזמינה לציבור, ודף GitHub שלה מספק הוראות שימוש מפורטות. את הפרוטוקול המוסבר כאן ניתן למצוא גם ב-GitHub. עם ההוראות שסופקו, אנו רוצים להפוך את ProkEvo ואת הפרוטוקול הזה לקלים לשימוש ולהיות מנוצלים על ידי חוקרים מתחילים ומתקדמים.
התחילו לערוך את הניתוחים באמצעות עץ ג'יג'י כדי לשרטט עץ פילוגנטי יחד עם מידע גנוטיפי. לשם כך, מטב את גודל הדמות של עץ ה-Gigi, כולל הקוטר והרוחב של הטבעות על-ידי שינוי הערכים המספריים בתוך מפת החום x-lim ו-G. בעת התוויית שכבות מרובות של נתונים עם העץ הפילוגנטי, צבר את כל המטה-נתונים למספר הנמוך ביותר האפשרי של קטגוריות כדי להקל על בחירת לוח הצביעה.
נהל את צבירת הנתונים על סמך שאלת העניין והידע בתחום. לאחר שתסיים, השתמש בעלילת סרגל כדי להעריך את התדרים היחסיים על ידי צבירת נתונים עבור סוג הרצף או שושלות ST, והקלדת רצף רב-לוקוס של גנום הליבה או וריאנטים של cgMLST כדי להקל על הדמיות. בחר סף אמפירי או סטטיסטי המשמש לצבירת נתונים.
ניתן להשתמש בקוד לדוגמה כדי לבדוק את התפלגות התדרים של שושלות ST ולקבוע את הניתוק. הקוד לדוגמה מראה כיצד מצטברים STs משניים או בתדר נמוך. ניתן לקבץ את ה- STs שאינם ממוספרים כ- STs אחרים.
השתמש בקוד דומה עבור גרסאות cgMLST. השתמש בגישה המקוננת כדי לחשב את היחסיות של כל שושלת ST בתוך כל תת-קבוצה של BAPS1 כדי לזהות את ה- STs השייכים לאותה תת-חבורה BAPS1. הקוד מדגים כיצד ניתן לחשב את הפרופורציה מבוססת ST על פני תת-הקבוצות BAPS1.
כדי להתוות את ההתפלגות של עמידות מיקרוביאלית או מוקדי AMR על פני שושלות ST, השתמש בסף אמפירי או סטטיסטי כדי לסנן את מוקדי ה- AMR החשובים ביותר כדי להקל על הדמיות. ספק גלם. קובץ csv המכיל את הפרופורציות המחושבות של כל מוקדי AMR בכל שושלות ST.
לאחר מכן חשב את פרופורציית ה- AMR עבור כל ST באמצעות הקוד. לאחר ביצוע החישובים עבור כל ה- STs, שלב את ערכות הנתונים כמסגרת נתונים אחת באמצעות הקוד ולאחר מכן ייצא את קובץ ה- csv המכיל את הפרופורציות המחושבות עם הקוד. לפני שמתווים את ההתפלגות מבוססת AMR על פני שושלות ST, סנן את הנתונים על סמך סף כדי להקל על תצוגות חזותיות.
לאחר מכן, שרטט את הפילוגנזה של הגנום המרכזי יחד עם הסיווגים הגנוטיפיים ההיררכיים בנתוני AMR בחלקה אחת באמצעות עץ Gigi. לאחר מכן מטב את גודל הדמות בתוך עץ Gigi באמצעות הפרמטרים שהוזכרו קודם לכן. מטב את ההדמיות על ידי צבירת המשתנים או שימוש בסיווג בינארי, כגון נוכחות הגנים או היעדרם.
נבחן מבנה האוכלוסייה ההיררכי של שושלת סלמונלה אנטריקה בהקשר של פילוגנזה של גנום ליבה. התדרים היחסיים של כל הגנוטיפים ההיררכיים שימשו אז להערכת ההתפלגות הכוללת והסיווגים הנצפים ביותר. שושלות ST פחות שכיחות נצברו כ-STs אחרים כדי להקל על הדמיית נתונים.
