הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T

חקר התפוקה של הסינפסה החיסונית הוגבל בעיקר לשיטות מיקרוסקופיות. BSLBs הרחיבו את רפרטואר הכלים שלנו שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הפלט של סינפסות חיסוניות של תאי T, כולל ציטומטריית זרימה, מיקרוסקופיה, פרוטאומיקה וטכנולוגיות ריצוף RNA. ככזה, ניתן להשתמש ב- BSLBs במגוון רחב של שאלות אימונולוגיות ובזיהוי ההרכב והרגולציה הביוכימית של תפוקת תאי ה- T.

זה כולל, למשל, את המחקר של קולטני אנטיגן כימריים, תרופות המעכבות מסלולי איתות ספציפיים, או אבלציה גנטית של גנים מעניינים. אחד ההיבטים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הוא לייעל את כיול החלבון ואת לוח ציטומטריית הזרימה הצבעוני הנדרש למעקב אחר החלקיק הטרנס-סינפטי של עניין. זה דורש איטרציה שיטתית של ריכוזי חלבון, ריכוזי נוגדנים, והגדרות מכשירים.

התחל על ידי דילול מיקרוליטר אחד של תמיסת חרוזים עם 1,000 מיקרוליטרים של PBS. לספור את החרוזים באמצעות תא hemocytometer ולחשב את הריכוז שלהם למיליליטר. לאחר מכן, לחשב את הנפח של חרוזי סיליקה הדרושים עבור 500, 000 BSLBs הסופי לכל נקודת טיטרציה.

העבר את הנפח הנדרש של חרוזי סיליקה לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטריליטר של 1.5 מיליליטר. לשטוף את חרוזי סיליקה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי וצנטריפוגות החרוזים. הכינו שלושה כרכים של תערובת מאסטר ליפוזום המכילה אחוז סופי של 12.5 מול של פוספוליפידים המכילים ניקל.

השתמש בתערובת מאסטר ליפוזום כדי resuspend חרוזי סיליקה שטף. לאחר מכן, ערבבו אותו בעדינות על-ידי צנרת מעלה ומטה של מחצית מהנפח הכולל. באמצעות טכניקה סטרילית, מוסיפים גז ארגון או חנקן לצינור כדי לעקור אוויר ולהגן על השומנים מפני חמצון במהלך ערבוב.

הוסף ארגון למניות השומנים 0.4 מילימולרי. לאחסן את המלאי ולתפעל באמצעות טכניקה סטרילית. העבירו את ה-BSLBs למיקסר האנכי וערבבו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות ערבוב מסלולי ב-10 סל"ד.

לאחר מכן, לסובב את החרוזים על ידי צנטריפוגה במשך 15 שניות בטמפרטורת החדר על מיני-מרכזי ספסל העליון. חסום את ה- BSLBs שנוצרו על-ידי הוספת מיליליטר אחד של 5% BSA המכיל 100 מיקרומולר של ניקל גופרתי כדי להרוות אתרי NTA ב- BSLBs. לשטוף שלוש פעמים באמצעות מאגר HBS-HSA כדי להסיר את פתרון החסימה העודף.

קחו צלחת חדשה של 96 בארות עם תחתית U או V-bottom והכנו דילול סדרתי כפול של החלבונים. תנצל מחדש את ה- BSLBs המוכנים באמצעי אחסון כך ש- 100 מיקרוליטרים של מאגר HBS-HSA יכילו 500, 000 BSLBs. לאחר מכן, קח עוד צלחת U-bottom או V-bottom 96-well ולהעביר 100 מיקרוליטרים של השעיית BSLB לבארות באופן כזה שכל באר מקבלת 500, 000 BSBLs.

סובבו את הצלחת השנייה בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות ב-300x G.Discard את הסופר-נרטיב והעבירו נפחים של 100 מיקרוליטרים מלוחית החלבון לצלחת המכילה את ה-BSLBs המשושקעים. השתמש בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור ודגר בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות ב 1, 000 סל"ד.

לאחר מכן, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים על ידי הוספת מאגר HBS-HSA לצלחת לסובב אותו בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות ב 300x G.Count התאים לאחר הכביסה. לאחר מכן, לדלל אותם לריכוז סופי של 2.5 מיליון למיליליטר באמצעות מדיום בדיקת העברה סינפטית. לאחר שה-BSLBs עמוסים בתערובת החלבון, שטפו את ה-BSLBs פעמיים עם מאגר HBS-HSA כדי להסיר את עודפי החלבונים הלא מאוגדים.

Resuspend 500, 000 BSLBs לבאר ב 200 מיקרוליטרים של מאגר HBS-HSA. העבר 100 מיקרוליטרים של BSLBs לבאר לצלחת חדשה של 96 בארות תחתון U כדי ליצור שכפול, כך שהכמות הסופית של BSLB לבאר היא 250, 000. לסובב את BSLBs ב 300x G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.

השלך את supernatant ולאחר מכן resuspend BSLBs באמצעות 100 מיקרוליטרים של השעיית תא T. מערבבים בעדינות כדי למנוע היווצרות של בועות. לדגור על תרבויות משותפות במשך 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

הגן על התאים מפני אור וקרר את התרבויות המשותפות על ידי הדגירה הראשונה שלהם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפחות. צנטריפוגות תרבויות משותפות בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות ב 500x G.להשליך את supernatant ו resuspend את התרבויות המשותפות בסידן ומגנזיום יון ללא 2% BSA PBS בטמפרטורת החדר לחסימה. מניחים את התאים על קרח במשך 45 דקות ולהגן עליהם מפני אור.

