Name: הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: חקור את שיטת ה-BSLBs לחקר תפוקת הסינפסות החיסוניות של תאי T באמצעות ציטומטריית זרימה רב-צבעית. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח ביוכימי מדויק של חלקיקים חוצי-סינפטיים בתאים חיסוניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי המעבדה שלנו ולקהילת מכון קנדי לראומטולוגיה על דיונים מדעיים קונסטרוקטיביים, במיוחד מנהל מתקן ציטומטריית הזרימה שלנו, ג'ונתן וובר. עבודה זו מומנה על ידי מלגת המחקר הראשית של Wellcome Trust 100262Z/12/Z, המענק המתקדם של ERC (SYNECT AdG 670930), וקרן קנדי למחקר ראומטולוגיה (KTRR) (כל השלושה ל- MLD). PFCD נתמך על ידי EMBO ארוך טווח מלגה (ALTF 1420-2015, בשיתוף עם הנציבות האירופית (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) ומארי Sklodowska-Curie פעולות) ומלגת אוקספורד-בריסטול מאיירס סקוויב.

<ol><li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li>
<li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li>
<li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528(2019).</li>
<li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li>
<li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li>
<li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li>
<li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+%28Th%29+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate%3A+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li>
<li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li>
<li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li>
<li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).</li>
<li>Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+compensation+for+flow+cytometry%3A+visualization+artifacts%2C+limitations%2C+and+caveats%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li>
<li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367(2020).</li>
<li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li>
<li>Céspedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654(2017).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+autofluorescence+after+compensation%3A+Be+panglossian%2C+fret+not%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li>
<li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+controls%2C+instrument+setup%2C+and+the+determination+of+positivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li>
<li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li>
<li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין ניגוד אינטרסים להצהיר.

BSLBs הם כלים רב-תכליתיים לחקר תפוקת החלקיקים של תאי T מגורה עם ממברנות APC מודל. הגמישות של השיטה מאפשרת שחזור של הרכבי ממברנות מורכבים ורדוקציוניסטיים כדי לחקור את ההשפעות של ליגנדים ואת האותות שלהם על הפרשת tSVs וחלקיקי התקפה סופרמולקולרית ורכיביהם. בדקנו טכנולוגיה זו בתאי T שונים, כולל TH, CTL, טרגס ו- CART15. פרוטוקול זה פועל גם למדידת שחרור חלקיקים סינפטיים של תאי T מבודדים טריים ודיכאוניים. מגבלה אחת של שימוש בתאי T מבודדים טריים היא שאוכלוסיות שקטות אלה מייצרות פרופיל שונה של חלקיקים טרנס-...