באופן דומה, גרסאות cgMLST פחות שכיחות נצברו כמו cgMLSTs אחרים. היחסים הקדומים בין ה-STs נבחנו באמצעות גישה מקוננת על ידי הערכת התדירות היחסית של שושלות ST על ידי תת-הקבוצות BAPS1 או ההפלוטיפים. התדירות היחסית של שושלת ST המבדילה בין מוקדי AMR הוערכה כדי לזהות חתימות גנומיות ייחודיות הקשורות למבנה האוכלוסייה של סרובר ניופורט.
בתוצאות, נראה כי לוקי MDFA ו-AAC6IAA נרכשו באופן קדום על ידי אוכלוסיית סרובר ניופורט, בעוד ש-ST45 צפוי להיות עמיד לתרופות מרובות. בהשוואה ל-ST45, שושלות ST הגדולות האחרות, כגון ST5 ו-ST118, נוטות יותר להיות רגישות לתרופות מרובות. בנוסף, נעשה שימוש בהדמיה מעוגנת פילוגנית כדי לשלב את נתוני מבנה האוכלוסייה ההיררכיים באופן שיטתי.
פרוטוקול אנליטי זה מציג בסיס לכריית נתונים של אוכלוסיות חיידקים בקנה מידה גדול. מה שהיא מאפשרת הוא למפות ולעקוב אחר גנוטיפים בקנה מידה גדול באמצעות ProkEvo, אך ניתן להרחיב אותה גם כדי לענות על שאלות אחרות, כגון חקירת התפלגות המסלולים המטבוליים וגורמי האלימות הקשורים למידע גנוטיפי. כלומר, אנו יכולים לחזות את הפנוטיפים הקשורים לגנוטיפים ספציפיים של עניין.
הפרוטוקול המתואר כאן בהחלט סולל את הדרך לחוקרים לחקור שאלות חדשות בתחום הגנומיקה של האוכלוסייה ולהסיק דפוסים אבולוציוניים ואקולוגיים עבור מיני חיידקים פתוגניים כמו גם לא פתוגניים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מעשי וניתן להרחבה לניתוח גנומי של אוכלוסיות חיידקים באמצעות הפלטפורמה החישובית ProkEvo. על ידי ניצול נתוני ריצוף גנומי מלא (WGS) ומיפוי גנוטי היררכי, הפרוטוקול מאפשר לחוקרים לנתח אלפי גנומים של חיידקים, ובכך להקל על מחקרים אקולוגיים ואפידמיולוגיים. הגישה מודגמת באמצעות Salmonella Newport, תוך שילוב נתונים פילוגנטיים, גנוטיים ונתונים גנומיים נלווים כדי לחשוף את מבנה האוכלוסייה ודפוסי עמידות לאנטיביוטיקה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- גנומיקה של אוכלוסיות חיידקים
- ביולוגיה חישובית
- אפידמיולוגיה מיקרוביאלית
רקע
- ביצוע שגרתי של WGS משנה את החקירות האפידמיולוגיות בתחום בריאות הציבור.
- ניתוח רחב היקף של אוכלוסיות חיידקים דורש כלים חישוביים אוטומטיים וניתנים להרחבה (scalable).
- ProkEvo היא פלטפורמה בקוד פתוח שתוכננה לניתוח גנומי היררכי של אוכלוסיות.
- שילוב של מיפוי גנוטי עם כרייה של הגנום העזר (accessory genome) משפר את ההסקה האקולוגית.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול הניתן לשחזור ולהרחבה לניתוח גנומי של אוכלוסיות חיידקים באמצעות ProkEvo.
- להדריך חוקרים במיפוי גנוטיפים היררכיים ולוכסי עזר (accessory loci) לצורך השגת תובנות אקולוגיות ואפידמיולוגיות.
