כימות של פרמטרי כלי דם ברשתיות הר שלמות של עכברים עם רטינופתיות שאינן מתרבות ושגשוגות

מאמר זה מתאר בדיקת כתמי לציטין מבוססת וניתן לשחזור עבור כל ההכנות לרשתית ההר ואת הפרוטוקולים הנדרשים למדידה כמותית של פרמטרים וסקולריים משתנים לעתים קרובות ברטינופתיות שגשוג ולא מתרבות.

ברטינופתיות, שינויים בכלי הדם הם הסימן הראשון שזוהה על ידי רופאים. הם עוקבים אחר התקדמות המחלה, והם בוחרים טיפול על פי שינויים אלה. מספר מודלים של בעלי חיים פותחו על מנת לחקור שלבים שונים של הפתולוגיה.

בעבודה זו, אנחנו הולכים להראות כיצד למדוד שינויים שונים בכלי הדם. בשביל זה, אנחנו הולכים להעסיק שני מודלים בעלי חיים. אחד מהם הוא מודל עכבר רטינופתיה המושרה בחמצן, אשר משחזר את הרטינופתיה של פגות וכמה היבטים של רטינופתיה סוכרתית מתרבה.

כאן, אנחנו הולכים למדוד אזורים וסקולריים, אזורים ניאו-וסקולריים, ואת הרחבה וטורטואוזיות של העורקים. במעבדה שלנו, פותח מודל עכבר תסמונת מטבולית, אשר גורם רטינופתיה nonproliferative. צפיפות כלי הדם והסתעפות הוערכו בעבודה זו.

על הקרבת עכברים, enucleatize עם מספריים. תקן עיניים מפונקות עם paraformaldehyde מוכן טרי במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. תחת המיקרוסקופ המנתח, להסיר את הקרניות עם מספריים על ידי חיתוך לאורך הלימבוס ולנתח את הרשתיות כולה.

השלך את המקטע הקדמי של העין ולאחר מכן הפרד את הרשתית מה- RPE-choroid. מניחים את הרשתיות ב-200 צינורות מיקרוליטר. לאחר מכן לחסום ולחלחל את הרשתיות ב 100 microliters של TBS המכיל 5% אלבומין סרום בקר טריטון במהלך שש שעות בארבע מעלות עם תסיסה עדינה בשייקר.

לאחר מכן להפוך את הצינור כדי למקם את הרשתית בכוס ולהסיר את פתרון החסימה עם פיפטה. הוסף פתרון 100 מיקרוליטר המכיל איזולקטין. לעטוף את הצינורות עם רדיד אלומיניום כדי להגן על דגימות מפני אור.

לדגור את הרשתיות עם פתרון לציטין לילה בארבע מעלות עם תסיסה עדינה בשייקר. לשטוף את הרשתיות עם 100 מיקרוליטרים של TBS-טריטון במשך 20 דקות עם תסיסה עדינה בשייקר. חזור על שלב זה שלוש פעמים.

מניחים את הרשתית בשקופית ומוסיפים טיפה של PBS. תחת מיקרוסקופ ניתוח, בצע ארבעה חתכים רחוקים באותה מידה משולי הרשתית לכיוון עצב הראייה. כדי לפתוח את עלי הכותרת של הרשתית, השתמש מלקחיים או חתיכות קטנות של נייר מסנן.

ודא שצד קולטן האור פונה כלפי מטה. הסר את ה- PBS הנותר מהשקופית עם נייר סינון. לאחר מכן הוסיפו חציון הרכבה וכיסוי.

תן לו להתייבש במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. אחסן שקופיות בארבע מעלות מוגנות מפני אור. במיקרוסקופ הקונפוקלי, מקם את השקופית בצלחת עם הפנים כלפי מטה.

למקד את מקלעת מעולה של כלי הרשתית ולבחור אזור כדי להתחיל את רכישת התמונה. הגדר פרמטרי לייזר כלליים בתוכנה. הגדר את הקואורדינטות בצירי X, Y ו- Z.

אתחל את הסריקה. לאחר סיום תהליך הסריקה, פתח את התמונה ושמור אותה עם הרחבה מועדפת. בתוכנת ImageJ FIJI, עבור אל שורת התפריטים ולחץ על קובץ, פתח.

בחר את התמונה לעיבוד. בחלון אפשרות ייבוא של תבניות ביולוגיות, בחר הצג מטה-נתונים של OME-XML ולחץ על OK.In חלון המטה-נתונים של OME, חפש מידע על גודל הפיקסלים. העתק נתונים אלה.

לכיול תמונה, עברו לשורת התפריטים ובחרו 'מאפייני תמונה'. העתק את המידע ולחץ על אישור. הקצה פריט מועדף לתמונה. להצגה חזותית של כל הערימה בתמונה אחת, עבור אל שורת התפריטים ובחר תמונה, ערימות, Z Project.

בחלון ההקרנה המוצג, בחר את כל הערימות שבהן מוצגים כלי שיט. בסוג הקרנה, בחרו 'עוצמה ממוצעת' ולחצו על הלחצן 'אשר'. עבור אל שורת התפריטים, תמונה, התאמה, בהירות/ניגודיות. לחץ על החל ושמור שינויים.

העתק את הפרמטרים שנבחרו עבור בהירות וניגודיות. אלה חייבים להיות זהים לכל התמונות. בשורת התפריטים, בחרו בכלי שרביט.

בחר את אזור הרשתית שחסרים לו כלי נגינה. הקש T בלוח המקשים כדי להקליט את האזורים הנבחרים במנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ על מדוד במנהל ההחזר על ההשקעה כדי לקבל את המידע על אזור כלי הדם.

