Name: דפוס של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימים רציפים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: למדו ליצור דפוסים מוגדרים של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימים רציפים במערכות מיקרו-זורמיות. שיטה זו מאפשרת מעקב ארוך טווח בפיזיולוגיה ובאינטראקציות של חיידקים וחלקיקים קולואידליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים בתמיכת מענק הפרימה של SNSF 179834 (ל- E.S.), מענק מחקר ETH-15 15 17-1 (R. S.), ופרס החוקר של קרן גורדון ובטי מור על סימביוזה מיקרוביאלית מימית (מענק GBMF9197) (R. S.). המחברים מודים לד"ר מיגל אנג'ל פרננדז-רודריגז (אוניברסיטת גרנדה, ספרד) על הדמיית SEM של חיידקים ועל הדיונים התובנות. המחברים מודים לד"ר ג'ן נגוין (אוניברסיטת קולומביה הבריטית, קנדה), ד"ר לורה אלוורז (ETH ציריך, שווייץ), קמרון בוגון (ETH ציריך, שווייץ) וד"ר פאביו גרילו על הדיונים התובנות.

1. הכנה מאסטר סיליקון
הערה: תבניות ה- PDMS הנושאות את המלכודות המיקרו-פבריקטיות היוצרות את התבנית עבור דפוס קולואידי ומיקרוביאלי מפוברקות מפוברקות בהתאם לשיטה שהוצגה על ידי Geissler et al. 17. מאסטר הסיליקון הוכן על ידי ליטוגרפיה קונבנציונלית בחדר נקי. עיין בשלבים הבאים עבור ההליך וטבלת החומרים לקבלת הציוד.
<ol><li>עצב את התכונות באמצעות תוכנת עיצוב בעזרת מחשב (CAD).</li>
	<li>הכינו את מסכת הכרום-זכוכית עם שכבה של פוטורזיסט חיובי על ידי חשיפת התכונות המעוצבות עם סופר לייזר ישיר UV.<ol>
<li>פתח את מסכת הכרום-זכוכית עם מפתח ספין באמצעות מפתח ביחס של 1:4 פוטורזיסט למים עבור 15 שניות.</li>
		<li>לטבול את המסכה בתחריט כרום במשך 50 שניות.</li>
		<li>פלזמה לטפל רקיק סיליקון 10 ס"מ במשך 3 דקות ב 600 W.</li>
		<li>מאדים-להפקיד שכבה של hexamethyldisilizane ולאפות ב 110 °C (50 °F) כדי לשפר את ההידבקות כלפי photoresist.</li>
		<li>להפקיד שכבה של photoresist ב 4,500 × גרם במשך 2 דקות.</li>
		<li>לחשוף את התכונה UV דרך מסכת זכוכית כרום עם קשתית מסכה עבור 2 s ולהתפתח עם מפתח באשר למסכה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי להשלים את הייצור של מאסטר סיליקון, לחרוט את הוופל באמצעות חילופי יונים תגובתי עמוק, התאמת זמן החריטה (<2 דקות) כדי להשיג את העומק הרצוי (נמדד עם פרופילומטר).</li>
</ol>2. הכנת עובש מיקרו-ערוצי
<ol><li>עצב את הערוץ באמצעות תוכנת CAD וחתוך אותו עם תוכנת כלי פריסה כדי להמיר את הדגם המעוצב להוראות עבור המדפסת התלת-ממדית, תוך הגדרת מרחק החיתוך ב- 0.05 מ"מ.</li>
	<li>הדפס את הערוץ עם מדפסת תלת-ממד למשך ~ 1 שעות.</li>
	<li>יש לשטוף ולהכניס את התבנית למכונת ריפוי ושטיפה ייעודית.<ol>
<li>שים את התבנית במיכל מלא אלכוהול איזופרופיל טהור (IPA) מערבולת הנוזל (לשטוף במשך 20 דקות). קח את המיכל מלא IPA מתוך המכונה.</li>
		<li>לאחר הסרת התבנית השטופה ממיכל ה- IPA, החזירו אותה למכונת הכביסה והריפוי ושחררו אותה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס. הערה: טבלת החומרים מדווחת על מדפסת התלת-ממד ועל מכונת הריפוי והשטיפה המשמשת בפרוטוקול הכנת העובש. דגם התלת-ממד נחתך עם תוכנת הפריסה הקניינית של מדפסת התלת-ממד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מניחים את ההדפס בתנור UV במשך 12 שעות ומניחים אותו בתנור ב 80 °C (80 °F) במשך 12 שעות. הערה: שלב זה מבטיח שכל הפולימר נרפא וכל הפולימרים הלא מאושרים יוסרו מהדפוס מכיוון שהוא ימנע מ- PDMS לרפא.</li>
	<li>סיילנו את התבנית באמצעות תצהיר אדים של טריכלורו (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) סילאן.<ol>
<li>מניחים את התבנית התלת-ממדית במייבש ואקום יחד עם 20 μL של 100% Trichloro מרוכז (1H, 1H, 2H, 2H, 2H-perfluorooctyl) סילאן צנרת על רדיד אלומיניום להציב קרוב לתבנית.</li>
		<li>צור ואקום במייבש כדי ליצור אדים ולהשאיר במשך 40 דקות.</li>
		<li>מוציאים את התבנית מהמייבש ושטפו אותה באתנול טהור לפני ששופכים עליה PDMS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ייצור השבב המיקרופלואידי
<ol><li>הכן תערובת PDMS על ידי ערבוב האלסטומר עם סוכן crosslinking שלה (טבלת חומרים). מערבבים את התערובת במרץ כדי למזג את שני הרכיבים באופן אחיד עד שנוצרות בועות אוויר, ותערובת ה-PDMS נראית אטומה. הערה: כמות המקשר הצולב צריכה להיות 10% לפי משקל של כמות האלסטומר.</li>
	<li>Degas התערובת של אלסטומר וסוכן crosslinking בייבוש ואקום כדי להסיר את בועות האוויר הלכודות. מעבירים את התערובת במייבש למיכל המשמש לערבוב (שלב 3.1). ממשיכים בתהליך הסרת הגז עד שכל הבועות יוסרו והתערובת תיראה שקופה שוב. הערה: הזמן הנדרש בדרך כלל לייבוש הוא 30 דקות.</li>
	<li>יוצקים 3 גרם של התערובת על מאסטר הסיליקון כדי לייצר את התבנית, אשר ישמש "הרצפה" של שבב microfluidic. הערה: ניתן לכוונן את עובי שכבת ה-PDMS על-ידי שינוי כמות התערובת שנשפכה על תבנית הבסיס לסיליקון.<ol>
<li>כדי לקבל תבנית בעובי 400 מיקרומטר, יש לשפוך 3 גרם של PDMS על מאסטר הסיליקון, להניח את מאסטר הסיליקון על מעיל ספין, ולסובב את המעיל ב 21 × גרם עבור 5 s ו 54 × g עבור 10 s, ולאחר מכן degas שוב כמתואר בשלב 3.2 כדי להסיר בועות אוויר לכודות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יוצקים 20 גרם מתערובת ה-PDMS על התבנית המודפסת בתלת-ממד כדי ליצור את המיקרו-ערוצים, שישמשו כ"גג" של השבב המיקרופלואידי, ומפרקים אותו כמתואר בשלב 3.2 למשך 30 דקות.</li>
	<li>אופים גם את רקיק הסיליקון וגם את התבנית המודפסת בתלת-ממד בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפחות.</li>
	<li>מקלפים את שכבת ה-PDMS מהתבנית המודפסת התלת-ממדית, חותכים את ה-PDMS עם להב סביב המיקרו-צ'אנלים ומנקבים את החורים שישמשו ככניסה ושקע של הערוץ המיקרופלואידי.</li>
	<li>מקלפים את ה-PDMS מתבנית הבסיס לסיליקון וחותכים את שכבת ה-PDMS לחתיכות קטנות יותר עם אותם ממדים של הערוצים המיקרופלוידיים שיודבקו על גבי התבניות.</li>
	<li>לשפשף בעדינות את התבניות microchannels באמצעות פתרון דטרגנט 1% (ראה את טבלת החומרים) במשך 5 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים deionized. לאחר מכן, לשטוף את התבניות microchannels עם איזופרופנול ולשטוף אותם עם מים deionized. יבש את התבניות ואת microchannels בטמפרטורת החדר במשך 1 דקות עם אוויר דחוס ב 1 בר.</li>