- להדגים יישומים מעשיים תוך שימוש במערך נתונים גדול של גנומים של Salmonella Newport.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח אוטומטי של נתוני WGS באמצעות ProkEvo.
- מיפוי מונחה פילוגניה של גנוטיפים היררכיים (Serovar ← BAPS1 ← ST ← cgMLST).
- ויזואליזציה של עצי פילוגניה עם נתונים גנוטיפיים ונתוני גנום נלווה באמצעות Gigi tree ב-R.
- אגרגציה וניתוח שכיחות של סוגי רצפים (STs) ווריאנטים של core genome MLST.
- הערכת התפלגות לוקוסים של עמידות לאנטיביוטיקה (AMR) בין שושלות שונות.
תוצאות עיקריות
- מיפוי גנוטי היררכי חשף את מבנה האוכלוסייה של Salmonella Newport.
- שושלאות ST5 ו-ST118 חולקות אב קדמון מאוחר יותר בהשוואה ל-ST45 הקלונלית מאוד.
- ST45 נחזית כעמידה לריבוי תרופות, בעוד ש-ST5 ו-ST118 סבירות יותר להיות רגישות לריבוי תרופות.
- ויזואליזציות מעוגנות פילוגנית שילבו נתונים גנוטיים ונתוני AMR, תוך הדגשת חתימות גנומיות ספציפיות לשושלות.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר ניתוחים גנומיים של אוכלוסיות חיידקים הניתנים להרחבה ולשחזור.
- שילוב של מיפוי גנוטי היררכי עם ניתוח הגנום העזר (accessory genome) מספק תובנות אקולוגיות ואפידמיולוגיות.
- גישה זו תומכת במעקב ובניטור בזמן אמת של שושלות פתוגניות במסגרות של בריאות הציבור ורגולציה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר ניתוח אוטומטי וניתן להרחבה של גנומיקה של אוכלוסיות חיידקים באמצעות נתוני ריצוף גנום מלא, התומך במעקב אפידמיולוגי ובהסקנה אקולוגית במסגרות של בריאות הציבור ורגולציה. באמצעות שילוב של מיפוי גנוטי היררכי עם כרייה של הגנום העזר, הוא מספק מסגרת להפחתת סיכונים באימות מטרות במחקרי עמידות לאנטיביוטיקה וגורמי virulent. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בחתימות גנומיות ספציפיות לשושלות, ומסייעת בקבלת החלטות של go/no-go בקווי גילוי מוקדמים להתערבויות אנטי-בקטריאליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי מיפוי גנוטיפים היררכיים (Serovar ← BAPS1 ← ST ← cgMLST) כדי להבהיר את מבנה האוכלוסייה ולזהות גנוטיפים מבדלים מרכזיים, כגון סוגי רצפים (sequence types).
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הערכת התפלגויות שכיחות של גנוטיפים כסמן לכשירות אקולוגית, דבר המסייע בתעדוף מטרות בעלות קשרי שושלה יציבים.
- ערך מדעי: קובע מערכות יחסי קרבה ומגוון גנטי באמצעות סיווגים גנוטיפיים, ובכך מפחית עמימות מכניסטית בבחירת מטרות לאסטרטגיות אנטי-מיקרוביאליות או אנטי-וירולנטיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לתהליכי עבודה המשכיים על ידי מיפוי לונוס של לוקוסים נלווים ספציפיים לשושלה, כולל סמני עמידות לאנטיביוטיקה (AMR), כדי לאפשר סריקת תרכובות מהימנה כנגד רקעים גנטיים מוגדרים.
- ערך תפעולי: טיפול בסטנדרטיזציה ושחזור של בדיקות באמצעות ויזואליזציה מבוססת פילוגניה של גנוטיפים היררכיים ותוכן AMR, מה שמקל על קבלת תוצאות עקביות בין מעבדות שונות.
