Name: ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: חקור שינויים מבניים ב-DNA המושפעים מחלבוני ATP-dependent chromatin remodeling באמצעות ספקטרוסקופיית CD. שיטה זו מספקת תובנות לגבי מנגנוני ויסות השעתוק בביולוגיה מבנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות למתקן מחקר מכשור מתקדם, JNU, על ספקטרופוטומטר התקליטורים. V.J. ו- A.D. נתמכו על ידי מלגה מ CSIR.

1. ריכוז עבודה של רכיבי התגובה
<ol><li>הכן את ריכוזי העבודה של מאגרים עבור תקליטור ורכיבי תגובה אחרים טריים (ראה טבלה 1) ולשמור אותם ב 4 °C (70 °F) לפני הגדרת התגובות. הערה: עבור תגובות התקליטור המתוארות במאמר זה, ריכוזי העבודה של רכיבים הם כדלקמן: מאגר נתרן פוספט (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 ננומטר, חלבון 1 מיקרומטר, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.</li>
</ol>2. פעילות ATPase
<ol><li>לפני ספקטרוסקופיית התקליטור, בססו את פעילות ה-ATPase של החלבון בנוכחות מולקולות ה- DNA כדי להבטיח שהחלבון המשמש בספקטרוסקופיית התקליטור פעיל ולזהות את מולקולות ה- DNA היעילות באופן אופטימלי בהפעלת הידרוליזה ATP.</li>
	<li>מדוד את פעילות ATPase של החלבון בנוכחות מולקולות DNA שונות על ידי בדיקת חמצון מצמיד NADH המורכבת משתי התגובות הבאות.<ol>
<li>ערבבו 0.1 מיקרומטר ADAAD, ATP של 2 מ"מ, 10 ננומטר DNA וחיץ REG 1x בלוח 96 בארות לנפח סופי של 250 μL. הערה: האנזים pyruvate kinase משתמש ADP ו Pi להמיר זרחן לפירובאט, ובכך לחדש ATP. זה מבטיח כי ATP הוא תמיד בריכוז רווי בתגובה. בתגובה השנייה, הפירובאט שנוצר על ידי הפעולה של פירובט קינאז מומר על ידי לקטט דהידרוגנאז לקטט. בתגובה זו, מולקולת NADH אחת מחומצנת ל- NAD+. הצריכה של NADH נמדדת על ידי מדידת ספיגת המולקולה ב 340 ננומטר.</li>
		<li>דגירה במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F) באינקובטור.</li>
		<li>מדוד את כמות NAD+ ב- 340 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוח.</li>
		<li>כדי למדוד את כמות NAD+, השתמש בתוכנה המסופקת יחד עם קורא המיקרו-לוח.<ol>
<li>לחץ על תצודת NADH כדי למדוד את הספיגה ב 340 ננומטר.</li>
			<li>מניחים את הצלחת 96-well על מחזיק הצלחת בכלי. לחץ על לחצן לוח קריאה כדי להקליט את הספיגה. הערה: הריכוז של NAD+ מחושב באמצעות מקדם הכחדת הטוחנת של NADH כ- 6.3 mM−1 באמצעות eq (1). A = εcl (1) כאן, A = ספיגה ε = מקדם הכחדה טוחנת c = ריכוז מולרי l = אורך נתיב אופטי בס"מ</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. בחירה והכנה של תקליטורים
<ol><li>לאסוף ספקטרום תקליטורים בשקיפות גבוהה קוורץ cuvettes. השתמש בקובטות מלבניות או גליליות. הערה: cuvette קוורץ תקליטור (נפח נומינלי של 0.4 מ"ל, אורך נתיב של 1 מ"מ) שימש עבור כל התגובות המתוארות במאמר זה.</li>
	<li>השתמש בתמיסת ניקוי cuvette כדי לנקות את cuvette. הוסף 1% cuvette ניקוי פתרון במים כדי להפוך 400 μL של הפתרון, לשפוך אותו cuvette, ולדגירה אותו ב 37 °C (50 °F) במשך 1 שעה.</li>
	<li>לשטוף את cuvette עם מים כמה פעמים כדי לנקות את cuvette. קח סריקה של המים או חוצץ בקובט כדי לבדוק אם הוא נקי. הערה: המים או המאגר חייבים לתת קריאה בטווח של 0 עד 1 mdeg.</li>
</ol>4. הכנת חלבונים ואוליגונוקלאוטיד DNA
<ol><li>שמור את נפח החלבון מתחת 50 μL בתגובה כדי למזער את כמויות של רכיבי המאגר כי לפעמים לגרום להיווצרות של פסגות מעורפלות. שמור את החלבון על הקרח לאורך כל הניסוי כדי למנוע כל השפלה.</li>