הסינפסה החיסונית (IS) היא מבנה מולקולרי מרכזי שנוצר בממשק של תאים העוסקים במגע פיזי המאפשר חילופי מידע מוסדר של juxtracrine. ISs שונים תוארו בספרות, וגוף גדל והולך של ראיות מצביע על כך שרכזות מולקולריות אלה הן תכונה שמורה של רשתות סלולריות. תאי חיסון שונים, כולל תאי B, תאי רוצח טבעיים, תאים דנדריטיים, מקרופאגים ותאי T, מחליפים מידע באמצעות הרכבה של מגעים קצרי מועד1. מחקרים רב-לאומיים מקדמים את ההבנה של תת-קבוצות חדשות של לויקוציטים ותאי סטרומה המניעים רשתות תאיות פתוגניות ומבטאים חלבוני שטח בעלי פונקציות לא ידועות. כמו APCs סינתטיים, BSLBs לאפשר חקירה ישירה של התפקיד התפקודי של חלבונים בודדים בשילוב של הפעלת אותות, כלומר אנטיגנים ו costimulation / corepression, על ידי תאי T ואת שחרור וכתוצאה מכך שחרור של חלקיקים מפעילים המכונה אות ארבע.
מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים ואת הנקודות הטכניות הקריטיות שיש לקחת בחשבון בעת שימוש ב- BSLBs כדי לחקות את הרכב פני השטח של APCs מודל. הפרוטוקולים למדידה כמותית של קולטני מערכת החיסון וחלבוני שטח אחרים ב- APCs מוצגים יחד עם הפרוטוקול לשחזור של נגמ"שים סינתטיים המכילים כמויות נמדדות אלה. לאחר מכן, השלבים הנדרשים עבור coculturing תאי T ו- BSLB מוצגים יחד עם הפרוטוקול למדידה הכמותית של העברת חלקיקים טרנס-סינפטית באמצעות cytometry זרימה. למרבה הפלא, BSLBs להקל על לימוד אוכלוסייה שמקורה קרום פלזמה של tSVs המכונה אקטואוזומים סינפטיים (SEs). תאי T-cell antigen מועשרים בקולטן (TCR+) SEs נשפכים בתגובה TCR מפעיל2 ביעילות נתפס על ידי BSLBs3, המייצג קריאה מצוינת כדי להעריך את המאפיינים האגוניסטיים של אנטיגנים ואת הרכב הממברנה מודל. אקסוזומים CD63+ וחלקיקי התקפה סופרמולקולריים (SMAPs) משתחררים גם הם על ידי תאי T מגורים ונלכדים על ידי BSLBs. הם יכולים לשמש כקריאות נוספות של הפעלה והפרשת גרגיר אקסוציטית וליטית וכתוצאה מכך על ידי תאי T. גיוס שלפוחיות אקסוציאטיות לקוטב האינטראקציה של תא T מקל גם על שחרור כיווני של ציטוקינים, כגון IL-2, IFN-γ ו- IL-10 בתגובה להפעלה 4,5,6,7,8. למרות ציטוקינים שוחררו תאי T ניתן לזהות גם על BSLBs, מחקר ייעודי יותר נמצא כעת בפיתוח כדי לאמת את הניתוח הכמותי של שחרור ציטוקינים בסינפסה החיסונית.
כדי לחקור כיצד הרכבי ממברנה ספציפיים משפיעים על התפוקה הסינפטית של תאי T דורש להגדיר את הצפיפות הפיזיולוגית של רכיב קרום היעד. כימות מבוססי ציטומטריה זרימה של חלבונים על פני התא הם צעד חיוני בפרוטוקול זה ודורשים: 1) שימוש בנוגדנים עם מספר ידוע של פלואורוכרום לנוגדן (F/P), ו -2) חרוזי בנצ'מרק המספקים התייחסות סטנדרטית לאינטרפולציה של מולקולות פלואורוכרום מעוצמות פלואורסצנטיות ממוצעות נמדדות (MFIs).
תקני אמת מידה אלה מורכבים מחמש אוכלוסיות חרוזים, שכל אחת מהן מכילה מספר גדל והולך של פלואורכומים מסיסים מקבילים (MESFs), המשתרעים על פני הטווח הדינמי של זיהוי פלואורסצנטיות שרירותי. אוכלוסיות סטנדרטיות אלה מניבות פסגות פלואורסצנטיות נפרדות, ומאפשרות המרה של יחידות פלואורסצנטיות שרירותיות ל- MESFs על ידי רגרסיה ליניארית פשוטה. ה- MESFs המתקבלים משמשים לאחר מכן לצד ערכי F/P נוגדנים כדי לחשב את המספר הממוצע של מולקולות מאוגדות לכל תא (או BSLB בשלבים מאוחרים יותר). היישום של אזורי שטח תא משוערים למספר הממוצע של מולקולות שזוהו ואז מאפשר חישוב של צפיפות פיזיולוגית כמו מולקולות / μm2. פרוטוקול כימות זה יכול להיות מותאם גם למדידת צפיפות החלבון על תאי T ולשיקום הביוכימי של הרכבי הממברנה המתווכים את היווצרות הסינפסות ההומוטיפיות של תאי T (כלומר, סינפסות T-T9). במידת הצורך, ניתן להעריך עוד יותר את הערכיות של כריכת נוגדנים באמצעות מטרות רקומביננטיות המסומנות במספרים ידועים של פלואורוכרומים לכל מולקולה. לאחר מכן, ניתן לחשב את הערכיות המחייבת נוגדנים עבור אותה אוכלוסיית BSLB על ידי השוואת מספר חלבונים פלואורסצנטיים מאוגדים ונוגדני כימות (באמצעות שני פלואורוקרומים כימות שונים ותקני MESF).
השחזור של ממברנות APC דורש הרכבה של bilayers השומנים נתמך (SLBs) על חרוזי סיליקה1. מלאי ליפוזום המכיל מינים שונים של פוספוליפידים ניתן לרתום כדי ליצור מטריצת ליפיד-bilayer רב תכליתית, המאפשרת עיגון של חלבונים רקומביננטיים עם כימיה מחייבת שונה (הכנת ליפוזומים מפורטת ב 10). לאחר הגדרת הצפיפות הפיזיולוגית (או הצפיפות) של הליגנד הרלוונטי "על התאים", אותו פרוטוקול ציטומטריית זרימה מותאם להערכת ריכוז החלבון הרומביננטי הדרוש לציפוי BSLBs בצפיפות הפיזיולוגית של המטרה. ניתן להשתמש בשתי מערכות עיגון שונות בשילוב או בנפרד.
ראשית, SLB המכיל 12.5 mol% סופי של Ni2 + המכיל פוספוליפידים מספיק כדי לספק כ -10,000 אתרי כריכת התג שלו לכל micron10 מרובע ועובד היטב כדי לקשט BSLBs עם רוב החלבונים הזמינים מסחרית אשר צפיפות פיזיולוגית שלהם אינה עולה על קיבולת טעינה מקסימלית זו. מערכת הטעינה השנייה רותמת פוספוליפידים המכילים ביוטין (כמו מול%) לטעינת ביו-טיניל נגד CD3e Fab (או מונומרים HLA/MHC) באמצעות גשרי סטרפטאבידין. השילוב של שתי שיטות קישוט BSLB אלה מאפשר תפירה גמישה של BSLBs כנגמ"שים סינתטיים. עבור קומפוזיציות משטח APC מורכבות מאוד, ניתן להגדיל את המול% של פוספוליפידים וחלבונים כדי לטעון חלבונים רבים ככל שהשאלה בהישג יד דורשת. לאחר ריכוזי העבודה של חלבונים מול% של פוספוליפידים biotinylated מוגדרים, BSLBs ניתן להרכיב כדי לחקור את הפלט הסינפטי של תאי T עם cytometry זרימה multiparametric.