	<li>מקם את התבניות ואת microchannels בניקוי פלזמה עם המשטחים להיות מלוכדים עם הפנים כלפי מעלה. הפעל את מנקה הפלזמה, ופלזמה לטפל בתבניות ואת microchannels עבור 40 s. הוציאו אותם ממנקה הפלזמה ומיד קשרו את המיקרו-צ'אנלים על גבי התבניות על ידי יצירת קשר זה עם זה.</li>
	<li>יש לאחסן את השבבים המיקרופלואידיים בתנור בטמפרטורה של 70°C למשך חמישה ימים כדי להבטיח התאוששות הידרופובית של PDMS ולזכות בזווית מגע נסוגה בטווח האופטימלי, בין 30 ל-60°10,111.</li>
</ol>4. דפוסים חיידקיים
<ol><li>יום אחד לפני הניסוי, לגדל אוכלוסייה של קולי Escherichia (זן MG1655 prpsM-GFP). לחסן את התרבות ישירות מן המלאי הקפוא ולגדול בן לילה במשך 20 שעות מרק ליסוגניות (LB) בינוני בחממה שייקר ב 37 °C (50 °F). הוסף 50 מיקרוגרם / מ"ל של kanamycin עבור התאים כדי לשמור על plasmid prpsM-GFP.</li>
	<li>ביום הניסוי, הגדר את חממת התיבה (איור 2A) ב-37 °C (37 °C) מספר שעות לפני הניסוי כדי לקבל טמפרטורה אחידה ויציבה לפני תחילת הניסוי. הקימו את משאבת המזרק ואת צלחת הזכוכית המחוממת על במת המיקרוסקופ (איור 2B,C), וקבעו את הטמפרטורה באותה טמפרטורה כמו האינקובטור של התיבה. הערה: חממת התיבה שבה מוקפת המערכת כולה, כולל המיקרוסקופ (איור 2E), מבטיחה שטמפרטורה אחידה וקבועה תישמר לאורך כל הניסוי כאשר הערוץ סומק בינוני.</li>
	<li>תשעים דקות לפני הניסוי, לשים את השבב microfluidic בכלי מלא 100% אתנול (EtOH) ולשטוף את הערוץ עם 100% EtOH לפחות 10 דקות. מניחים את השבב המיקרופלואידי במייבש ואקום ודגה למשך 30 דקות לפחות. החליפו את ה- EtOH במים מזוקקים וטיפלו בוואקום בשבב למשך 30 דקות לפחות. שים את שבב microfluidic בתנור ב 70 °C (80 °F) במשך 10 דקות כדי להסיר את כל עקבות של נוזל שנותרו בערוץ. הערה: שלב זה נחוץ כדי למנוע היווצרות בועות בערוץ כאשר הוא מרוקן עם מדיום תרבות. פרוטוקול מניעת בועות זה הותאם מוונג ואח ' 18.</li>
	<li>פיפטה 1 מ"ל של 3-(N-morpholino)חומצה פרופנסולפית (MOPS) בינוני (1x) לתוך בקבוקון צנטריפוגה ולהוסיף 10 μL של 0.132 M אשלגן פוספט (K2HPO4). קח את תרבות הלילה מתוך החממה 37 °C (37 °F) ו aliquot 100 μL לתוך בקבוקון צנטריפוגות וצנטריפוגה התרבות ב 2,300 × גרם במשך 2 דקות. פיפטה בעדינות את supernatant מתוך בקבוקוני צנטריפוגה, ו resuspened את הכדור ב 1 מ"ל של מדיום MOPS טרי עם 0.015% v / v של Tween 20 ו 0.01% v / v של אשלגן פוספט. הערה: הריכוז האופייני של ההשעיה החיידקית הוא בטווח של 0.015-0.15 vol%, אשר מבטיח היווצרות של אזור הצטברות מורחב ונייד ומונע הצטברות של חלקיקים על המצע. החלפת המדיום הלילי במדיום טרי ממזערת את הסיכונים של שחרור סרטים של חיידקים בתבנית. היעדר מקור פחמן במדיום הטרי מונע מהתאים לגדול בהשעיה במהלך תבנית תבנית. ריכוז של 0.015% v/v של Tween 20 במתלה נחוץ לזווית המגע של הנוזל הנסוג בתבנית PDMS כדי ליפול בטווח האופטימלי, בין 30 ל 60°.</li>
	<li>טען את ההשעיה החיידקית במזרק 1 מ"ל ולחבר את המזרק לשבב באמצעות צינורות microfluidic.<ol>
<li>כדי לאבטח את החיבור בין המזרק לבין הצינורות, הכנס ישירות מחט בקוטר חיצוני של 0.6 מ"מ לתוך הצינורות. כדי להימנע מפיזור כל מתלה שנותר בסביבה הנכנסת שמעבר לתעלה, יש לשטוף את המדיום הטרי דרך החור המשמש כשקע במהלך תהליך התבנית (איור 3A.III), במקום החור המשמש ככניסה.</li>
		<li>הר את המזרק על משאבת המזרק והזריק את המתלה לשבב המיקרופלואידי דרך הכניסה הממוקמת בחלק במעלה הזרם של הערוץ עד שהמתלה מכסה את אזור התבנית במלכודות. הערה: במהלך תהליך ההזרקה הנוזלית, האוויר יכול לברוח דרך שקע הממוקם בקצה במורד הזרם של הערוץ.</li>
		<li>הגדר את משאבת המזרק כדי למשוך את ההשעיה החיידקית (איור 3A-I) בקצב זרימה של 0.07-0.2 μL / min, אשר בגיאומטריה המתוארת תואמת למהירות נסיגת מניסקוס של 80-100 מיקרומטר / דקה.</li>
		<li>נטר את תהליך התבנית באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. הערה: כאן, הגדלה של פי 10 שימשה לניטור המניסקוס הנסוג בתבנית, והגדלה של פי 20 שימשה לניטור התצהיר של חיידקים בודדים לתוך המלכודות המיקרו-פבריות.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר שהתבנית עוצבה עם תאים (איור 3A-II), הגדל את קצב זרימת המשיכה כדי לרוקן במהירות את הערוץ המיקרופלואידי ולשטוף אותו עם LB טרי שבעבר הוסר למשך 30 דקות לפחות ונחרם מראש ב-30 °C (30 °F).</li>
	<li>הגדר את משאבת המזרק בקצב זרימה של 2 μL / min כדי לשטוף בעדינות את הערוץ. לאחר הערוץ כבר מלא, להגדיל את קצב הזרימה (15 μL / min) על פי הצרכים הניסיוניים הספציפיים.</li>
	<li>לרכוש תמונות של חיידקים גדלים בהגדלה הרצויה ומרווח הזמן.</li>
</ol>5. דפוס קולואידי
<ol><li>פיפטה 900 μL של 0.015% v / v Tween 20 פתרון מימי לתוך בקבוקון צנטריפוגה ו pipette 100 μL של ההשעיה הקולואידית המקורית לתוכו. צנטריפוגה ההשעיה ב 13,500 × g במשך 1 דקות. הסר בעדינות את supernatant ולהחליף אותו עם Tween מימית 20 (0.015% v / v) פתרון. חזור על תהליך זה שלוש פעמים כדי להבטיח החלפה מלאה של הממס של הספק מהשעיית המלאי.</li>
	<li>טען את ההשעיה הקולואידית במזרק 1 מ"ל וחבר את המזרק לשבב באמצעות צינורות מיקרופלואידיים. הזרקו את ההשעיה לשבב המיקרופלואידי דרך הכניסה הממוקמת בתוך החלק המרכזי, בחלק במעלה הזרם של הערוץ, ולדחוף בהדרגה את המתלה עד שהתבנית תכוסה.</li>
	<li>למשוך את ההשעיה הקולואידית בקצב זרימה של 0.07-0.2 μL / min, אשר מתאים למהירות נסיגת מניסקוס של 1-2 מיקרומטר / דקה, ולדמיין את תהליך התבנית באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. השתמש בהגדלה של פי 10 כדי לפקח על המניסקוס הנסוג בתבנית ובהגדלה של פי 20 כדי לצפות בתצהיר של חלקיקים בודדים לתוך המלכודות המיקרו-פבריקטיות. הגדל את קצב הזרימה ברגע שהמניסקוס מגיע לסוף התבנית כדי לרוקן את הערוץ במהירות. הערה: מערכים קולואידיים המורכבים ממספר חלקיקים יכולים להיות מיוצרים על-ידי הפעלת תהליך התבנית משלבים 5.1 עד 5.3 בסדרה. הערוץ טעון עם מתלה קולואידי חדש בכל איטרציה על פי הרכב מערכי הקולואידים הרצויים. כל שלב דפוס מוסיף חלקיק אחד למערך הקולואידי וניתן להפעילו ברצף עד שהמלכודות יתמלאו ברצף החלקיקים הרצוי. הרכב המערכים הקולואידיים המתקבלים ניתן אך ורק על ידי רצף ההשעיות הקולואידיות המשמשות למילוי המלכודות (איור 3B).</li>
</ol>

