ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון
10 בפברואר 2022
האינטראקציה של שיפוץ כרומטין תלוי ATP עם ליגנד DNA מתוארת באמצעות ספקטרוסקופיה CD. ניתן להשתמש בשינויים הקונפורמציה המושרים על מקדם גנים שניתח על ידי הפסגות שנוצרו כדי להבין את מנגנון הרגולציה התמלולית.
הפרוטוקול מאפשר לנו לדמיין את השינויים בארגון מחדש השני של DNA המושרה על ידי חלבוני שיפוץ כרומטין תלויי ATP. השינוי במבנה הדנ"א יכול להיות מתואם לרגולציית התמלול. זוהי טכניקה קלה ורגישה מאוד המשתמשת בכמות קטנה מאוד של DNA טהור כדי לתעד את השינויים המבניים באוליגונוקלאוטיד.
שיטה זו יכולה לספק תובנה על ויסות שעתוק בתיווך חלבוני שיפוץ כרומטין תלויי ATP. כדי להתחיל, להכין את ריכוזי העבודה של חוצצים ורכיבי תגובה אחרים טרי ולשמור אותם בארבע מעלות צלזיוס לפני הגדרת התגובות, ולאחר מכן למדוד את פעילות ATPase של החלבון בנוכחות מולקולות DNA שונות באמצעות NADH מצמיד בדיקת חמצון. מערבבים ADAAD 0.1 מילימולר, ATP שני מילימולרים, 10 ננומולר DNA, ו 1X REG חוצץ בצלחת 96 טוב לנפח סופי של 250 microliters.
לאחר מכן, לדגור על התגובה במשך 30 דקות בחממה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן למדוד את כמות NAD + באמצעות התוכנה המסופקת יחד עם קורא microplate. כדי למדוד את הספיגה ב 340 ננומטר, לחץ על ת.ד. את naDH assay ומניח את צלחת 96-well על מחזיק הצלחת במכשיר, ולאחר מכן לחץ על כפתור לוח הקריאה כדי להקליט את הספיגה. אסוף את ספקטרום התקליטור בקובטות קוורץ בשקיפות גבוהה.
השתמש בקובטים מלבניים או גליליים. כדי לנקות את cuvettes, לשטוף אותם עם מים מספר פעמים, ולאחר מכן לקחת סריקה של המים או חוצץ cuvette כדי לבדוק אם זה נקי. לתגובות, השתמש באוליגונוקלאוטידים מטוהרים בדנ"א.
לקירור מהיר, מחממים את הדנ"א ב-94 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות על בלוק החימום ומקררים אותו מיד על קרח. לקירור איטי, לאחר חימום ה- DNA ב 94 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות, אפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר בקצב של מעלה אחת צלזיוס לדקה. כדי להקליט את הספקטרום הבסיסי, להגדיר בסך הכל חמש תגובות בקרה אחד אחד בצינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר.
שמור את נפח התגובה על 300 מיקרוליטרים בכל התגובות. כדי להקליט את ספקטרום התקליטור, להגדיר בסך הכל חמש תגובות ניסיוניות אחד אחד בצינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר. כדי להקליט את הסריקה, הפעל את הגז והפעל את ספקטרומטר התקליטור.
לאחר 10 עד 15 דקות, להפעיל את המנורה, להפעיל את אמבט המים ולהגדיר את טמפרטורת המחזיק על 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, פתח את תוכנת ספקטרום התקליטורים והגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס, את טווח אורך הגל ב-180 עד 300 ננומטר, את הזמן לנקודה ל-0.5 שניות ואת מספר הסריקה לחמש, ואז לחץ על מציג הנתונים המקצועי, צור קובץ חדש ושנה את שמו לפרטי הניסוי והתאריך. לאחר מכן, מערבבים את התגובות הבסיסיות והניסוי על ידי צנרת ומעבירים בזהירות את תערובות התגובה בזה אחר זה לקובט, ומבטיחים שאין בועות אוויר.