הכנת bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי t

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

תאים המציגים אנטיגן (נגמ"שים) מציגים שלושה אותות מפעילים לתאי T העוסקים במגע פיזי: 1) אנטיגן, 2) תמחיר / דיכוי ליבה, ו -3) ציטוקינים מסיסים. תאי T משחררים שני סוגים של חלקיקי מפעיל בתגובה להפעלה: שלפוחיות טרנס-סינפטיות (tSVs) וחלקיקי התקפה סופרמולקולריים, המעבירים שליחים בין-תאיים ומתווכים ציטוטוקסיות, בהתאמה. ישויות אלה מופנמות במהירות על ידי נגמ"שים העוסקים במגע פיזי עם תאי T, מה שהופך את האפיון שלהם להרתיע. מאמר זה מציג את הפרוטוקול כדי לפברק ולהשתמש ב-Belayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים (BSLBs) כחיקויים של תאים מציגי אנטיגן (APC) כדי ללכוד ולנתח חלקיקים טרנס-סינפטיים אלה. כמו כן מתוארים הפרוטוקולים למדידות המוחלטות של צפיפות חלבונים על משטחי תאים, שחזור של BSLBs עם רמות פיזיולוגיות כאלה, ואת הליך ציטומטריית הזרימה למעקב אחר שחרור חלקיקים סינפטיים על ידי תאי T. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי ללמוד את ההשפעות של חלבונים בודדים, תערובות ליגנד מורכבות, דטרמיננטים פתוגן virulence, ותרופות על תפוקת האפקט של תאי T, כולל תאי T עוזר, לימפוציטים T ציטוטוקסיים, תאי T רגולטוריים, ותאי T קולטני אנטיגן כימריים מבטאים (CART).