<ol><li>Choi, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+bacteria+microarray+using+selective+patterning+of+polyelectrolyte+multilayer+and+poly%28ethylene+glycol%29-poly%28lactide%29+deblock+copolymer%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Research%22%5BJournal%5D)">Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer.</a> Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).</li>
<li>Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+toward+phytoplankton+drives+organic+matter+partitioning+among+marine+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).</li>
<li>Thomas, C. M., Nielsen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of%2C+and+barriers+to%2C+horizontal+gene+transfer+between+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).</li>
<li>Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Immobilization+and+patterning+of+live+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells.</a> Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).</li>
<li>Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-specific+functional+studies+in+a+microfluidic+array+of+primary+mammalian+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes.</a> Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).</li>
<li>Akselrod, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-guided+assembly+of+heterotypic+three-dimensional+living+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays.</a> Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).</li>
<li>Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+properties+of+dead+or+alive+single-patterned+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria.</a> Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).</li>
<li>Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+assembly+of+bacteria+on+chemical+patterns+using+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces%3A+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography.</a> Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).</li>
<li>Rozhok, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+motile+bacterial+cells+to+prealigned+holed+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays.</a> Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+printing+of+living+bacteria+arrays+with+cellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution.</a> Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).</li>
<li>Ingham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+micro-Petri+dish%2C+a+million-well+growth+chip+for+the+culture+and+high-throughput+screening+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).</li>
<li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-cell+chemostat%3A+an+agarose-based%2C+microfluidic+device+for+high-throughput%2C+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li>
<li>Ni, S., Isa, L., Wolf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+assembly+as+a+tool+for+the+heterogeneous+integration+of+micro-+and+nanoscale+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects.</a> Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).</li>
<li>Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+colloidal+molecules+from+sequential+capillarity-assisted+particle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly.</a> Science Advances. 2 (4), 1501779(2016).</li>
<li>Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+Insights+into+mechanisms+of+capillary+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly.</a> Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).</li>
<li>Pioli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+capillarity-assisted+particle+assembly+in+a+microfluidic+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel.</a> Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).</li>
<li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+metal+nanowires+using+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Fabrication of metal nanowires using microcontact printing.</a> Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+prevention+of+bubble+formation+and+accumulation+for+long-term+culture+of+pancreatic+islet+cells+in+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device.</a> Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).</li>
<li>Crowley, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell+death+by+propidium+iodide+uptake+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