אם מבצעים ניסוי בקורס זמן, לדגור את התגובות ב 37 מעלות צלזיוס לזמן הנדרש, ואז לקחת את הסריקה. הוסיפו את EDTA למאגר המכיל את הדנ"א, ה-ATP, המגנזיום והחלבון כדי לעצור הידרוליזה של ATP. כדי לעכב לחלוטין את פעילות ATPase, להגדיל את ריכוז EDTA וזמן הדגירה.
הפחת את קווי הבסיס מהתגובות המתאימות בתוכנה והחליק את הנתונים בתוכנת ספקטרום התקליטורים או בתוכנת התוויית הנתונים, ולאחר מכן התווה גרף של אורך גל כנגד אליפטיות שאריות ממוצעת וניתח את הפסגות. קפלי M הראו כי שני גדילי ה- DNA MYC יכולים ליצור מבנה דמוי לולאת גזע. המבנים המקפלים M של רצף ה- DNA הקדמי וההפוך המכיל את G quadruplex GECE מוצגים כאן.
ספקטרום התקליטור של GECE מקורר במהירות בהיעדר ונוכחות של ATP ו ADAAD הראה כי ADAAD גורמת שתי פסגות חיוביות, אחד ב 258 ננומטר והשני ב 210 ננומטר. התוספת של EDTA שוללת שינוי קונפורמציה זה. ספקטרום התקליטורים יש עכשיו שיא שלילי 210 ננומטר ופס חיובי רחב עם פסגות ב 230 ו 250 ננומטר.
ממפה QGRS וניתוח קיפול M הראו כי אזורי האמרגן של DROSHA, DGCR8 ו- DICER הם בעלי פוטנציאל ליצור G מרובע ומבנים דמויי גזע. ספקטרום התקליטורים של זוג DROSHA חמש הראה כי ADAAD גרים שיא שלילי ב 210 ננומטר ושיא חיובי ב 260 ננומטר. ספקטרום זה הוא מאפיין של ADNA.
ספקטרום התקליטורים של זוג DGCR8 אחד הראה שיא חיובי ב 210 ננומטר ושיא שלילי רחב ב 260 ננומטר. ספקטרום זה אופייני למעבר B עד X. עבור זוג DGCR8 שבע, שיאים חיוביים חזקים ב 210 ו 270 ננומטר ושיא שלילי ב 250 ננומטרים נראו.
ספקטרום זה אופייני למבני דנ"א מקבילים של G מרובע. לבסוף, עבור זוג DICER אחד, שיא חיובי ב 210 ננומטר ושתי פסגות שליליות, אחד ב 230 ננומטר והשני ב 260 ננומטר נצפו. פסגות אלה אופייניות למעבר A עד X DNA.
ודא כי טוהר ה- DNA והחלבון הוא 99% או יותר. cuvette צריך להיות נקי ואת הבסיס צריך להיות פחות מ millidegree אחד. כל הריאגנטים צריכים להיות טהורים כך שהרקע הוא פחות ממילימטר אחד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתאר את האינטראקציה של מרכיב שינויי כרומטין תלוי ATP עם ליגנד DNA באמצעות ספקטרוסקופיית CD. השינויים הקונפורמטיביים שנצפו על פרומוטר גנים יכולים לספק תובנות לגבי מנגנוני ויסות תעתוק.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- שינוי מבנה הכרומטין
- ויסות תעתוק
- ביולוגיה מבנית
רקע
- מרכיבי שינויי כרומטין תלויי ATP משחקים תפקיד מכריע בביטוי גנים.
- הבנת השינויים הקונפורמטיביים של ה-DNA חיונית להבהרת מנגנוני תעתוק.
- ספקטרוסקופיית CD היא טכניקה רגישה לניתוח מבני DNA.
- כמויות קטנות של DNA יכולות לשמש למחקרים מבניים מפורטים.
מטרת המחקר
- לדמיין שינויים במבנה ה-DNA הנגרמים על ידי חלבונים של שינויי כרומטין.