FCM לכימות חלבונים מוחלט על פני התא שחזור של BSLBs המציגים צפיפות פיזיולוגית של ליגנדים דורש הערכה של צפיפות החלבון הכוללת בקבוצת המשנה של התאים המעוצבים. כדי לשקם את ה-BSLBs, כלול כל ליגנד רלוונטי שצפוי למלא תפקיד בציר האיתות של עניין לצד חלבונים התומכים בהידבקות ובאינטראקציה תפקודית בין BSLB לתאים, כגון ICAM-1 ומולקולות תותבות, למשל, קולטני CD40, CD58 ו- B7 (CD80 ו- CD86). ניתן להוסיף חלבונים נוספים בהתאם לשאלה שלפנינו, כולל מולקולות costimulatory כגון ICOSL3, PD-L1 ו- PD-L21...

כאן אנו מציגים את הפרוטוקול לשחזור צעדים של תאים סינתטיים המציגים אנטיגן באמצעות Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים ואת השימוש בהם כדי לחקור את הפלט הסינפטי מתאי T מופעלים.

הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

חקר התפוקה של הסינפסה החיסונית הוגבל בעיקר לשיטות מיקרוסקופיות. BSLBs הרחיבו את רפרטואר הכלים שלנו שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הפלט של סינפסות חיסוניות של תאי T, כולל ציטומטריית זרימה, מיקרוסקופיה, פרוטאומיקה וטכנולוגיות ריצוף RNA. ככזה, ניתן להשתמש ב- BSLBs במגוון רחב של שאלות אימונולוגיות ובזיהוי ההרכב והרגולציה הביוכימית של תפוקת תאי ה- T.זה כולל, למשל, את המחקר של קולטני אנטיגן כימריים, תרופות המעכבות מסלולי איתות ספציפיים, או אבלציה גנטית של גנים מעניינים. אחד ההיבטים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הוא לייעל את כיול החלבון ואת לוח ציטומטריית הזרימה הצבעוני הנדרש למעקב אחר החלקיק הטרנס-סינפטי של עניין. זה דורש איטרציה שיטתית של ריכוזי חלבון, ריכוזי נוגדנים, והגדרות מכשירים.התחל על ידי דילול מיקרוליטר אחד של תמיסת חרוזים עם 1,000 מיקרוליטרים של PBS. לספור את החרוזים באמצעות תא hemocytometer ולחשב את הריכוז שלהם למיליליטר. לאחר מכן, לחשב את הנפח של חרוזי סיליקה הדרושים עבור 500, 000 BSLBs הסופי לכל נקודת טיטרציה.העבר את הנפח הנדרש של חרוזי סיליקה לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטריליטר של 1.5 מיליליטר. לשטוף את חרוזי סיליקה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי וצנטריפוגות החרוזים. הכינו שלושה כרכים של תערובת מאסטר ליפוזום המכילה אחוז סופי של 12.5 מול של פוספוליפידים המכילים ניקל.השתמש בתערובת מאסטר ליפוזום כדי resuspend חרוזי סיליקה שטף. לאחר מכן, ערבבו אותו בעדינות על-ידי צנרת מעלה ומטה של מחצית מהנפח הכולל. באמצעות טכניקה סטרילית, מוסיפים גז ארגון או חנקן לצינור כדי לעקור אוויר ולהגן על השומנים מפני חמצון במהלך ערבוב.הוסף ארגון למניות השומנים 0.4 מילימולרי. לאחסן את המלאי ולתפעל באמצעות טכניקה סטרילית. העבירו את ה-BSLBs למיקסר האנכי וערבבו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות ערבוב מסלולי ב-10 סל"ד.לאחר מכן, לסובב את החרוזים על ידי צנטריפוגה במשך 15 שניות בטמפרטורת החדר על מיני-מרכזי ספסל העליון. חסום את ה- BSLBs שנוצרו על-ידי הוספת מיליליטר אחד של 5% BSA המכיל 100 מיקרומולר של ניקל גופרתי כדי להרוות אתרי NTA ב- BSLBs. לשטוף שלוש פעמים באמצעות מאגר HBS-HSA כדי להסיר את פתרון החסימה העודף.