הפלטפורמה המיקרופלואידית המתוארת כאן מאפשרת דפוס של עצמים בגודל מיקרו, כגון קולואידים וחיידקים, לסידורים מרחביים שנקבעו על מצע PDMS. השליטה המלאה על התנאים הסביבתיים המוצעים על ידי מיקרופלואידיקה והיכולת לעצב תאים עם דיוק מיקרומטרי המוענק על ידי טכנולוגיית sCAPA הופכת אותו לפלטפורמה מבטיחה מאוד למחקרי פיזיולוגיה ואקולוגיה עתידיים.
בניסויים שהוצגו בעבודה זו, מאסטר הסיליקון מומש באמצעות photoresist שדווח בטבלת החומרים. עם זאת, ניתן להשתמש בכל פוטורזיסט המתאים להפקת תכונות בטווח ...

דפוס מרחבי של מיקרואורגניזמים בודדים, במיוחד בתוך זירות ניסיוניות המאפשרות שליטה מלאה על תנאים סביבתיים, כגון מכשירים מיקרופלואידיים, רצוי מאוד במגוון רחב של הקשרים. לדוגמה, סידור מיקרואורגניזמים למערכים קבועים יאפשר הדמיה מדויקת של מספר רב של תאים בודדים וחקר צמיחתם, פיזיולוגיה, ביטוי גנים בתגובה לגירויים סביבתיים ורגישות לתרופות. זה גם יאפשר ללמוד אינטראקציות תא-תאים של עניין מיוחד במחקר לתוך תקשורת סלולרית (למשל, חישת מניין), האכלה צולבת (למשל, סימביוזה אצות-חיידקיות), או אנטגוניזם (למשל, אלופתיה), עם שליטה מלאה על לוקליזציה מרחבית של תאים ביחס זה לזה. מחקרי פיזיולוגיה ואבולוציה של תאים1, מחקרי אינטראקציה בין תאים2, סינון בידול פנוטיפי3, ניטור סביבתי4 והסרת סמים5 הם בין התחומים שיכולים להפיק תועלת רבה מטכנולוגיה המסוגלת להשיג ניתוח כמותי כזה של תא בודד.
מספר אסטרטגיות לבודד ולטפל בתאים בודדים הוצעו בשנים האחרונות, החל ממלכודות אופטיות הולוגרפיות6 ושיטות פונקציונליזציה של פני השטח הטרוגניים7,8,9,10 ועד כימותרפיה חד-תאית11 ומיקרופלואידיקה טיפתית12. שיטות אלה הן תובעניות מאוד מבחינה טכנית או משפיעות על פיזיולוגיית התא ואינן מספקות פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה למיקרואורגניזמי דפוס שניתן ללמוד לאורך תקופות ארוכות, מה שמבטיח רזולוציה של תא יחיד, גישה אופטית מלאה ושליטה על התנאים הסביבתיים. מטרת מאמר זה היא לתאר פלטפורמה לתבנית חיידקים עם דיוק מיקרומטרי לסידורים מרחביים שנקבעו על משטח PDMS באמצעות הרכבה בסיוע נימים. פלטפורמה זו מאפשרת דפוס מרחבי מדויק וגמיש של חיידקים ומאפשרת גישה אופטית מלאה ושליטה על התנאים הסביבתיים, הודות לאופי המיקרופלואידי שלה.
הטכנולוגיה שמאחורי פלטפורמה זו היא טכנולוגיית הרכבה שפותחה בשנים האחרונות, בשם sCAPA13,14,15 (הרכבת חלקיקים בסיוע נימים רציפים) ששולבה בפלטפורמה מיקרופלואידית16. המניסקוס של טיפת נוזל מתאדה, בעודו נסוג מעל מצע פולידימתילסילוקסן (PDMS) בדוגמת פולידימתילסילוקסן (PDMS) בתוך ערוץ מיקרופלואידי, מפעיל כוחות נימיים הלוכדים את החלקיקים הקולואידיים הבודדים התלויים בנוזל לתוך בארות מיקרומטריות המיקרו-פבריות על המצע (איור 1A). חלקיקים מושעים מועברים תחילה לממשק נוזל האוויר על ידי זרמים קונבנציונליים ולאחר מכן ממוקמים לתוך המלכודות על ידי נימים. כוחות נימיים המופעלים על ידי פעולת המניסקוס הנע בקנה מידה גדול יותר בהשוואה לכוחות המעורבים באינטראקציות חלקיקים.
לפיכך, מנגנון ההרכבה אינו מושפע מהחומר, הממדים ומאפייני השטח של החלקיקים. פרמטרים כגון ריכוז חלקיקים, מהירות המניסקוס, הטמפרטורה ומתח פני השטח של ההשעיה הם הפרמטרים היחידים המשפיעים על התשואה של תהליך הדפוס. הקורא יכול למצוא תיאור מפורט של ההשפעה של הפרמטרים הנ"ל על תהליך הדפוס ב13,14,15. בטכנולוגיית sCAPA המקורית13,14,15, תהליך התבנית הקולואידית בוצע במערכת פתוחה ודרש שלב פיזואלקטרי ברמת דיוק גבוהה כדי להניע את המתלה על פני התבנית. פלטפורמה זו מנצלת אסטרטגיה שונה ומאפשרת לדפוס להתבצע עם ציוד סטנדרטי המשמש בדרך כלל במיקרופלואידיקה בסביבה מבוקרת, ובכך ממזערת את הסיכונים של זיהום הדגימות.
פלטפורמה מיקרופלואידית זו עברה אופטימיזציה תחילה על חלקיקים קולואידיים כדי ליצור מערכים קבועים של חלקיקים אינרטיים ולאחר מכן הוחלה בהצלחה על חיידקים. שתי הפלטפורמות המיקרופלואידיות מתוארות במאמר זה (איור 1B, C). רוב שלבי ההכנה והציוד הניסיוני המתואר בפרוטוקול נפוצים בשני היישומים (איור 2). אנו מדווחים על דפוס קולואידי כדי להדגים שניתן להשתמש בטכניקה לביצוע תצהירים רציפים מרובים על אותו משטח כדי ליצור דפוסים מורכבים ורב-חומריים. בפרט, חלקיק אחד בודד הופקד לכל מלכודת עבור כל שלב כדי ליצור מערכים קולואידיים עם גיאומטריה וקומפוזיציה ספציפיים, המוכתבים אך ורק על ידי הגיאומטריה ורצף המילוי של המלכודות. באשר לעיצוב חיידקי, תצהירים בודדים מתוארים, וכתוצאה מכך חיידק אחד מופקד לכל מלכודת. ברגע שתאים מעוצבים על פני השטח, הערוץ המיקרופלואידי נשטף במדיום כדי לקדם את צמיחת החיידקים, השלב הראשוני של כל מחקר של תא בודד.