	<li>השתמש באוליגונוקלאוטידים מטוהרים על ידי עמוד בתגובות. הערה: בתגובות המתוארות כאן, DNA שימש הן בצורות מקוריות והן בצורות מקוררות חום (מקוררות במהירות (FC) ומצוננות באיטיות (SC)). קירור מהיר מקדם מליטה תוך-עינית בדנ"א, ומניב מבנים משניים יותר. לעומת זאת, קירור איטי מקדם קשר בין-מולקולרי בדנ"א, וכתוצאה מכך פחות מבנים משניים.</li>
	<li>לקירור מהיר, מחממים דנ"א במהירות של 94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות על בלוק החימום ומקררים אותו מיד על קרח. לקירור איטי, מחממים דנ"א ב-94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ומאפשרים לו להתקרר לטמפרטורת החדר בקצב של 1 מעלות צלזיוס לדקה.</li>
</ol>5. הגדרת ניסויי בקרה כדי לתעד את הספקטרום הבסיסי
<ol><li>שמור את נפח התגובה ב 300 μL בכל התגובות. הגדר סך של 5 תגובות בסיסיות בצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל, אחד אחד, כדלקמן: i) חוצץ + מים; ii) חוצץ + MgCl2 + ATP + מים; iii) חוצץ + MgCl2 + ATP + חלבון + מים; 4) iii + EDTA או ADAADiN; v) חוצץ + חלבון + מים.</li>
</ol>6. הגדרת הניסויים להקלדת ספקטרום תקליטורים
<ol><li>הגדר סך של 5 תגובות, אחד אחד, ב 1.5 מ"ל צינורות צנטריפוגות כדלקמן: i) חוצץ + DNA + מים; ii) חוצץ + DNA + MGCl2 + ATP + מים; iii) חוצץ + DNA + MGCl2 + ATP + חלבון + מים; 4) iii + EDTA או ADAADiN; v) חוצץ + DNA + חלבון + מים.</li>
</ol>7. סריקת הקלטה
<ol><li>תדליק את הגז ותדליק את ספקטרומטר התקליטורים.</li>
	<li>להפעיל את המנורה לאחר 10-15 דקות. להפעיל את אמבט המים ולהגדיר את טמפרטורת המחזיק על 37 °C (50 °F).</li>
	<li>פתח את תוכנת ספקטרום התקליטורים .<ol>
<li>הגדר את הטמפרטורה ל 37 °C (50 °F).</li>
		<li>הגדר את טווח אורך הגל על 180 - 300 ננומטר.</li>
		<li>הגדר את הזמן לנקודה ל - 0.5 s.</li>
		<li>הגדר את מספר הסריקה ל - 5.</li>
		<li>לחץ על Pro-Data Viewer, ליצור קובץ חדש, ולשנות את שמו עם פרטים על הניסוי והתאריך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שמור את כל רכיבי התגובה על קרח כדי למנוע כל השפלה. הפוך את קווי הבסיס ואת התגובות, אחד אחד, צינורות צנטריפוגות ולערבב אותם על ידי pipetting. מעבירים את תערובת התגובה לקובט בזהירות, ומבטיחים שאין בועות אוויר.</li>
	<li>אם מבצעים ניסוי בזמן, לדגור על התגובות ב 37 °C (37 °F) לזמן הנדרש ולקחת את הסריקה. הוסיפו את EDTA למאגר המכיל את הדנ"א, ה-ATP, Mg+2 והחלבון כדי לעצור הידרוליזה של ATP.</li>
	<li>להגדיל את הריכוז של EDTA ואת זמן הדגירה שלה כדי לעכב את פעילות ATPase לחלוטין.</li>
	<li>הפחת את קווי הבסיס מהתגובות המתאימות בתוכנה (למשל, הפחת את התגובה 1 מקו הבסיס 1). החלק את הנתונים בתוכנת ספקטרום התקליטורים או בתוכנת התוויית הנתונים. התווה את הנתונים בתוכנת התוויית הנתונים. הערה: חיסור קווי הבסיס מהתגובות המתאימות ייתן לספקטרום התקליטור נטו של DNA בלבד.</li>
</ol>8. ניתוח נתונים ופרשנות
<ol><li>השתמש בנוסחה שניתנה על-ידי eq (2) כדי להמיר את הערכים המתקבלים במילידגריות כך שמשמעותם אליפטיות שאריות. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63147/63147eq01.jpg">(2) כאן, S הוא אות התקליטור במילידגרי, c הוא ריכוז ה- DNA ב- mg / mL, mRw הוא מסת השאריות הממוצעת, ואני אורך הנתיב בס"מ.</li>
	<li>התווה גרף נגד אורך גל ואליפטיות שאריות ממוצעת באמצעות תוכנת התוויית הנתונים וניתח את הפסגות.</li>
	<li>כדי להתוות את הגרף, בחרו את אליפטיות השאריות הממוצעת בציר ה-Y ואורך הגל בציר ה-X והתוו גרף קו ישר. הערה: גרף זה יספק את המאפיינים פסגות של צורות שונות של DNA. ניתן לזהות את צורות הדנ"א המתאימות לפסגות באמצעות ספרות קיימת6.</li>
</ol>

למחברים אין ניגוד אינטרסים להצהיר.