הכינו את תערובת הנוגדנים הראשית באמצעות 0.22 מיקרומטר מסונן כקרח מסונן 2%BSA ו- PBS כחוצץ כתמים. תערובת ראשית זו תספק חסימה נוספת. סובב את תרביות המשנה ב 500x G במשך חמש דקות וארבע מעלות צלזיוס.

השלך את supernatants, ולאחר מכן להשתמש פיפטה רב ערוצית כדי resuspend התאים בתערובת מאסטר כתמים המכיל ריכוזי נוגדנים ממוטבים. כלול תאים בעלי תווית איזוטיפ ו- BSLBs, BSLBs פלואורסצנטיים ולא פלואורסצנטיים, ותאים ו- BSLBs מוכתמים לבדם. יש לערבב בעדינות על-ידי צנרת מעלה ומטה של חצי מהנפח.

דגירה במשך 30 דקות על קרח ולהגן עליהם מפני אור. לשטוף את התאים BSLBs פעמיים באמצעות קר כקרח 2% BSA PBS. סובב אותם ב 500x G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר צנטריפוגה, לבדוק את התרבות המשותפת משקע בתחתית הבארות. לאחר מכן, resuspend את תרבויות co שטף ב 100 microliters של PBS לרכוש מיד. הפעל את קנה המידה של יומן הרישום עבור אור מפוזר בצד ופרמטר זמן הטיסה עבור אורות מפוזרים בצד ובקדימה.

רכש תקני MESF, המבטיחים שהאוכלוסיות העמומות והבהירות ביותר ייפלו בטווח הליניארי של המכשיר. לאחר מכן, לרכוש דגימות פיצוי, לחשב פיצוי, ולהחיל את מטריצת הפיצוי לניסוי. השג ושמור לפחות 20,000 תקני MESF כוללים עבור כל ערוץ כימות.

הימנע משימוש בנוזל נדן FACS או דומה לחרוזי MESF resuspend, שכן אלה מכילים מלחים ואלכוהול שישמידו את הפלואורוכרומים, מה שיוביל לפסגות פלואורסצנטיות רחבות יותר וטעות גבוהה. לרכישה באמצעות דוגמים בעלי תפוקה גבוהה, הגדר רכישת מכשירים לסטנדרט, הגדר רכישה לדוגמה ל- 80 מיקרוליטרים. קצב זרימה לדוגמה בין שניים לשלושה מיקרוליטרים לשנייה, נפח ערבוב מדגם ב-50 מיקרוליטרים, ערבוב מדגם של 150 מיקרוליטר לשנייה וערבוב לבאר בין שלוש לחמש.

להשיג מינימום של 10, 000 BSLBs בודדים לכל מדגם. לבסוף, יצא את קבצי FCS. דוגמה למדידות ציטומטריית זרימה כמותית של ICAM-1 על פני השטח של תאי שקדים B ותאי T עוזר מוצגת כאן.

התמונות הייצוגיות מתארות את אסטרטגיית ההצטברות לניתוח תאי CXCR5 B בודדים ותאי T מסייעי זקיקים המבודדים משקדים של פלטין אנושיים. אסטרטגיית גיור רציפה זו מזהה אירועים חיים בודדים בחלון הרכישה הרציף. הכפילים, ביטוי פני התא של ICAM-1 בהשוואה לבקרות FMO ובקרות FMO המסומנות באיזוטיפים רלוונטיים של האוכלוסיות, מוצגים כאן.

Gating ומדידה של MFIs מאוכלוסיות MESF סטנדרטיות שונות בהיסטוגרמה המכסה של אוכלוסיות MESF מוצגים כאן. הערכים מייצגים את ממשקי ה- MF עבור כל אחת מחמש אוכלוסיות MESF. רגרסיה ליניארית של MESF מעל cMFI עבור אוכלוסיות MESF מוצגים כאן.

השיפוע מחלץ MESF קשור לתאים מנתוני FCM של ICAM-1 על פני השטח של תאי B שקדים ב- TFH. ההמרה לצפיפות מולקולרית מוחלטת באה בעקבות פעולות מתמטיות פשוטות אלה. התמונות הייצוגיות מראות את ניתוח ציטומטריית הזרימה של BSLBs שהוחזר עם צפיפות מוגברת של היסטידינים ICAM-1 12 מונומריים רקומביננטיים.

ניתוחי רגרסיה של ריכוז ייחוס ICAM-1 על פני צפיפות נמדדת מוצגים כאן. השיפוע משמש לחישוב ריכוזי היעד של חלבון כדי להשיג את צפיפות התאים. דיאגרמות הזרימה מציגות את השלבים הקריטיים לשיתוף תאי T עם BSLBs, ומשחזרות את קרומי המודל במדידה הבאה של העברת חלקיקים עם ציטומטריית זרימה.

אסטרטגיית ההרחבה לזיהוי BSLBs ותאים בודדים בחלון הרכישה הרציף מוצגת כאן. אחד ההיבטים החשובים ביותר של פרוטוקול זה הוא, כדי לשמור על רבייה של התוצאות, בכל פעם שאתה משנה מלאי חלבון או שומנים בדם, אתה צריך לבצע ניתוח כיול חדש. כדי לגלות מולקולות יעילות חדשות המופרשות על ידי תת-קבוצות שונות של תאי T, ניתן לבודד עוד יותר BSLBs על ידי מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות כפי שהם נתונים לניתוח תמלול ופרוטאומי.

עמיתינו באוניברסיטת אוקספורד השתמשו בטכנולוגיה זו כדי לחקור ולהדגים אינטראקציות קולטן-ליגנד חדשות, וגם כדי לחקור את ההשפעות של אבלציות גנטיות על הפלט של הסינפסה החיסונית של תאי T.