<table><tbody><tr><td>Alcatel AMS 200SE I-Speeder</td><td>Alcatel Micro Machining System</td><td></td><td>מערכת חילופי יונים תגובתיות עמוקה חומר</td></tr><tr><td>ניקוי</td><td>Alconox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ400K מפתח</td><td>MicroChemicals</td><td>AZ400K</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 מ"ל מזרק (Luer-Lock)</td> <td>BD</td><td>300912</td><td>המשמש לשטיפת מרק ליזוגני טרי לתעלה המיקרופלואידית</td></tr> Box <tr><td>Incubator</td><td>Life שירותי</td><td></td> הדמיה <td>המשמשים להבטחת טמפרטורה אחידה וקבועה בתעלה</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>המשמשת להחלפת מדיית הלילה במדיה מינימלית טרייה</td></tr><tr><td>בקבוקון צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>CETONI Base 120</td><td>CETONI GmbH</td><td></td><td>משאבת מזרק</td></tr> חלקיקי <tr><td>PS פלואורסצנטיים בקוטר 0.98 ומיקרו; m (אדום)</td> <td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoRed-Fi267</td><td></td></tr><tr><td>חלקיקי PS פלואורסצנטיים בקוטר 1.08 ומיקרו; m (ירוק)</td> <td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoGreen-Fi182</td><td></td></tr><tr><td>חלקיקי PS פלואורסצנטיים בקוטר 2.07 ומיקרו; m (ירוק)</td> <td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoGreen-Fi183</td><td></td></tr><tr><td>חלקיקי PS פלואורסצנטיים בקוטר 2.08 ומיקרו; m (אדום)</td> <td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoRed-Fi180</td><td></td></tr><tr><td>Gigabatch 310 M</td><td>PVA TePla</td><td></td><td>המשמש לטיפול בפלזמה פרוסת סיליקון 10 ס"מ</td></tr><tr><td>H401-T-CONTROLLER</td> בקר <td>Okolab</td><td></td><td>של צלחת הזכוכית המחוממת</td></tr><tr><td>H601-NIKON-TS2R-GLASS</td><td>Okolab</td><td></td><td>צלחת זכוכית מחוממת</td></tr><tr><td>היידלברג DWL 2000</td><td>היידלברג מכשירים</td><td></td><td>לייזר ישיר UV </td></tr><tr><td>מזרקי אינסולין סופרים, U 100, עם מזרק Luer</td><td>Codan Medical ApS</td><td></td><td>CODA621640 1 מ"ל המשמש למשיכת התרחיף הנוזלי במהלך תהליך הדפוס</td></tr><tr><td>Klayout</td><td>Opensource</td><td></td><td>שימש לעיצוב התכונות על מרק LB מאסטר הסיליקון</td></tr><tr><td>, מילר (לוריא-ברטני)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>244610</td><td>מרק ליזוגני נשטף לתעלה המיקרופלואידית</td></tr><tr><td>Masterflex צינורות העברה</td><td>Masterflex</td><td>HV-06419-05</td><td>0.020 אינץ' ID, 0.06 אינץ' OD</td></tr><tr><td>MOPS (10x)</td> <td>Teknova</td><td>M2101</td><td>מדולל פי עשרה במים milliQ ומשמש להחלפת המיקרוסקופ הבינוני</td></tr><tr><td>של Nikon Eclipse Ti2</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>openSCAD</td><td>OpenCode</td><td></td><td>המשמש לעיצוב</td></tr><tr><td>התבנית קבוצת כספומט</td> <td>OPTIspin SB20</td><td>51-0002-01-00</td><td>מפתח ספין</td></tr><tr><td>תא פלזמה Zepto</td><td>Diener אלקטרוני</td><td>ZEPTO-1</td><td>המשמש לטיפול בפלזמה בתבנית ובמיקרו-ערוץ כדי לחבר אותם</td></tr><tr><td>פוטו-רזיסט חיובי AZ1505</td><td>MicroChemicals</td><td>AZ1505</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td>נוסף ל-MOPS 1x</td></tr><tr><td>מכונת ריפוי וכביסה Prusa CW1S</td><td>Prusa</td><td></td><td>משמש כדי להבטיח שכל הפולימר נרפא ופולימר לא נרפא מוסר מהתבנית</td></tr><tr><td>שרף פרוסה - מחקר פרוסה קשוח</td><td>א.ס.</td><td></td><td>שרף נוזלי רגיש לאור UV 405nm להדפסת תלת מימד</td></tr> מדפסת <tr><td>תלת מימד Prusa SL1</td><td>Prusa</td><td></td><td>המשמשת להדפסת התבנית</td></tr><tr><td>Scale</td><td>VWR-CH</td><td>611-2605</td><td>משמש לשקילת תערובת PDMS</td></tr><tr><td>פרוסת סיליקון (10 ס"מ)</td> <td>Silicon Materials Inc.</td><td></td><td>N/Phos < 100> 1-10 ואומגה; ס"מ</td></tr><tr><td>S&uuml; ss MA6 מיישר מסכות</td><td>SUSS MicroTec Group</td><td></td><td>משמש ליישור מסכת הכרום-זכוכית והמצע, ולחשוף את המצע</td></tr><tr><td>ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td>; חומר ריפוי</tr><tr><td>Techni Etch Cr01</td><td>Technic</td><td></td><td>כרום תחריט</td></tr><tr><td>טריכלורו (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) סילאן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>448931 משמש לסיליאניזציה של התבנית המודפסת בתלת מימד</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>משמש להבטחת זווית מגע נסיגה אופטימלית במהלך תהליך הדפוס</td></tr><tr><td>Veeco Dektak 6 M</td><td>Veeco</td><td></td><td>פרופילומטר</td></tr><tr><td>VTC-100 ציפוי ספין ואקום</td><td>MTI תאגיד</td><td></td><td>ציפוי ספין ואקום</td></tr></tbody></table>