- ליצור קורלציה בין שינויים מבניים לוויסות תעתוק.
- לספק פרוטוקול לחקר האינטראקציות הללו באמצעות ספקטרוסקופיית CD.
שיטות ששימשו
- הכנת ריכוזים עובדים של מאגרים ורכיבי תגובה.
- מדידת פעילות האטפאז בנוכחות מולקולות DNA שונות.
- שימוש בבדיקת חמצון משולבת NADH.
- ערבוב ריכוזים ספציפיים של ADAAD, ATP, DNA ומאגר REG בצלחת 96 באר.
תוצאות עיקריות
- שינויים מבניים ב-DNA הוצגו בהצלחה באמצעות ספקטרוסקופיית CD.
- הוקמו קורלציות בין מבנה ה-DNA לוויסות תעתוק.
- השיטה הוכחה כקלה ורגישה במיוחד.
- הופקו תובנות לגבי התפקיד של חלבונים של שינויי כרומטין תלויי ATP.
מסקנות
- המחקר משפר את ההבנה של מנגנוני ויסות תעתוק.
- ספקטרוסקופיית CD היא כלי יעיל לניתוח שינויים קונפורמטיביים של ה-DNA.
- מחקר עתידי יכול לבנות על ממצאים אלו כדי לחקור עוד את הדינמיקה של הכרומטין.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Circular dichroism (CD) spectroscopy enables high-sensitivity detection of DNA conformational changes induced by chromatin remodeling proteins, directly informing target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach supports predictive confidence in transcriptional regulation studies, facilitating risk-adjusted decisions at key inflection points in the biopharma pipeline. Its minimal sample requirements and quantitative outputs make it a scalable asset for portfolio-wide interrogation of DNA-protein interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of DNA structural changes upon protein binding, clarifying regulatory mechanisms.
- Supports functional validation of chromatin remodelers as drug targets by linking conformational shifts to transcriptional outcomes.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing sequence-specific and affinity-driven interactions.
- Provides quantitative data for hypothesis-driven triage of candidate targets.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, quantitative readouts of DNA-protein interaction dynamics for assay standardization.
- Supports development of robust screening platforms by validating biological system readiness and minimizing background noise.
- Enables rapid assessment of mutant DNA sequences to probe specificity and optimize assay conditions.
- Facilitates platform reuse across multiple target classes due to minimal sample and instrumentation requirements.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling chromatin dynamics at gene promoters implicated in transcriptional regulation.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling structural biomarker identification.
- Supports risk-adjusted advancement by correlating in vitro conformational changes with potential in vivo regulatory effects.
Pipeline & Workflow Integration
CD spectroscopy integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early mechanistic interrogation, assay development, and translational biomarker exploration for DNA-protein interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on chromatin remodeling and transcriptional regulation by visualizing DNA conformational shifts.
- Screening: Provides quantitative, reproducible spectra for comparing protein-DNA binding across conditions and mutants.
- Analytics: Outputs wavelength-resolved ellipticity data, enabling statistical comparison of structural states.
- Translational Research: Connects in vitro conformational signatures to disease-relevant promoter dynamics.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, low-input workflow adaptable across multiple gene targets and protein classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in chromatin biology.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible measurements with minimal sample requirements.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient triage of early-stage targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of transcriptional regulation programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biophysical analysis and chromatin biology for data interpretation.
- Needs access to high-sensitivity CD spectrometers and clean, high-purity reagents.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample preparation and baseline controls.
- Adaptable to various DNA sequences and chromatin remodelers with protocol optimization.
- Limited by the need for highly pure DNA and protein samples to minimize background signal.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
ATPase Activity
1:35
Preparation of Circular Dichroism (CD) Cuvettes and DNA Oligonucleotides
2:19
Setting up the Experiments and Recording the Scan
4:10
Results: CD Spectra of MYC, DROSHA, DGCR8, and DICER Oligonucleotides in the Presence of ATP and ADAAD
6:18
Conclusion