קחו צלחת חדשה של 96 בארות עם תחתית U או V-bottom והכנו דילול סדרתי כפול של החלבונים. תנצל מחדש את ה- BSLBs המוכנים באמצעי אחסון כך ש- 100 מיקרוליטרים של מאגר HBS-HSA יכילו 500, 000 BSLBs. לאחר מכן, קח עוד צלחת U-bottom או V-bottom 96-well ולהעביר 100 מיקרוליטרים של השעיית BSLB לבארות באופן כזה שכל באר מקבלת 500, 000 BSBLs.סובבו את הצלחת השנייה בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות ב-300x G.Discard את הסופר-נרטיב והעבירו נפחים של 100 מיקרוליטרים מלוחית החלבון לצלחת המכילה את ה-BSLBs המשושקעים. השתמש בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור ודגר בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות ב 1, 000 סל"ד.לאחר מכן, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים על ידי הוספת מאגר HBS-HSA לצלחת לסובב אותו בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות ב 300x G.Count התאים לאחר הכביסה. לאחר מכן, לדלל אותם לריכוז סופי של 2.5 מיליון למיליליטר באמצעות מדיום בדיקת העברה סינפטית. לאחר שה-BSLBs עמוסים בתערובת החלבון, שטפו את ה-BSLBs פעמיים עם מאגר HBS-HSA כדי להסיר את עודפי החלבונים הלא מאוגדים.Resuspend 500, 000 BSLBs לבאר ב 200 מיקרוליטרים של מאגר HBS-HSA. העבר 100 מיקרוליטרים של BSLBs לבאר לצלחת חדשה של 96 בארות תחתון U כדי ליצור שכפול, כך שהכמות הסופית של BSLB לבאר היא 250, 000. לסובב את BSLBs ב 300x G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.השלך את supernatant ולאחר מכן resuspend BSLBs באמצעות 100 מיקרוליטרים של השעיית תא T. מערבבים בעדינות כדי למנוע היווצרות של בועות. לדגור על תרבויות משותפות במשך 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.הגן על התאים מפני אור וקרר את התרבויות המשותפות על ידי הדגירה הראשונה שלהם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפחות. צנטריפוגות תרבויות משותפות בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות ב 500x G.להשליך את supernatant ו resuspend את התרבויות המשותפות בסידן ומגנזיום יון ללא 2% BSA PBS בטמפרטורת החדר לחסימה. מניחים את התאים על קרח במשך 45 דקות ולהגן עליהם מפני אור.הכינו את תערובת הנוגדנים הראשית באמצעות 0.22 מיקרומטר מסונן כקרח מסונן 2%BSA ו- PBS כחוצץ כתמים. תערובת ראשית זו תספק חסימה נוספת. סובב את תרביות המשנה ב 500x G במשך חמש דקות וארבע מעלות צלזיוס.השלך את supernatants, ולאחר מכן להשתמש פיפטה רב ערוצית כדי resuspend התאים בתערובת מאסטר כתמים המכיל ריכוזי נוגדנים ממוטבים. כלול תאים בעלי תווית איזוטיפ ו- BSLBs, BSLBs פלואורסצנטיים ולא פלואורסצנטיים, ותאים ו- BSLBs מוכתמים לבדם. יש לערבב בעדינות על-ידי צנרת מעלה ומטה של חצי מהנפח.דגירה במשך 30 דקות על קרח ולהגן עליהם מפני אור. לשטוף את התאים BSLBs פעמיים באמצעות קר כקרח 2% BSA PBS. סובב אותם ב 500x G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר צנטריפוגה, לבדוק את התרבות המשותפת משקע בתחתית הבארות. לאחר מכן, resuspend את תרבויות co שטף ב 100 microliters של PBS לרכוש מיד. הפעל את קנה המידה של יומן הרישום עבור אור מפוזר בצד ופרמטר זמן הטיסה עבור אורות מפוזרים בצד ובקדימה.