חזור על שלבים אלה כדי למדוד את השטח הכולל של הרשתית. בשורת התפריטים, בחרו בכלי שרביט. הגדל את התצוגה של התמונה כדי לדמיין טוב יותר את neovessels.

בחר את neovessels אחד אחד עם הכלי שרביט. הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ על מדוד במנהל החזר ההשקעות כדי לקבל את נתוני האזור.

בשורת התפריטים, בחרו בכלי קו ישר. הגדל את התצוגה של התמונה כדי לדמיין טוב יותר את קיר כלי השיט. בצע שלושה קווים חוצים לכלי הראשי לפני הענף הראשון.

הקש T בלוח המקשים כדי להקליט את האזורים הנבחרים במנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ על מדוד במנהל החזר ההשקעות כדי לקבל את נתוני המרחק. בשורת התפריטים, לחץ על סמל הכלי קו ישר עם הלחצן השמאלי של העכבר ובחר קו מקוטע.

צייר קו בתוך הכלי מעצב הראייה עד ההשפעה כלי השיט הראשון, בעקבות צורת כלי הדם. הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה. בשורת התפריטים, בחרו בכלי קו ישר.

צייר קו מעצב הראייה עד השלכות כלי השיט הראשון. הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ על מדוד על מנהל ההחזר על ההשקעה כדי לקבל את נתוני המרחקים.

בעזרת הכלי אליפסה של שורת התפריטים, הגדר אזור המוחל באופן שווה על כל תנאי הניסוי. האזור שנבחר חייב להיות עיגול קונצנטרי שצויר סביב עצב הראייה. הקש על אות T בלוח המקשים כדי להקליט את האזור הנבחר במנהל ההחזר על ההשקעה.

באופן ידני, ספור את מספר הענפים הראשיים הנובעים מכלי שיט עיקריים בתוך אזור הבחירה. הפכו את התמונה למצב של 8 סיביות. עבור אל תוספים בשורת התפריטים, בחר ניתוח כלי דם, צפיפות כלי דם.

הגדר אזור באמצעות הכלי ריבוע של שורת התפריטים שבו ברצונך למדוד את צפיפות כלי השיט. לחץ על אישור. התוכנית תציג חלון חדש עם המידע הנדרש. בדוגמה הניסיונית הראשונה, הועסק מודל עכבר רטינופתיה המושרה בחמצן.

זריקות intravitreal בוצעו ביום שלאחר הלידה 12 כדי לקבוע את האפקטיביות של תרופה כמו אנטינגיוגני. עכברים שהוזרקו עם רכב הועסקו כבקרה. אזורי כלי הדם מוגדרים כאזורים חסרי כלי דם ברשתית.

מן התמונות שנרכשו, אזורים וסקולריים ניתן לכמת כסכום של האזורים ללא כלי מחולק השטח הכולל של הרשתית. אזורים עם נזק מכני מראים גם היעדר כלי שיט. כדי לזהות אזורים פגומים, לנתח את השלמות של שכבות עצביות עם כתם Hoechst.

Neovessels הם כלי קליבר קטנים שמקורם בכלי דם קיימים של מקלעת כלי הדם מעולה. חישבנו את האזור שנכבש על ידי הטאפטים של neovessels על ידי כימות האזור הניאו-וסקולרי של הרשתית שנכבשה על ידי השטח הכולל של הרשתית. מכיוון שצורתם וגודלם של neovessels משתנים, מדי פעם, הם יכולים להיראות דומים לפסולת וחפצים.

כדי להבחין בין neovessels, ודא כי tuft גדל מכלי בוגר. לצורך ניתוח ההרחבה, מדדנו את קוטר הכלי העיקרי בשלושה גבהים לפני הענף הראשון. החוקרים חייבים להגדיר מרחק קבוע מראש כדי למדוד את קוטר הכלי על מנת להפחית את השונות בין התוצאות.

באופן אידיאלי, הנקודה הרחוקה ביותר מעצב הראייה צריכה להיות סביב 300 מיקרומטרים. אנו מציעים לבצע את הניתוח, ומאוחר יותר, ממוצע של לפחות שישה בעלי חיים לכל מצב. לגבי טורטואוזיות, אנו מודדים את המרחק שעבר כלי השיט הראשי בעקבות צורתו, ביחס למרחק הקו הישר בין עצב הראייה לנקודת ההסתעפות הראשונה.

כפי שאנו יכולים לראות בתמונה, יש הטרוגניות בסינוסיות של כלי הדם העיקריים. כדי להשיג תוצאה מייצגת, יש לכמת לא פחות משישה עכברים לכל תנאי. הפרמטרים האחרונים, הסתעפות כלי דם וצפיפות, נותחו במודל תסמונת מטבולית המציגה רטינופתיה לא מתרבות.

לצורך מדידת הסתעפות כלי הדם, הגדרנו את אזור הכימות על ידי ציור מעגל קונצנטרי, ואז ספרנו, בזה אחר זה, את הענפים העיקריים הנובעים מכלי מרכזי ראשי. מהתמונות שנרכשו, צפיפות כלי הדם כונתה כשטח הכבוש על ידי כלי דם מחולקים על ידי שטח ההחזר על ההשקעה, אשר הוצב במקומות שונים בכל מיקרופוטוגרפיה. הימנע מכמת אזורים עם נזק מכני.

אם יש יותר משני אזורים עם נקבים, יש להשליך את הרשתית. לסיכום, במאמר זה, הראינו טכניקות קלאסיות, מבוססות היטב ושחזור כדי לכמת כמה מהפרמטרים הרלוונטיים ביותר תוך התחשבות בפרקטיקה הקלינית.