שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי החיה יכולה לגדול בחופשיות בתוך המכשיר והוא יכול להיות לכוד עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה. ניתן לעשות שימוש חוזר במכשיר מספר פעמים. בעת ייצור המכשיר, ניקיון הוא הגורם החשוב ביותר כדי להיות מסוגל לייצר מכשירים ללא אבק כדי למנוע דליפה במהלך פעולת המכשיר.

כדי להתחיל לעצב תבנית אחת לשכבת הזרימה ותבנית שתיים לשכבת הבקרה באמצעות צורות מלבניות בתוכנת עיבוד תמלילים ולהדפיס את מסכות הצילום בעזרת מתווה לייזר בגודל תכונה מינימלי של שמונה מיקרומטר על סרט מבוסס פוליאסטר. חותכים פרוסות סיליקון לחתיכות מרובעות של 2.5 ס"מ גובה ורוחב. נקו אותם עם 20% אשלגן הידרוקסיד למשך דקה אחת ושטפו את הוופלים במים שעברו דה-יוניזציה.

השתמש בפרוסה אחת לזרימה ובשנייה לשכבת הבקרה. יבשו את החלקים עם 14 גז חנקן דחוס P-S-I ואחריו התייבשות על צלחת חמה ב 120 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. לאחר קירור לקחת חתיכת סיליקון אחד, לשים אותו על צ'אק של מקודד ספין ולהפעיל את ואקום כדי להחזיק את רקיק במקום.

שים כ-20 מיקרוליטרים של הקסמתיל-דיסילן על חתיכת הסיליקון וצפה אותה באמצעות מקודד הספין ב-500 R-P-M למשך חמש שניות ואחריו 3000 R-P-M למשך 30 שניות. כדי לקבל עובי פוטורסיסט אחיד של כ-40 מיקרומטר ספציפי לשכבת הזרימה, מצפים את פרוסת הסיליקון בכ-1.5 מיליליטר של פוטורסיסט שלילי באמצעות מקודד ספין ב-500 R-P-M למשך חמש שניות ולאחר מכן 2000 R-P-M למשך 30 שניות. חזור על הציפוי של חתיכת הסיליקון עם hexamethyldisilane ו photoresist שלילי אחד עבור פרוסה השנייה כדי לקבל עובי photoresist אחיד של כ 40 מיקרומטר ספציפי לשכבת הבקרה.

לחלופין, כדי להגדיל את עובי שכבת הזרימה לכ-80 מיקרומטר עבור בעלי חיים מבוגרים מצפים פרוסות סיליקון עם כ-1.5 מיליליטר של פוטורסיסטים שליליים שניים, באמצעות קודן הספין ב-500 R-P-M למשך חמש שניות ואחריו 2000 R-P-M למשך 30 שניות. אופים את שתי חתיכות הסיליקון המצופות בעבר על פלטה חמה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר הקירור, הניחו חתיכות סיליקון אפויות רכות על שלב החשיפה של תאורת U-V כאשר המשטח המצופה בפוטורסיסטים פונה למנורת U-V.

חשוף את שני החלקים בנפרד ל- U-V למשך 15 שניות באמצעות מנורה של 200 וואט דרך מסיכת צילום עם תבניות אחת ושתיים כדי לקבל שכבות זרימה ובקרה בהתאמה. אופים את שתי חתיכות הסיליקון החשופות כפי שתואר קודם לכן עם שכבות מצופות הפונות כלפי מעלה. לאחר קירור חתיכות, לפתח את התבניות על ידי השריית חתיכות סיליקון בפתרון מפתח photoresist במשך 20 דקות.

ברגע שהתבנית נראית לעין, שטפו את החלקים באלכוהול איזופרופיל טהור ויבשו בעדינות באמצעות גז חנקן. שומרים את חתיכות הסיליקון במייבש כשהמשטח המצופה פונה כלפי מעלה. חשוף את החלקים לאדי סילאן על ידי מזיגת 50 מיקרוליטרים של T-C-P-F-O-S טהור על מגלשת זכוכית.

