ניתוח ציטומטרי של זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם ונגזרותיהם העצביות והגליליות
November 8th, 2021
מחקר זה מדווח על גישה חדשנית למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים המבוססים על ציטומטריה של זרימה והכתמה כפולה עם שני מדווחים פלואורסצנטיים או נוגדנים כדי לזהות שינויים בנפח המיטוכונדריה, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה, רמת מיני חמצן תגובתי, הרכב שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ודנ"א מיטוכונדריאלי.
הפרוטוקול שלנו מספק למדען כלי רב עוצמה לשילוב מספר פרמטרים זעירים ברמת התא הבודד מה-IPS האנושי ונגזרותיו העצביות והברורות. פרוטוקולים אלה מאפשרים שילוב של פרמטרים מיטוכונדריאליים, הן ברמה הכוללת והן ברמה הספציפית לכל נפח מיטוכונדריאלי, באמצעות ציטומטריה של זרימה. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מספר סוגי תאים כולל אלה ממחלות נוירודגנרטיביות אחרות.
לכן, הוא יכול בכך לעזור לספק תובנה לגבי המנגנונים שמאחורי סוגי מחלות אלה וגם עשוי לסייע בסינון טיפולי. כדי להתחיל, זרעו את התאים בנפרד לארבע בארות בצלחת של שש בארות ודגרו על התאים עד להשגת 50 עד 60% מפגש. בסוף תקופת התרבית, הכינו חמש תמיסות צביעה אישיות המכילות שילובים שונים של מדיום תרבית, FCCP, TMRE, MTG וממרח גרב מיטו.
הוסיפו אותם לבארות המתאימות, ודגרו את התאים כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, לשאוף את המדיום מכל הבארות לשטוף עם PBS. עבור ניתוק תאים, דגירה של התאים עם מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
נטרל את מגיב הדיסוציאציה של התא עם מיליליטר אחד של DMEM, בתוספת 10% FBS. לאחר מכן אסוף את תוכן הבאר בצינור כרוניקה של 15 מיליליטר. גלולה במורד התאים על ידי צנטרציה ושטפו את כדור התא עם PBS פעם או פעמיים.
לשאוף את כל supernatant, משאיר כ 100 microliters בצינור. להשעות מחדש את כדורי התא ב 300 מיקרוליטר של PBS. לאחר העברת השעיית התא לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר, לשמור את הצינור בחושך בטמפרטורת החדר.
נתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה עם הגדרות מסנן מעבר הפס המתוארות בכתב היד של הטקסט. יש לנתק כמיליון תאים באמצעות מגיב הדיסוציאציה של התא ולהוריד את התאים כפי שהוכח קודם לכן. נטרל את תרחיף התא עם DMEM בתוספת 10% FBS ואסוף את המתלה בצינור 15 מיליליטר.
לתקן את התאים עם מיליליטר אחד של 1.6% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. Permeabolize את התאים עם מיליליטר אחד של קרח קר 90% מתנול במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן לחסום את הדגימות במיליליטר אחד של חיץ חוסם, ולשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה עם PBS, כפי שהודגם.
כדי לזהות קומפלקסים ותת-יחידות מיטוכונדריאליות שונות, דגרו על התאים במשך 30 דקות עם הנוגדנים הראשוניים המתוארים בכתב היד של הטקסט. לאחר שטיפת התאים פעם אחת עם PBS, לדגור על התאים עם נוגדן משני במשך 30 דקות. בתום הדגירה, יש לשטוף ולהשעות מחדש את התאים וה-PBS כפי שהוכח.
מעבירים את מתלה התאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה בקוטר 1.5 מיליליטר, המוחזק בחושך על קרח. לאחר מכן, לנתח את התאים על ציטומטר זרימה ולזהות אותות ולסנן אחד באמצעות 5 30/30 פס לעבור מסנן. עבור כל תת-אוכלוסייה של תאים, בחר תרשים היסטוגרמה ונתח את עוצמת הפלואורסצנציה החציונית או MFI של ערוצי הסינון השונים.
חשב את רמות TMRE, ערכים ספציפיים עבור תת-יחידה מורכבת של MMP ROS ו- TFAM, כמתואר בכתב היד של הטקסט. ציטומטריה של זרימה ותאים חיים שימשו לחקר נפח מיטוכונדריאלי MMP ורמות ROS. בתאי עצב מסוג POLG DA נצפו MMP ספציפי נמוך יותר ו-ROS ספציפי גבוה יותר, בעוד שלא נצפו שינויים בנפח המיטוכונדריה, סך ה-MMP וה-ROS.
האסטרוציטים של POLG ירדו ב-MMP, אך לא חל שינוי בנפח המיטוכונדריה וב-ROS. ציטומטריה של זרימה ותאים קבועים שימשו כדי לחקור את הרמה של תת-יחידה מורכבת MRC ו- TFAM. תאי עצב של DA הראו עלייה ב-COMPLEX 1 וב-TFAM לעומת שליטה, אך לא חל שינוי בשתי רמות מורכבות.
אסטרוציטים של POLG הראו הפחתה של קומפלקס אחד ארבע ו- TFAM ספציפי. מכיוון שצפיפות התא יכולה להשפיע גם על MMP ועל הקשר בין MTG לפלואורסצנציה של MMP, זהו ספציפי לתא. התאמת פרוטוקול זה לסוגי תאים אחרים תדרוש ככל הנראה אופטימיזציה בעקבות הליך זה, ניתן לבצע אסיס מבוסס מיקרוסקופי, למשל מיקרוסקופיה קונפוקלית, המספקת פרטים נוספים על מבנים מיטוכונדריאליים.
