DetectSyn: שיטה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת לזיהוי שינויים בצפיפות הסינפסה

DetectSyn מנצל את טכנולוגיית בדיקת קשירת הקרבה כדי לזהות במהירות שינויים בסינפסות. אנו מספקים גם פרוטוקול לניתוח התוצאות. היתרון העיקרי של DetectSyn הוא כמה מהר ניתן להשיג את התוצאות באזורים הגדולים של רקמות שניתן לנתח.

כדי להתחיל, בזהירות להסיר את הפתרון חוסם עם פיפטה פסטר פלסטיק מבלי להפריע לתאים. לאחר מכן מרפדים צלחת פטרי גדולה מפלסטיק עם פרפילם. ובאמצעות מלקחיים, מעבירים בזהירות את תלושי הכיסוי לפארפילם.

הוסיפו 60 מיקרוליטרים של תמיסת הנוגדנים הראשונית לחלק העליון של פתק הכיסוי, כדי להבטיח שפתרון הנוגדנים לא יישפך על דפנות תלוש הכיסוי. כדי לספק לחות ולמנוע ייבוש דגימות במהלך הדגירה, הוסיפו מים אולטרה-פוריים לצלחת פטרי קטנה יותר, והניחו בזהירות את התבשיל סביב תלושי הכיסוי. לאחר מכן מכסים את צלחת הפטרי הגדולה יותר ומדגרים את התאים בתרבית למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה עם הנוגדן הראשוני, השתמשו במלקחיים כדי להקיש בזהירות על תמיסת הנוגדן הראשונית מתוך תמיסת הכיסוי על מגבת נייר ולהעביר את תלושי הכיסוי לצלחת המקורית שלהם בת 24 הבארות המלאה ב-500 מיקרוליטרים של PBS. לאחר מכן לשטוף את הדגימות עם PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת עם תסיסה עדינה על שייקר מסלול. לאחר הדחיפה האחרונה, העבירו את החלקות הכיסוי בחזרה לצלחת הפטרי הגדולה והוסיפו 40 מיקרוליטרים של תמיסת הנוגדנים המשנית לחלק העליון של החלקת הכיסוי.

מכסים את צלחת הפטרי ומדגרים את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לצורך קשירת קשר, תוך שמירה על הליגאז על בלוק קר, דיללו את הליגאז 1 עד 40 באמצעות מלאי הליגציה והוסיפו מיד 40 מיקרוליטרים של תערובת הליגאזות למחליקי הכיסוי. מכסים את צלחת הפטרי ומדגרים את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

להגברה, דיללו את הפולימראז 1280 על בלוק קר באמצעות מלאי ההגברה. לאחר מכן הוסיפו 40 מיקרוליטרים של תערובת ההגברה לתלושי הכיסוי ודגרו את הדגימות במשך 100 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להרכבה, שחרר שלושה מיקרוליטרים של מדיית הרכבה על שקופית.

הקש על מאגר שטיפה עודף מהחלקת הכיסוי והנח את החלקת הכיסוי עם תאים הפונים כלפי מטה לתוך אמצעי ההרכבה. אטמו את הדפנות בכמות קטנה של לק שקוף כדי להחזיק את החלקת הכיסוי במקומה. להרכבה של רקמות פרוסות, מעבירים בזהירות פרוסת טישו למגלשה המוכנה ומניחים אותה שטוחה.

לאחר מכן שחררו 5 עד 10 מיקרוליטרים של אמצעי הרכבה על פרוסת הרקמה. מניחים כיסוי זכוכית מעל פרוסת הרקמה ואוטמים את החלקת הכיסוי בלק שקוף, כפי שהודגם קודם לכן. להדמיה דיגיטלית עם מיקרוסקופ קונפוקלי, התאימו את כוח הרווח, ההסטה והלייזר עבור כל ערוץ פלואורסצנטי כדי להפחית את רעשי הרקע ולשפר את האות הפלואורסצנטי.

ודא שהאות הפלואורסצנטי אינו רווי יתר על המידה. עבור נוירוני התרבות, תחת הכרטיסיה רכישת ND, לחץ על שמור בקובץ. לאחר מכן, תחת עיון, בחר קובץ לשמירת התמונה והזן את שם הקובץ.

לאחר מכן, תחת הכרטיסיה Z, בחר באפשרות מצב סימטרי המוגדר על ידי טווח. הגדר את המיקוד למפה הטובה ביותר בשני מישורים ולחץ על הלחצן 'יחסי' כדי להגדיר את מישור המוקד הזה כמרכז מחסנית z. לאחר מכן, הגדר את הטווח לחמישה מיקרומטרים עם צעד אחד של מיקרומטר ובדוק סגור תריס פעיל במהלך תנועת Z.

