עמודי כרומטוגרפיה של זיקה לממברנת התא לזיהוי מטבוליטים מיוחדים של צמחים המקיימים אינטראקציה עם קולטן Tropomyosin Kinase משותק B

אנכי זה מציג שלבים חשובים בהרכבת עמודי כרומטוגרפיית זיקה של קרום התא עם קולטני טרנס-ממברנה פונקציונליים. עמודות אלה יכולות לשמש לזיהוי מולקולות קטנות הקיימות בתמציות מורכבות ולאינטראקציה עם קולטני טרנס-ממברנה משותקים. עמודי הכרומטוגרפיה של זיקת קרום התא מאיצים את הזיהוי של תרכובות פעילות ביולוגית הנמצאות בתערובות מורכבות.

השימוש בעמודות כרומטוגרפיה של זיקה לממברנה תאית יכול לעניין במיוחד את המתעניינים בזיהוי תרכובות פעילות פרמקולוגית הקיימות במטריצות טבעיות מורכבות, כגון תמציות צמחים, פטרייתיות או חיידקים. כדי להתחיל, להכין 200 תמיסת מלאי בנזאמידין millimolar על ידי המסת 120 של בנזמידין בחמישה מיליליטרים של מים אולטרה-פורה deionized. הכן תמיסת מניות PMSF של 10 מילימולר על ידי המסת 0.017 גרם PMSF ב -10 מיליליטר של אתנול במכסה אדים.

הכינו קוקטייל מעכבי פרוטאזות 100X על ידי המסת תערובת מעכבי פרוטאזות הזמינה מסחרית במיליליטר אחד של מים אולטרה-פורים שעברו דה-יוניזציה. מערבבים היטב ומכניסים 200 עד 300 מיקרוליטרים של הקוקטייל. הכן 100 תמיסת מלאי ATP מילימולרית על ידי המסת 55.114 מיליגרם של מלח דיסודיום ATP הידרט במיליליטר אחד של מי האולטרה-פורה המיוננים.

מערבבים היטב ומקפידים על 100 מיקרוליטרים של התערובת. הכן חיץ על ידי המסת 3.03 גרם של Tris-HCL, 2.9 גרם של נתרן כלורי, 0.22 גרם של סידן כלורי אנהידרוס, 0.2 גרם של מגנזיום כלוריד הקסהידראט, ו 0.19 גרם של אשלגן כלורי ב 500 מיליליטר של מים אולטרה-אפורים deionized. הכן מאגר הומוגניזציה על ידי ערבוב 17.3 מיליליטרים של מאגר Tris עם 0.3 מיליליטרים של תמיסת מלאי בנזמידין, 0.2 מיליליטרים של תמיסת מניות PMSF, 0.2 מיליליטרים של קוקטייל מעכבי פרוטאזות, 20 מיקרוליטרים של תמיסת מניות ATP, שני מיליליטרים של גליצרול ו-0.029 גרם של EDTA.

התאם את ה-pH ל-7.4 באמצעות תמיסת חומצה הידרוכלורית. סובבו את התאים שנקטפו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ב-400 x גרם, הסירו את הסופרנאטנט ושטפו את גלולת התא הנותרת ב-10 מיליליטרים של PH 7.4 PBS קר כקרח של 1X pH 7.4. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהוסיף 20 מיליליטרים של מאגר הומוגניזציה.

הניחו את הצינור החרוטי על הקרח. מעבירים את תרחיף התא למטחנת רקמות הומוגנייזר של Dounce 40 מיליליטר, הומוגניזציה של ההשעיה באופן ידני על קרח באמצעות 40 משיכות הדברה למעלה ולמטה. מעבירים את תרחיף התא ההומוגני לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, משליכים את הכדור ומעבירים את הסופרנטנט לצינור חרוטי חדש.

שמור את גלולת קרום התא והשלך את הסופרנאטנט. הכינו את מאגר הסולוביליזציה על ידי ערבוב של 8.7 מיליליטרים של תמיסת המאגר עם 0.1 מיליליטרים של תמיסת מלאי PMSF, 0.15 מיליליטרים של תמיסת מלאי בנזמידין, 0.1 מיליליטרים של קוקטייל מעכבי פרוטאזות, 10 מיקרוליטרים של תמיסת מניות ATP, מיליליטר אחד של גליצרול ו-0.2 גרם של נתרן כולאט. מעבירים את חיץ הסולוביליזציה לצינור החרוטי עם שברי קרום התא.

ותחזירו את הכדור. סובבו את התערובת המתקבלת ב-150 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. לאחר 18 שעות, צנטריפוגה תערובת solubilization בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ב 47, 900 x g.

הוסף 100 מיליגרם של IAM. מחשב אישי. חלקיקי DD2 לסופרנט ומסובבים את תערובת ההשעיה המתקבלת ב-150 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. הכינו מאגר דיאליזה בארבעה ליטרים של מים אולטרה-פוריים שעברו דה-יוניזציה על ידי הוספת 24 גרם של Tris-HCl, 23.4 גרם נתרן כלורי, 0.06 גרם סידן כלורי, 5.85 גרם EDTA ו-0.07 גרם PMSF.

ממיסים PMSF תחילה בנפח קטן של אתנול ולאחר מכן מוסיפים לאט לאט לתוך הכוס עם המאגר. חותכים 10 סנטימטרים של צינורות דיאליזה של קרום התאית כדי להכין צינור דיאליזה, ומעבירים את ההשעיה המכילה IAM. מחשב אישי. חלקיקי DD2 ושברי קרום התא לתוך צינור הדיאליזה.