- ערך תפעולי: הדגשת המוכנות לסריקה והיכולת להרחבה (scalability) על ידי הדגמה של עיבוד אוטומטי של 2,365 בידודים של Salmonella Newport, התומך בפרופיל גנוטיבי בעלת תפוקה גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה על ידי קישור לוקסי AMR נלווים (למשל, MDFA ו-AAC6IAA) לחתימות גנומיות ספציפיות לשושלת בפתוגנים זואנוטיים, ובכך תומך בהלימה של ביומרקרים תרגומיים.
- ערך מדעי: מתאר רצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות שימוש בהבדלים מבוססי ST למעקב אחר רכישה אבקית של לוקסי עמידות, דבר המסייע בקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון.
- ערך מדעי: מתמקד בהפחתת סיכונים חזויה על ידי זיהוי לוקסי נלווים המבדילים בין שושלות ומתאמים לתכונות פנוטיפיות, כגון רגישות או עמידות למספר תרופות, ובכך מאפשר חיזוי פנוטיפ מהגנוטיפ.
שילוב בצינור העיבוד ובזרימת העבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, משלב הגילוי המוקדם ועד לזיהוי מובילים (Lead Identification) ועבודה פרה-קלינית, על ידי אספקת מיפוי גנוטי בר-הרחבה וניתוח של הגנום העזר (accessory genome), התומכים בבחינת השערות, הבהרת מסלולים וצמצום סיכונים ביולוגיים.
- ביולוגיה של גילוי: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת היפותזות, הבהרת מסלולים או הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מיפוי מונחה-פילוגנטי של גנוטיפים היררכיים וניתוח מבוסס-שכיחות של שושלות ST.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה, השחזוריות או התפוקות הכמותיות כאשר המאמר תומך בכך, כגון ההתפלגות הפרופורציונלית של לוקוסי AMR על פני שושלות ST עבור פאנלים סטנדרטיים של סריקה.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות, תוצאות או פלטים סטטיסטיים המסייעים לצוותים להשוות בין תנאים, כולל חישובים של שכיחות יחסית של שושלות ST בתוך תתי-קבוצות BAPS1 ופרופורציות של לוקוסי AMR.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרצף פרה-קליני או להתאמת ביומרקרים רק כאשר המקור תומך בכך, כגון מיפוי תוכן AMR ספציפי לשושלות כדי להסיק דפוסים אבולוציוניים ואקולוגיים באוכלוסיות פתוגניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כיכולת ניתנת לשימוש חוזר ולא כטכניקה לשימוש חד-פעמי, תוך הדגשת האוטומציה, הסקילביליות והזמינות כקוד פתוח באמצעות ProkEvo ליישום חוזר על פני מיני חיידקים ומחקרים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי, תיקוף מטרה, הפחתת עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטותיעילה יותר לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף והחלטות קידום מותאמות לסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מדעית בגנומיקה מיקרוביאלית, פילוגנטיקה ותכנות ב-R לצורך ניתוח גנומי היררכי של אוכלוסיות.
- הצורך במכשור ובתשתית אנליטית כולל גישה לנתוני ריצוף גנום מלא, משאבים חישוביים לעיבוד בקנה מידה רחב, וכלים כגון Gigi tree לוויזואליזציה פילוגנטית.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים כוללות איגור של מטא-דאטה לקטגוריות מינימליות לצורך פאנלים עקביים של צבעים, והחלת ספים אמפיריים או סטטיסטיים לסינון נתונים ולוויזואליזציה.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודל כוללים שינוי של היררכיות גנוטיפיות (למשל, Serovar ← BAPS1 ← ST ← cgMLST) וספי סינון של לוקוסי עזר בהתאם לפתוגן ולשאלת המחקר.
- מגבלות מעשיות הנתמכות על ידי חומר המקור כוללות את הצורך לאגד STs בתדירות נמוכה או וריאנטים של cgMLST תחת הקטגוריה 'other' כדי להקל על הוויזואליזציה, והתלות בידע מקצועי בתחום לצורך איגור נתונים ובחירת ספים.