דפוס של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימים רציפים

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

דפוס מבוקר של מיקרואורגניזמים לסידורים מרחביים מוגדרים מציע אפשרויות ייחודיות למגוון רחב של יישומים ביולוגיים, כולל מחקרים של פיזיולוגיה מיקרוביאלית ואינטראקציות. ברמה הפשוטה ביותר, דפוס מרחבי מדויק של מיקרואורגניזמים יאפשר הדמיה אמינה וארוכת טווח של מספר גדול של תאים בודדים וישנה את היכולת לחקור באופן כמותי אינטראקציות מיקרואורגניזמים תלויות מרחק. באופן ייחודי יותר, צימוד דפוס מרחבי מדויק ושליטה מלאה על התנאים הסביבתיים, כפי שמוצע על ידי טכנולוגיה מיקרופלואידית, יספק פלטפורמה רבת עוצמה ורב-תכליתית למחקרים של תאים חד-תאיים באקולוגיה מיקרוביאלית. 
מאמר זה מציג פלטפורמה מיקרופלואידית לייצור דפוסים רב-תכליתיים ומוגדרים על-ידי המשתמש של מיקרואורגניזמים בתוך ערוץ מיקרופלואידי, המאפשרים גישה אופטית מלאה לניטור ארוך טווח בעל תפוקה גבוהה. טכנולוגיה מיקרופלואידית חדשה זו מבוססת על הרכבת חלקיקים בסיוע נימים ומנצלת את כוחות הנימים הנובעים מהתנועה המבוקרת של השעיה מתאדה בתוך ערוץ מיקרופלואידי להפקדת עצמים מיקרו-זעירים בודדים במערך של מלכודות שעברו מיקרו-פבריקאט על מצע פולידימתילסילוקסן (PDMS). תצהירים רציפים יוצרים את הפריסה המרחבית הרצויה של סוגים בודדים או מרובים של אובייקטים בגודל מיקרו, המוכתבים אך ורק על ידי הגיאומטריה של המלכודות ורצף המילוי. 
הפלטפורמה כויל באמצעות חלקיקים קולואידיים מממדים וחומרים שונים: היא הוכיחה את עצמה ככלי רב עוצמה ליצירת דפוסים קולואידיים מגוונים ולבצע פונקציונליזציה של פני השטח של חלקיקים לכודים. יתר על כן, הפלטפורמה נבדקה על תאים מיקרוביאליים, באמצעות תאי קולי Escherichia כחיידק מודל. אלפי תאים בודדים עוצבו על פני השטח, וצמיחתם הייתה במעקב לאורך זמן. בפלטפורמה זו, צימוד של תצהיר חד-תאי וטכנולוגיה מיקרופלואידית מאפשר הן דפוס גיאומטרי של מיקרואורגניזמים והן שליטה מדויקת בתנאים הסביבתיים. כך הוא פותח צוהר לפיזיולוגיה של חיידקים בודדים ולאקולוגיה של אינטראקציות מיקרואורגניזמים, כפי שמוצג בניסויים ראשוניים.

פותחה פלטפורמה מיקרופלואידית המנצלת הרכבה בסיוע נימים כדי לעצב חלקיקים וחיידקים קולואידיים למלכודות שעברו מיקרו-פבריקט בתבנית PDMS. שתי גיאומטריות ערוץ שונות תוכננו כדי לייעל את התבנית של קולואידים וחיידקים באמצעות הרכבה בסיוע נימיות. הגיאומטריה של הערוץ הראשון (איור 1B) מורכבת משלושה חלקים מקבילים באורך 23 מ"מ ללא מחסום פיזי ביניהם. שני החלקים בצדדים הם ברוחב 5 מ"מ ובגובה 1 מ"מ, בעוד החלק המרכזי ברוחב 7 מ"מ ובגובה 500 מיקרומטר. עיצוב זה מסייע בשמירה על טיפה נעה מוגדרת היטב עם מניסקוס בצורת ...

אנו מציגים טכנולוגיה המשתמשת בהרכבה בסיוע נימי בפלטפורמה מיקרופלואידית כדי לעצב עצמים בגודל מיקרו המושעים בנוזל, כגון חיידקים וקוליואידים, למערכים שנקבעו על מצע פולידימתילסילוקסן.

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...