מניחים את המגלשה בתוך חומר ייבוש ודוגרים במשך שעתיים. הכינו P-D-M-S בכוס פלסטיק על ידי ערבוב בסיס האלסטומר עם חומר הריפוי וערבבו כל הזמן במשך שלוש דקות. דגה את תערובת P-D-M-S במייבש למשך 30 דקות כדי להסיר את כל בועות האוויר.

מניחים את פרוסות הסיליקון של שכבת הבקרה בצלחת פטרי ויוצקים שכבת תערובת P-D-M-S בעובי חמישה מילימטרים על חתיכות הסיליקון. לאחר תהליך המזיגה של P-D-M-S, חזור על הסרת הגזייה של תערובת P-D-M-S. הנח את פרוסת הסיליקון עם שכבת זרימה מול משאית המסתובבת המפעילה לחץ ואקום של 200 עד 500 מיליטור.

יוצקים בערך מיליליטר אחד של P-D-M-S על פרוסת הסיליקון. קודדו אותו באמצעות מעיל ספין כדי לקבל שכבה בעובי של כ-80 מיקרומטר. אופים את שני פרוסות הסיליקון עם הספין המצופה P-D-M-S ומוזגים שכבות P-D-M-S בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס בתנור הסעה באוויר חם במשך שש שעות.

לאחר הקירור חותכים את שכבת ה-P-D-M-S בעובי חמישה מילימטרים מחתיכת הסיליקון סביב שכבת הבקרה באמצעות להב חד ומקלפים אותה ממצע הסיליקון. נקב שני חורים בקוטר של כמילימטר אחד באמצעות מנקב האריס במאגר של בלוק P-D-M-S כדי לחבר את תעלת האימוביליזציה ופתחי תעלת הבידוד לקווי הגז עבור סטיות ממברנת P-D-M-S. הניחו את חתיכת הסיליקון עם שכבת P-D-M-S המצופה בספין על תבנית אחת כאשר המשטח המצופה P-D-M-S פונה כלפי מעלה על מגש פלסטיק.

שמור את בלוק ה- P-D-M-S המנוקב עם תבנית שתיים על המגש כשהצד המעוצב פונה כלפי מעלה. שמור את מגש הפלסטיק בתוך שואב פלזמה וחשוף את שני משטחי P-D-M-S לפלזמה אוויר של 18 וואט למשך שתי דקות על ידי הפעלת שואב אבק נמוך. הוציאו את שני הבלוקים שטופלו בפלזמה וקשרו בעדינות את הבלוקים על ידי לחיצה על המשטחים המטופלים בפלזמה של תבניות אחת ושתיים יחד.

אופים את התבניות המלוכדות בחום של 50 מעלות במשך שעתיים בתנור הסעה באוויר חם. לאחר הוצאת מכשיר ההדבקה מהתנור, חותכים אותו מתוך פרוסת סיליקון עם תבנית אחת ותבנית שתיים ומנקבים חורים במאגרי הכניסה והיציאה של שכבת הזרימה באמצעות מנקב האריס. הנח את בלוק ה- P-D-M-S המחובר כאשר שכבת הזרימה פונה כלפי מעלה על מגש פלסטיק ושמור על זכוכית כיסוי נקייה על אותו מגש.

חשוף את הבלוקים בזכוכית הכיסוי לפלזמה אוויר של 18 וואט למשך שתי דקות. התאם את לחץ הוואקום כדי לראות תא סגול. מניחים את גוש הפלזמה החשוף P-D-M-S על זכוכית הכיסוי ואופים את המבנה המלוכד בתנור בחום של 50 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

אחסן את ההתקן בתא נקי לכל ניסוי עתידי. קח את המכשיר, שים אותו על מיקרוסקופ סטריאו וחבר את הצינורות. חבר צינור מיקרופלקס לקו גז חנקן דחוס ולמחבר תלת-כיווני בקצה השני.