סגור את שני הקצוות של שפופרת הדיאליזה עם קליפסים של צינורות דיאליזה. מקם את צינור הדיאליזה במאגר הדיאליזה. לאחר 24 שעות, הניחו את צינורות הדיאליזה במאגר הדיאליזה שזה עתה הוכן והמשיכו בדיאליזה עוד 24 שעות.

הכן 10 millimolar pH 7.4 אמוניום אצטט חיץ שישמש לשטוף את IAM. מחשב אישי. חלקיקי DD2 ובניסויי אפיון עמודה על ידי המסת 0.778 גרם אמוניום אצטט לליטר אחד של מים אולטרה-פוריים שעברו דה-יוניזציה. לאחר 48 שעות של דיאליזה, הסר את שפופרת הדיאליזה ממאגר הדיאליזה והעבר את תוכן צינור הדיאליזה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הכדור הנותר שלוש פעמים עם 10 מיליליטרים של חיץ אמוניום אצטט. לאחר הכביסה השלישית, יש להחיות את הכדור הנותר במיליליטר אחד של חיץ אמוניום אצטט. ערבבו אותו ביסודיות והשתמשו ב-slurry שנוצר כדי לארוז את עמוד הזכוכית בגודל 5 x 20 כדי להפיק את עמודת הכרומטוגרפיה CMAC.

כדי לארוז את העמודה, מקם מסנן תחתון שהושרה בעבר עם מאגר אמוניום אצטט למחזיק המסנן. התאם את מחזיק המסנן לעמוד הזכוכית והבריג את מכסה העמוד כדי להבטיח את מיקום המחזיק. מניחים את העמוד במאונך במהדק אצבעות ומהדקים אותו במעמד המעבדה.

מניחים מתחת לעמוד, מעבירים כרך קטן של הזכוכית לתוך עמוד הזכוכית באיטיות עם פייפר ערוץ יחיד שמחזיק את קצה הפיפטה על קיר עמוד הזכוכית. כדי להאיץ את תהליך האריזה, הסר את המאגר מעל המיטה הנייחת באמצעות מיקרופיפט בין כל שלב. הניחו מסנן עליון והברגו את יחידת המתאם כך שלא יישאר מאגר מעל הפאזה הנייחת.

אבטח את המיקום של יחידת המתאם באמצעות נעילת המתאם. חבר את העמודה למשאבת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, וכדי לשטוף את העמודה למשך הלילה עם מאגר אמוניום אצטט, הגדר את קצב הזרימה ל-0.2 מיליליטר לדקה. לאחסון ארוך יותר, הפעילו את העמודה עם תמיסת נתרן אזיד 0.05% בחיץ אמוניום אצטט, תוך לבישת מעיל מעבדה, משקפי בטיחות וכפפות בעת עבודה עם נתרן אזיד ואחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.IAM.

מחשב אישי. חלקיקי DD2 עם שברי ממברנת תאי TrkB נוירובלסטומה משותקים ובנוכחות BDNF גרמו לחלקיקים פלואורסצנטיים. לא נצפתה פלואורסצנציה בחלקיקי IAM עטופים בממברנת תאי TrkB, או כאשר לא נעשה שימוש ב-BDNF כמו בחלקיקי IAM עטופים בקרום תאי TrkB. מוצגת זיקה קדמית פונקציונלית של כרומטוגרמה אופיינית של 7, 8-DHF של ריכוזים של מילימולר אחד, 750 ננומולר, 500 ננומולר ו-300 ננומולרים לקולטני TrkB המשותקים, שהראו שינוי תלוי ריכוז בזמן השמירה.

עמודת CMAC לא מתפקדת הראתה את היעדר השינויים התלויים בריכוז בשמירה על ליגנד הסמן. עמודת בקרה שלילית של CMAC הוכנה על ידי שיתוק שברי קרום התא, ולא ביטוי של החלבון הממוקד כדי לשלול אינטראקציות לא ספציפיות. התוספת של 0.2% תמצית גוטו קולה מימית הביאה להפחתה משמעותית של 7, 8-DHF שימור, מה שמעיד על נוכחות של ליגנדות מתחרות לאתר הקשירה האגוניסטי.

חוסר ההפחתה של 7, 8-DHF שמירה על עמודת האפסים השלילית של CMAC TrkB אישר עוד יותר את היעדרם של קולטני TrkB פונקציונליים בעמודה זו. גישת הכרומטוגרפיה החסרה של השיא זיהתה תרכובת שנשמרה בחוזקה בעמודת TrkB, תוך שהיא מתרחקת בשלב מוקדם בעמודת האפס של TrkB, מה שמעיד על אינטראקציה ספציפית. זה חיוני כדי לדעת את מקור הקולטנים שלך עבור עמודת כרומטוגרפיה מהירה של זיקה לקרום התא.

הקפידו לבדוק את הספרות כדי לתכנן כראוי מאגרי הומוגניזציה וסולוביזציה. עמודת הכרומטוגרפיה של זיקת הממברנה התאית שהוכנה בפרוטוקול זה שימשה לזיהוי פגיעות פוטנציאליות חדשות בתרופות ולאפיון אופי האינטראקציה בין קולטן משותק לבין הליגנדות הטבעיות שלו.