שיטה זו מאפשרת לייצר דפוסים מוגדרים על ידי המשתמש של מיקרואורגניזמים בתוך ערוץ מיקרופלואידי. לאחר דפוס, מיקרואורגניזמים ניתן לפקח כדי להעריך את הפיזיולוגיה ארוכת הטווח שלהם אינטראקציה עם תפוקה גבוהה. השימוש בכוחות נימיים מאפשר מסלול לא ספציפי לדפוסי דפוס, אשר ישים על פני סוגים שונים של חומרים.לדוגמה, חלקיקים קולואידיים וחיידקים. יתר על כן, הוא מאפשר לייצר מערכים גדולים עם שליטה מעולה של הסידור המרחבי של החומר מעניין. עד כה, בדקנו ויישמנו את השיטה על חלקיקים קולואידיים ותאי מיקרוביאלית.כתוצאה מכך, הוא יכול למצוא יישומים בהנדסת חומרים ותחומים הדורשים ניתוח כמותי של תא יחיד כמו הקרנת סמים. כדי להתחיל, להכין תערובת PDMS על ידי ערבוב elastomer עם סוכן cross-linking שלה. לאחר מכן מערבבים את התערובת במרץ כדי למזג את שני הרכיבים באופן אחיד עד שנוצרות בועות אוויר ותערובת PDMS נראית אטומה.עכשיו, degas את התערובת במייבש ואקום עד שכל בועות האוויר מוסרות והתערובת נראית שקופה שוב. כדי להשיג רצפת תבנית בעובי 400 מיקרומטר של השבב המיקרופלואידי, יוצקים שלושה גרם מהתערובת על מאסטר הסיליקון ומניחים את מאסטר הסיליקון על מעיל ספין כדי לסובב את המעיל ב 21 פעמים G במשך חמש שניות ו 54 פעמים G במשך 10 שניות. דגה שוב להסרת בועות האוויר הלכודות כפי שתואר קודם לכן.יוצקים 20 גרם של תערובת PDMS לתוך התבנית המודפסת 3D כדי להפוך את המיקרו-ערוצים אשר ישמש כגג של שבב microfluidic ו degas אותו במשך 30 דקות כפי שתואר קודם לכן. אופים את רקיק הסיליקון ואת התבנית המודפסת בתלת-ממד ב-70 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות, ואז חותכים את ה-PDMS לאורך קווי המתאר של התבנית המודפסת התלת-ממדית ומקלפים אותה. חותכים את ה- PDMS עם להב סביב המיקרוצ'אנלים ומנקבים את החורים שישמשו ככניסה ושקע של הערוץ המיקרופלואידי.עכשיו לחתוך את PDMS ולקלף אותו מאסטר סיליקון לחתוך את שכבת PDMS לחתיכות קטנות יותר עם אותם ממדים של ערוצי microfluidic כי יהיה מלוכד על גבי התבניות. יש לשפשף בעדינות את התבניות והמיקרו-צ'אנלים באמצעות תמיסת חומר ניקוי של 1% למשך חמש דקות ולאחר מכן לשטוף במים שעברו דה-יוניזציה. לאחר מכן, לשטוף את התבניות microchannels עם איזופרופנול, לפני שטיפה אותם עם מים deionized.עכשיו יבש את התבניות ואת microchannels בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת עם אוויר דחוס בבר אחד. מקם את התבניות ואת microchannels בניקוי פלזמה עם משטחי מליטה פונה כלפי מעלה. לאחר הפעלת מנקה הפלזמה, פלזמה לטפל בתבניות microchannels במשך 40 שניות, ולאחר מכן להוציא אותם מן מנקה הפלזמה ומיד לקשר את microchannels על גבי התבניות.יש לאחסן את השבבים המיקרופלואידיים בתנור בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים כדי להבטיח התאוששות הידרופובית של PDMS. ביום הניסוי, להגדיר את אינקובטור התיבה ב 37 מעלות צלזיוס כמה שעות לפני הניסוי, ולאחר מכן להגדיר את משאבת המזרק ואת צלחת הזכוכית המחוממת על במת המיקרוסקופ, קביעת אותה טמפרטורה כמו של אינקובטור התיבה. 90 דקות לפני הניסוי, לשים את שבב microfluidic בכלי מלא 100% אתנול ולשטוף את הערוץ עם 100% אתנול במשך 10 דקות לפחות, ולאחר מכן למקם את השבב microfluidic במייבש ואקום degas במשך 30 דקות לפחות.עכשיו להחליף את האתנול עם מים מזוקקים ואקום לטפל השבב במשך 30 דקות לפחות. שים את שבב microfluidic בתנור ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להסיר את כל עקבות של נוזל שנותר בתעלה. פיפטה מיליליטר אחד של MOPS בינוני לתוך בקבוקון צנטריפוגות ולהוסיף 10 מיקרוליטר של 0.132 טוחן אשלגן פוספט.Aliquot 100 מיקרוליטרים של תרבות הלילה לתוך בקבוקון צנטריפוגות וצנטריפוגות התרבות ב 2, 300 פעמים G במשך שתי דקות. להשליך בעדינות את supernatant כדי resuspend את הכדור במיליליטר אחד של מדיום MOPS טרי עם 0.015% של Tween 20 ו 0.01% של אשלגן פוספט לטעון את ההשעיה חיידקית במזרק מיליליטר אחד. כדי לאבטח את המזרק ואת חיבור הצינורות, הכנס ישירות מחט לתוך הצינורות.עכשיו להרכיב את המזרק על משאבת המזרק ולהזריק את ההשעיה לתוך שבב microfluidic דרך הכניסה הממוקמת בחלק במעלה הזרם של הערוץ עד ההשעיה מכסה את אזור התבנית עם מלכודות. הגדר את משאבת המזרק בקצב זרימה של 0.07 עד 0.2 מיקרוליטרים לדקה כדי למשוך את ההשעיה החיידקית ולנטר את תהליך הדפוס באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. לאחר שהתבנית עוצבה עם תאים, הגדל את קצב זרימת הנסיגה כדי לרוקן במהירות את הערוץ המיקרופלואידי ולשטוף אותו עם LB טרי שהיה בעבר degassed במשך לפחות 30 דקות ונחרם מראש ב 30 מעלות צלזיוס.כעת הגדר את משאבת המזרק בקצב זרימה של שני מיקרוליטרים לדקה כדי לשטוף בעדינות את הערוץ. לאחר מילוי הערוץ, הגדל שוב את קצב הזרימה. לרכוש תמונות של חיידקים גדלים בהגדלה הרצויה ומרווח הזמן.פיפטה 900 מיקרוליטרים של 0.015%Tween 20 פתרון מימי לתוך בקבוקון צנטריפוגות ולאחר מכן פיפטה 100 מיקרוליטרים של ההשעיה הקולואידית המקורית לתוכו. צנטריפוגה ההשעיה ב 13, 500 פעמים G במשך דקה אחת בעדינות להחליף את supernatant עם פתרון Tween 20 מימית. טען את ההשעיה הקולואידית במזרק מיליליטר אחד וחבר את המזרק לשבב באמצעות צינורות מיקרופלואידיים.הזרק את המתלה לתוך שבב microfluidic דרך הכניסה הממוקמת בתוך החלק המרכזי בחלק במעלה הזרם של הערוץ ולדחוף בהדרגה את המתלה עד התבנית מכוסה. הסר את ההשעיה הקולואידית בקצב זרימה של 0.07 עד 0.2 מיקרוליטרים לדקה ודמיין את תהליך התבנית באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. הגדל את קצב הזרימה ברגע שהמניסקוס מגיע לסוף התבנית במהירות.גיאומטריית הערוץ הישר נוצלה לתבנית תאים נייחים בשלבים של זן קולי Escherichia פלואורסצנטי הפקדת 83% מתוך 5, 000 מלכודות מנותחות. חיידקים בדוגמת חידשו את הצמיחה בזמנים שונים בתוך 1.5 שעות מרגע שהערוץ היה מלא ב- LB טרי. לאחר חידוש הצמיחה, תאי חיידקים בודדים החלו ליצור מושבות בודדות שהתרחבו עד שנוצרה שכבת שטח ורזולוציית התא הבודד אבדה. ניתוח שנערך מעל 55,000 מלכודות הראה כי דימרים ירוקים-אדומים שנעשו על ידי שני חלקיקים בקוטר מיקרומטר אחד נוצרו ב -93% ו -89% מהמלכודות המנותחות בהתאמה.וגוזמים ירוקים-אדומים-ירוקים נוצרו ב-52% מהמלכודות. המרחק בין חלקיקים בדוגמת יכול להיות נשלט במדויק על ידי ביצוע שני תצהירים בכיוונים מנוגדים, ובכך ללכוד חלקיקים כאלה בקצוות הנגדיים של כל מלכודת. חשוב להבטיח טמפרטורה אחידה על פני התבנית כדי למנוע עיבוי במהלך תהליך התבנית.לשם כך, אנו מניחים צלחת זכוכית מחוממת מתחת לתבנית ומגדירים אותה באותה טמפרטורה כמו אינקובטור הקופסה. שיטה זו יכולה לשמש במגוון מחקרים ביולוגיים הכוללים ניתוח כמותי של תא יחיד. יתרון ייחודי הוא כי טבע התפוקה הגבוהה שלה המאפשר דפוס של אלפי תאים המספקים סטטיסטיקה גדולה באותה זירה ניסיונית.