חבר צינורות אחד ושניים מהמחברים התלת-כיווניים למלכודת בממברנות בידוד בהתאמה. חבר שני צינורות microflex לשתי יציאות היציאה של הפקק התלת-כיווני. חבר את הקצה השני של שני הצינורות למחט באורך שמונה מילימטרים באורך 18 מדים.

מלא את שכבת הזרימה במאגר M-9 באמצעות מיקרו פיפטה דרך יציאת הכניסה. ממלאים את שני הצינורות במים שעברו דה-יוניזציה דרך הקצה המחובר למחט. הכנס את שתי המחטים לתוך החורים המנוקבים המחברים את קרום הבידוד והלכידה.

פתח את וסת גז החנקן ב- 14 P-S-I וסובב את השסתום התלת-כיווני מצינור אחד כדי לדחוף את המים לתוך המכשיר דרך התעלות המיקרופלואידיות בשכבות הבקרה, כלומר קרום המלכודת והבידוד. שחררו את הלחץ באמצעות הפקק התלת-כיווני, לאחר שהתעלות מתמלאות במים ומכוונות. הסר את הבועות על-ידי הזרמת מדיה נוספת דרך ערוץ הזרימה.

האיור מציג תמונות של P-S-3-2-3-9, חיה שגדלה בתוך השבב המיקרופלואידי ומשותקת כל שמונה עד עשר שעות כדי ללכוד תמונות פלואורסצנטיות. שונות בתבנית הביטוי מייצגת דוגמה לוויסות גנים טמפורלי שבו אותו גן מתבטא בתאים שונים בשלבי התפתחות שונים. הדמיה של גנוטיפ W-D-I-S-5-1 של caenorhabditis elegans מראה ארכיטקטורה דנדריטית מסועפת דמוית מנורה בכל נוירון P-V-D הכולל תהליכים ראשוניים, שלישוניים ורבעוניים בשלבי התפתחות L-2, L-2, L-3 ו-L-4 בהתאמה.

האיור כאן משווה בין פיתוח P-V-D ובעלי חיים שגודלו במכשירים, לבין אלה שגודלו על צלחות N-G-M. המספרים של S-P ו- Q-P בשלבים שונים של התפתחות התולעת גדלו עם הגיל. Caenorhabditis elegans טופלה עם טיפה של שלושה מילימולר levamisole כדי לגרום לשיתוק מספיק הדרוש להדמיה ברזולוציה גבוהה.

ערכי ה-S-P לא היו שונים באופן משמעותי כאשר נמדדו מבעלי חיים מבוימים דומים שגודלו על לוחות N-G-M וצולמו באמצעות שלושה מילימולרים לבאמיזול על שקופית אגר. יתר על כן, המרחק בין שני גופי תאי P-V-C, אחד נוכח בזנב, והשני נוכח ליד הפות, גדל ככל שהם מתרחקים זה מזה הן בבעלי חיים הגדלים במכשיר והן באלה הגדלים על צלחות N-G-M. האיור מייצג את התמונה ברזולוציה גבוהה של נוירונים קולטני מגע מבעלי חיים הגדלים בתוך המכשיר המיקרופלואידי.

המונטאז' מייצג את כל התהליך העצבי P-L-M-R בנקודות זמן עוקבות המדגישות את המיטוכונדריה ואת התהליך העצבי. הגרף מייצג את אורך התהליך העצבי הכולל שנצפה עולה עם שיפוע של 10.4 מיקרומטר לשעה. ההתקן המיקרו-מיוצר משתמש בקרום P-D-M-S דק המוסט בנוכחות גז חנקן בלחץ גבוה כדי לשתק ולהחזיק C-elegans במקום לצורך הדמיה ברזולוציה גבוהה.

הליך זה יכול לאפשר מחקרי אורך של תהליכים תאיים ותת-תאיים ב-C-elegans הזקוקים לתצפיות לסירוגין לאורך תקופה ארוכה.