לכן, בעוד שאסטרטגיה זו מזהה תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בתאי עצב DA ובאסטרוציטים ממחלה מיטוכונדריאלית ידועה, ניתן ליישם טכניקות אלה גם כדי לחקור את תפקוד המיטוכונדריה בכל סוג של תאים ומחלות.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מחקר זה מציג שיטה חדשנית מבוססת ציטומטריה של זרימה להערכת פרמטרים פונקציונליים של המיטוכונדריה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (iPS) המושרה והנגזרות הנוירוניות שלהם. היא מאפשרת זיהוי שינויים בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, ברמות החמצן הריאקטיבי, ובהרכב שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית, ותורמת להבנת תפקוד לקוי של המיטוכונדריה במחלות ניווניות.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביולוגיה תאית
- תפקוד מיטוכונדרי
רקע
- תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור למחלות ניווניות.
- מחקר זה חוקר פרמטרים מיטוכונדריאליים ברמת תא יחיד.
- המתודולוגיה שואפת לספק תובנות למנגנוני המחלה.
- הערכת בריאות המיטוכונדריה יכולה לסייע בבדיקה טיפולית.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאליים בתאים בודדים.
- להבין את התפקידים המיטוכונדריאליים בניוון נוירוני ובטיפולים פוטנציאליים.
- לשפר את זיהוי תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בסוגי תאים מגוונים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הפלטפורמה המשמשת היא ציטומטריה של זרימה.
- נתחו תאי iPS אנושיים ונגזרותיהם הנוירוניות.
- הליכי מפתח כללו תרבית תאים, צביעה כפולה עם מדווחים פלואורסצנטיים ספציפיים, וסימון נוגדנים לניתוח מיטוכונדרי.
- טיפולים בתאים כללו דיסוציאציה, קיבוע, והחלחלה, ואחריהם מדידת פלואורסצנציה.
- הוזכרו התאמות ספציפיות לסוג התא של הפרוטוקול.
תוצאות עיקריות
- הבדלים משמעותיים ברמת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP) וברמות החמצן הריאקטיבי (ROS) נצפו בנוירונים ובאסטרוציטים POLG.
- נרשמו רמות גבוהות של קומפלקס מיטוכונדריאלית ו-TFAM בנוירונים DA, מה שמדגיש התאמות מיטוכונדריאליות ייחודיות.
- התוצאות מצביעות על כך שמאפיינים תאיים ספציפיים משפיעים על מדידות תפקוד המיטוכונדריה.
- פוטנציאל ליישומים רחבים יותר לסוגי תאים שונים בחקר תפקודים מיטוכונדריאליים ומחלות קשורות.
מסקנות
- מחקר זה מדגים גישה חזקה להערכת תפקוד המיטוכונדריה במודלים של מחלות ניווניות.
- התוצאות מאפשרות חקר נוסף של תפקידי המיטוכונדריה בבריאות תאית ובמחלה.
- מתודולוגיה זו יכולה להוביל להבנה טובה יותר ואסטרטגיות טיפוליות עבור פתולוגיות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This flow cytometry method enables multiparametric mitochondrial profiling in human iPSC-derived neural and glial cells, supporting target validation in neurodegenerative disease models. By quantifying mitochondrial volume, membrane potential, ROS, and respiratory chain components at single-cell resolution, it provides mechanistic de-risking for therapeutic screening. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking mitochondrial phenotypes to disease-relevant cellular states.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring mitochondrial dysfunction in iPSC-derived neurons and astrocytes.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiparametric readouts of mitochondrial health.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that normalize mitochondrial parameters in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated iPSC-derived neural and glial systems for compound screening with mitochondrial endpoints.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs for mitochondrial volume, MMP, and ROS.
- Scalability: Supports high-content flow cytometry screening across multiple cell lines and treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling mitochondrial defects in POLG-associated neurons and astrocytes.
- Operational Value: Enables translational biomarker assessment via TFAM/TOMM20 ratios reflecting mtDNA copy number per mitochondrial volume.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by detecting mitochondrial complex subunit alterations linked to pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for neurodegenerative indications involving mitochondrial dysfunction.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking mitochondrial volume, MMP, and ROS to specific cellular phenotypes in iPSC derivatives.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized staining protocols and flow cytometric readouts of mitochondrial function.
- Analytics: Provides quantitative measurements of mitochondrial respiratory chain subunits and TFAM for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via disease-relevant iPSC models and mitochondrial biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable multiparametric mitochondrial profiling platform applicable across neurodegenerative disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in mitochondrial contributions to neurodegeneration.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined staining panels and flow cytometric gating strategies.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of mitochondrial liabilities in compound libraries.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that rescue mitochondrial complex deficits or ROS elevation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, mitochondrial biology, and iPSC differentiation protocols.
- Dependent on access to flow cytometers with appropriate fluorescence detection channels and compensation controls.
- Necessitates standardization of staining concentrations, incubation times, and gating strategies across laboratories.
- Requires optimization when adapting to non-neural cell types or different mitochondrial disease models.
- Limited by the need for live-cell handling for MMP/ROS measurements and fixed-cell protocols for protein detection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Flow Cytometry Measurement of Mitochondrial Volume, MMP, and Mitochondrial ROS in Live Cells
2:26
Flow Cytometry Measurement of MRC Complex Subunits and TFAM in Fixed Cells
3:49
Flow Cytometry Analysis
4:14
Results: Flow Cytometry Investigation of iPSC-Derived Neural Cells
5:07
Conclusion