patterning-microorganisms-microparticles-through-sequential

Research

JoVE Journal

Engineering

הנדסה

מקור: Pioli, R., et al., דפוס של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימיות רציפה. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את השיטה של לכידת תאי Escherichia coli (E. coli) בודדים מתויגים פלואורסצנטית במלכודות מיקרופלואידיות באמצעות תרחיף נטול פחמן וזרימה מבוקרת, ואחריו תוספת חומרים מזינים כדי לעורר צמיחה והדמיה פלואורסצנטית של מיקרו-מושבות.

דפוס מיקרופלואידית ומעקב מבוסס פלואורסצנטי של צמיחת חיידקים חד-תאיים

פרוטוקול זה מתאר שיטת microfabrication התואם לדפוסי תא על SiO 2. עיצוב parylene-C מוגדר מראש מודפס photolithographically על SiO 2 הוופלים. תאים לאחר דגירה עם סרום (או פתרון הפעלה אחר) לדבוק במיוחד ל( ולגדול בהתאם להתאמה של) parylene-C שבבסיס, בעוד שנהדף על ידי SiO 2 אזורים.

תא דפוסים על photolithographically מוגדר Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; מצעים

bilayers שומנים נתמך וחלקיקי קרום טבעיים הם מערכות נוחים שיכול להתקרב למאפיינים של קרום תא ולהיות משולבות במגוון רחב של אסטרטגיות אנליטיות. כאן אנו מדגימים שיטה להכנת microarrays המורכב של SiO 2 חרוזים נתמכים שומנים מצופים bilayer, שלפוחית ​​פוספוליפידים או חלקיקי קרום טבעיים.

היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב

כאן, אנו מדגימים שיטת ייצור פשוטה עבור מיקרו-טיפות מים בשמן (W/O) הניתנות לשליטה בגודל, חד-פיזוריות, באמצעות מכשיר מיקרופלואידיקה צנטריפוגלי מבוסס נימים. שיטה זו דורשת נפח דגימה קטן בלבד ומאפשרת ייצור בתפוקה גבוהה. אנו מצפים ששיטה זו תהיה שימושית לניתוחים ביוכימיים ותאים מהירים.

נימים מבוססות מכשיר microfluidic צנטריפוגלי עבור גיבוש גודל לשליטה של ​​Monodisperse microdroplets

אנו מציעים טכניקת הרכבה עצמית פשוטה של ננו-חלקיקים קולואידיים של סיליקה כדי ליצור צומת ננו-פלואידית בין שני מיקרו-ערוצים בפולידימתילסילוקסן (PDMS). באמצעות טכניקה זו, קרום חרוז ננו-נקבובי בגודל נקבוביות של עד ~45 ננומטר נבנה בתוך מיקרו-ערוץ והוחל על ריכוז מוקדם אלקטרוקינטי של דגימות DNA.

יצירת צומת תת-50 ננומטר ננו-נוזלי ב PDMS Microfluidic שבב באמצעות תהליך ההרכבה העצמית של חלקיקים קולואיד

כתב יד זה מציג שיטת הזרקה להנדס microvessels כי לשחזר מאפיינים פיסיולוגיים של האנדותל. תהליך microfluidic המבוסס יוצר רשתות כלי דם 3D פטנט עם תנאי tailorable, כגון זרימה, רכב הסלולר, גיאומטריה, והדרגות ביוכימיים. תהליך ייצור ודוגמאות של יישומים פוטנציאליים מתוארים.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

הפיתוח של קהילות חיידקים תלוי בשילוב של גורמים, כולל אדריכלות סביבתית, שפע חבר, תכונות, ואינטראקציות. פרוטוקול זה מתאר סביבה סינתטי, microfabricated למעקב בו זמנית של אלפי קהילות הכלול בארות femtoliter, שבו גורמים מרכזיים כגון גודל נישה כליאה ניתן בקירוב.

העצרת ומעקב אחר פיתוח הקהילה מיקרוביאלית בתוך פלטפורמת מערך Microell

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתאים זעירים ברזולוציה של תא בודד באמצעות הידבקות מתוכנתת DNA. פרוטוקול זה משתמש בפלטפורמת פוטוליטוגרפיה על הספסל כדי ליצור דפוסים של אוליגונוקלאוטידים DNA על שקופית זכוכית ולאחר מכן תוויות קרום התא עם אוליגונוקלאוטידים משלימים זמינים מסחרית. הכלאה של אוליגוס גורמת הידבקות תאים מתוכנתים.

דפוס פשוט, זול ומודולרי של תאים המשתמשים ב- DNA

בדיקות טיפות מים בשמן שימושיות לכימיה אנליטית, התפתחות אנזימים וניתוח תאים בודדים, אך בדרך כלל דורשות מיקרופלואידיקה כדי ליצור את הטיפות. כאן, אנו מתארים תחליב בתבנית חלקיקים, גישה נטולת מיקרופלואידים לביצוע בדיקות טיפות.

תחליב בתבנית חלקיקים מאפשר בדיקות טיפות נטולות מיקרופלואידים

אנו מתארים שיפורים בשיטה סטנדרטית למדידת כוחות המתיחה התאית, המבוססת על הדפסה מיקרו-קונטרקטית עם שלב דפוס תת-קרקעי יחיד של מערכי נקודות של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים רכים. שיטה זו מאפשרת ייצור פשוט ועקבי יותר של דפוסי איים, החיוניים לשליטה בצורת צביר התאים.

יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

פרוטוקול זה מתאר שיטת דפוס תאים ללא דיו, ללא תוויות, שאינה תלויה במצע ובעלת תפוקה גבוהה המבוססת על אפקט ארכימדס מגנטי.

תבניות תאים באמצעות אסטרטגיית ארכימדס מגנטי

למדו ליצור דפוסים מוגדרים של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימים רציפים במערכות מיקרו-זורמיות. שיטה זו מאפשרת מעקב ארוך טווח בפיזיולוגיה ובאינטראקציות של חיידקים וחלקיקים קולואידליים.

דפוס של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימים רציפים

גלה סרטונים נוספים