תחת הכרטיסייה אורך גל, בחר את שם הלחצן האופטי עם הגדרות הרכישה שהוגדרו בעבר תחת תצורה אופטית ולחץ על הפעל כעת. עבור רקמות פרוסות, מתפריט הרכישה בחר סרוק תמונה גדולה, ולאחר מכן תחת לוח הלכידה, בחר בלחצן האופטי עם הגדרות הרכישה שהוגדרו קודם לכן. כמו כן, בחר את המטרה הנכונה בחלונית זו.

לאחר מכן, מתחת ללוח האזור ולפיסת העין, השתמש במקשי החצים כדי להגדיר את גבולות אזור העניין או ההחזר על ההשקעה. לאחר מכן לחץ על שמור תמונה גדולה לקובץ וצור שם קובץ נתיב שמירה עבור התמונה. לבסוף, תחת לוח ההתקנה, ודא כי לכידה רב-ערוצית נבדקת.

לאחר מכן בחר את שם הלחצן האופטי עם הגדרות הרכישה שהוגדרו בעבר תחת תצורה אופטית. ב- ImageJ, פתח את אפשרות הסף על-ידי מעבר לתפריט התמונה, לחיצה על התאם ולאחר מכן על סף. בחר באפשרות רקע כהה אם התמונה כוללת רקע כהה.

לאחר מכן, התאם את הגבולות העליונים והתחתונים של הסף לפי הגדרות הסף הממוטבות שנקבעו בעבר ולחץ על החל. עבור תאים בתרבית, השתמש בתעלת MAP2 ובכלי החזר השקעה ביד חופשית כדי למשוך החזר על ההשקעה עבור כל נוירון, כולל דנדריטים וסומה. עבור רקמות פרוסות, ציירו החזר על ההשקעה ביד חופשית בתוך תמונת הפרוסה שמתמצתת את תחום העניין.

לאחר מכן השג את האזור של ההחזר על ההשקעה על-ידי פתיחת תפריט ניתוח ולחיצה על מדוד. כדי לזהות את מספר הפונטה בתוך כל ROI, השתמש בכלי זיהוי אוטומטי כמו ניתוח חלקיקים. מתפריט 'מנותח', בחר 'חלקיקים מנותחים' והגדר את קוטר גודל הפונקטה.

לאחר מכן, מהתפריט הנפתח 'הצג', בחר באפשרות מסיכות שכבה-על ולאחר מכן בדוק את האפשרות הצג תוצאות ולחץ על ״בסדר״. כדי לחלק את מספר הפונטה באזור ההחזר על ההשקעה הבודד, העתק והדבק את התוצאות עבור כל תמונה מהתוצאות שצצו לגיליון אלקטרוני. זהה באיזה קובץ ודגם את הנתונים שמהם אנו מקבלים, וחלק את שטח ההחזר על ההשקעה במספר הפונטה.

לבסוף, כדי לנרמל את התוצאות כדי לשלוט בדגימות, ממוצע התוצאות עבור דגימות הבקרה וחלוק את התוצאות המתקבלות של כל הדגימות בממוצע של הפקד. האגוניסט GABAB, בקלופן, נדרש ליעילות במבחנה של התרופה נוגדת הדיכאון המהירה Ro-256981. עלייה בהיווצרות הסינפסות מודגמת על ידי עלייה בפונטה הלבנה.

ללא בקלופן, לא נראית עלייה בהיווצרות הסינפסות. In vivo, הזרקה תוך-צפקית של התרופה נוגדת הדיכאון המהירה גורמת לעלייה בהיווצרות הסינפסות בהשוואה לבקרת המלח. בעוד שחלק מהפונטה מופיעים בתמונות הבקרה הטכנית, הם בדרך כלל אינם באותו גודל כפי שהודגם על ידי המפרט הלבן בהשוואה לפונטה הגדולה בלוחות האחרים.

יתר על כן, פונטה אלה אינם נמצאים באותו מקום כפי שהודגם על ידי פונטה כלשהי המופיעה בתוך הסומא. DetectSyn יכול לזהות שינויים בסינפסות עקב מצב מחלה או טיפול תרופתי. שיטה זו יכולה לעזור לספק תובנה לכל תחום מחקר החוקר את ההפרעות המשפיעות על התפתחות או התמוטטות של סינפסות.