רכש תקני MESF, המבטיחים שהאוכלוסיות העמומות והבהירות ביותר ייפלו בטווח הליניארי של המכשיר. לאחר מכן, לרכוש דגימות פיצוי, לחשב פיצוי, ולהחיל את מטריצת הפיצוי לניסוי. השג ושמור לפחות 20,000 תקני MESF כוללים עבור כל ערוץ כימות.הימנע משימוש בנוזל נדן FACS או דומה לחרוזי MESF resuspend, שכן אלה מכילים מלחים ואלכוהול שישמידו את הפלואורוכרומים, מה שיוביל לפסגות פלואורסצנטיות רחבות יותר וטעות גבוהה. לרכישה באמצעות דוגמים בעלי תפוקה גבוהה, הגדר רכישת מכשירים לסטנדרט, הגדר רכישה לדוגמה ל- 80 מיקרוליטרים. קצב זרימה לדוגמה בין שניים לשלושה מיקרוליטרים לשנייה, נפח ערבוב מדגם ב-50 מיקרוליטרים, ערבוב מדגם של 150 מיקרוליטר לשנייה וערבוב לבאר בין שלוש לחמש.להשיג מינימום של 10, 000 BSLBs בודדים לכל מדגם. לבסוף, יצא את קבצי FCS. דוגמה למדידות ציטומטריית זרימה כמותית של ICAM-1 על פני השטח של תאי שקדים B ותאי T עוזר מוצגת כאן.התמונות הייצוגיות מתארות את אסטרטגיית ההצטברות לניתוח תאי CXCR5 B בודדים ותאי T מסייעי זקיקים המבודדים משקדים של פלטין אנושיים. אסטרטגיית גיור רציפה זו מזהה אירועים חיים בודדים בחלון הרכישה הרציף. הכפילים, ביטוי פני התא של ICAM-1 בהשוואה לבקרות FMO ובקרות FMO המסומנות באיזוטיפים רלוונטיים של האוכלוסיות, מוצגים כאן.Gating ומדידה של MFIs מאוכלוסיות MESF סטנדרטיות שונות בהיסטוגרמה המכסה של אוכלוסיות MESF מוצגים כאן. הערכים מייצגים את ממשקי ה- MF עבור כל אחת מחמש אוכלוסיות MESF. רגרסיה ליניארית של MESF מעל cMFI עבור אוכלוסיות MESF מוצגים כאן.השיפוע מחלץ MESF קשור לתאים מנתוני FCM של ICAM-1 על פני השטח של תאי B שקדים ב- TFH. ההמרה לצפיפות מולקולרית מוחלטת באה בעקבות פעולות מתמטיות פשוטות אלה. התמונות הייצוגיות מראות את ניתוח ציטומטריית הזרימה של BSLBs שהוחזר עם צפיפות מוגברת של היסטידינים ICAM-1 12 מונומריים רקומביננטיים.ניתוחי רגרסיה של ריכוז ייחוס ICAM-1 על פני צפיפות נמדדת מוצגים כאן. השיפוע משמש לחישוב ריכוזי היעד של חלבון כדי להשיג את צפיפות התאים. דיאגרמות הזרימה מציגות את השלבים הקריטיים לשיתוף תאי T עם BSLBs, ומשחזרות את קרומי המודל במדידה הבאה של העברת חלקיקים עם ציטומטריית זרימה.אסטרטגיית ההרחבה לזיהוי BSLBs ותאים בודדים בחלון הרכישה הרציף מוצגת כאן. אחד ההיבטים החשובים ביותר של פרוטוקול זה הוא, כדי לשמור על רבייה של התוצאות, בכל פעם שאתה משנה מלאי חלבון או שומנים בדם, אתה צריך לבצע ניתוח כיול חדש. כדי לגלות מולקולות יעילות חדשות המופרשות על ידי תת-קבוצות שונות של תאי T, ניתן לבודד עוד יותר BSLBs על ידי מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות כפי שהם נתונים לניתוח תמלול ופרוטאומי.עמיתינו באוניברסיטת אוקספורד השתמשו בטכנולוגיה זו כדי לחקור ולהדגים אינטראקציות קולטן-ליגנד חדשות, וגם כדי לחקור את ההשפעות של אבלציות גנטיות על הפלט של הסינפסה החיסונית של תאי T.

preparation-bead-supported-lipid-bilayers-to-study-particulate-output

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Bilayers מישוריים נתמכים הם כלים רבי עוצמה שיכולים לשמש מודל אינטראקציות מולקולריות בסינפסה האימונולוגית. כאן, אנו מציגים שיטות לעיגון הידבקות התא חלבונים ידועים לווסת היווצרות הסינפסה לעלון העליון של bilyer השומנים ולדמיין היווצרות הסינפסה באמצעות מיקרוסקופ TIRF.

Bilayers מישורי נתמכות עבור תצורת לימוד של סינפסות החיסונית Kinapse

סרטון זה מתאר את הטכניקה של חקר הרכבת חלבון ספטין על מיקרוספרות מצופות בדו-שכבות ליפידים. טכניקה זו מסייעת בהבנת המכלולים תלויי העקמומיות של חלבון על משטחים מעוקלים.

בדיקה דו-שכבתית ליפידית נתמכת כדורית: טכניקה לצפייה במכלול ספטין על מיקרוספרות

סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית היווצרות הסינפסה החיסונית בתאי הרג טבעי (NK) על שכבה דו-שכבתית שומנית נתמכת (SLB). ה-SLB מסומן תחילה עם ליגנד קולטן של תא NK המתויג כפלואורופור, ולאחר מכן דגירה עם תאי NK. לאחר מכן, התאים מוכתמים עבור אקטין פולימרי גרגירים ליטיים חיוביים perforin. גישה זו מאפשרת הדמיה של היווצרות סינפסות באמצעות מיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED).

הדמיה ברזולוציית על של היווצרות סינפסה אימונולוגית של תאי NK על דו-שכבה ליפידית נתמכת

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה לחקר היווצרות סינפסות חיסוניות בין תאי T אנושיים ראשוניים לבין דו-שכבות שומנים נתמכות (SLB). חלבוני פני השטח של תאי T מתקשרים עם ליגנדות בהתאמה המשותקות על SLB כדי ליצור סינפסה חיסונית, ואחריה תנועה של גרגירים ליטיים לכיוון הסינפסה, אשר מומחשת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

טכניקת מבחנה לחקר אינטראקציה של תאי T עם דו-שכבות שומנים מישוריות נתמכות

סרטון זה מדגים את ההרכבה מחדש של תאים סינתטיים מציגי אנטיגן באמצעות דו-שכבות ליפידים הנתמכות על ידי חרוזים ויישומם בהערכת הפלט הסינפטי שנוצר על ידי תאי T פעילים.

שימוש בשכבות שומנים הנתמכות על ידי חרוזים כדי לחקור את הפלט הסינפטי מתאי T

bilayers שומנים נתמך וחלקיקי קרום טבעיים הם מערכות נוחים שיכול להתקרב למאפיינים של קרום תא ולהיות משולבות במגוון רחב של אסטרטגיות אנליטיות. כאן אנו מדגימים שיטה להכנת microarrays המורכב של SiO 2 חרוזים נתמכים שומנים מצופים bilayer, שלפוחית ​​פוספוליפידים או חלקיקי קרום טבעיים.

היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב

אנו מתארים כאן שילוב של טכניקת דו-שכבת השומנים הנתמכת בזכוכית ליצירת סינפסות אימונולוגיות עם טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה של מיקרוסקופיה של דלדול פליטה מגורה (STED). מטרת פרוטוקול זה היא לספק למשתמשים את ההוראות הדרושות לביצוע מוצלח של שתי טכניקות אלה.

הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית

חסינות אדפטיבית נשלטת על ידי 'סינפסות אימונולוגיות' דינמיות הנוצרות בין תאי T לתאים המציגים אנטיגן. פרוטוקול זה מתאר שיטות לחקירת תאי אנדותל הן כ-APCs פיזיולוגיים לא נחקרים והן כסוג חדש של 'מודל APC תאי מישורי'.

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

הפרוטוקול מתאר טכניקה ללמוד את היכולת של ראשי תאי T polyclonal האנושי כדי ליצור ממשקים סינפטית באמצעות השומנים מישורי bilayers. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להראות את היכולת היווצרות סינפסה דיפרנציאלית של האדם בתאי T העיקרי נגזר לימפה ודם היקפי.

הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

חקור את שיטת ה-BSLBs לחקר תפוקת הסינפסות החיסוניות של תאי T באמצעות ציטומטריית זרימה רב-צבעית. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח ביוכימי מדויק של חלקיקים חוצי-סינפטיים בתאים חיסוניים.

הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T

גלה סרטונים נוספים