מטרת מאמר זה היא להציג את טכניקת ספקטרוסקופיית התקליטורים כגישה לחקור את השינויים הקונפורמציה המתרחשים ב- DNA בנוכחות חלבוני שיפוץ כרומטין תלויי ATP ולקשר את השינויים הקונפורמיים האלה לביטוי גנים. ספקטרוסקופיה של תקליטור מספקת שיטה מהירה ונגישה לחקר השינויים הקונפורמציה בדנ"א.

נקודה קריטית שיש לקחת בחשבון עבור טכניקה זו היא טוהר ה- DNA והחלבון. מומלץ להבטיח כי הן DNA וחלבון הם >95% טהור. יש להשתמש באוליגונוקלאוטידים מטוהרים ב-PAGE, ועדיף לטהר את החלבון כדי >95% טוהר. הפרמטר הקריטי השני...

דיכרויזם מעגלי (CD) היא טכניקה ספקטרוסקופית הנשענת על כיראליות אינהרנטית של מקרומולקולים ביולוגיים המובילה לספיגה דיפרנציאלית של אור מקוטב ימני ושמאלי. ספיגה דיפרנציאלית זו ידועה כדיכרואיזם מעגלי. הטכניקה, אם כן, יכולה לשמש כדי לתאר את הקונפורמציה של מקרומולקולים ביולוגיים, כגון חלבונים ו- DNA, שניהם מכילים מרכזי כיראליים1,2.
גלים אלקטרומגנטיים מכילים רכיבים חשמליים ומגנטיים כאחד. הן השדות החשמליים והן השדות המגנטיים מתנדנדים בניצב לכיוון התפשטות הגלים. במקרה של אור לא קוטבי, שדות אלה מתנדנדים בכיוונים רבים. כאשר האור מקוטב מעגלית, שני שדות אלקטרומגנטיים מתקבלים בהפרש פאזה של 90° זה לזה. מולקולות כיראליות מראות סיבוב אופטי מעגלי (birefringence) כך שהן יספגו את האור המקוטב המעגלי הימני ואת האור המקוטב העגול השמאלי בהיקפים שונים3. השדה החשמלי המתקבל יעקוב כאליפסה, פונקציה של אורך הגל. ספקטרום התקליטורים, אם כן, נרשם כאליפטיות (q), והנתונים מוצגים כאליפטיות שאריות ממוצעת כפונקציה של אורך גל.
במקרה של חלבונים, Cα של חומצות אמינו (למעט גליצין) הוא chiral, וזה מנוצל על ידי ספקטרוסקופיה CD כדי לקבוע את המבנה המשני של מאקרומולקול זה4. ספקטרום התקליטור של מולקולות חלבון נרשם בדרך כלל בטווח ה- UV הרחוק. לחלבונים α-הליליים יש שתי רצועות שליליות ב-222 ננומטר ו-208 ננומטר ושיא חיובי אחד ב-193 ננומטר4. חלבונים עם מבנה משני אנטי-מקבילי β יריעות מראים שיא שלילי ב 218 ננומטר ושיא חיובי ב 195 nm4. חלבונים עם מבנים פרועים מראים אליפטיות נמוכה ליד 210 ננומטר ושיא שלילי ב 195 nm4. לכן, שיא מוגדר היטב / רצועות עבור מבנים משניים שונים להפוך CD כלי נוח כדי להבהיר את השינויים הקונפורמציה המתרחשים במבנה המשני של החלבונים במהלך denaturation, כמו גם כריכת ליגנד.
לחומצות גרעין יש שלושה מקורות של כיראליות: מולקולת הסוכר, ההוליות של המבנה המשני, והסדר של שלשה ארוכת טווח של DNA בסביבה5,6. ספקטרום התקליטור של חומצות גרעין נרשם בדרך כלל בטווח של 190 עד 300 ננומטר5,6. כל התאמה של DNA, בדיוק כמו חלבונים, נותן ספקטרום אופייני, אם כי הפסגות / רצועות יכול להשתנות במעלות מסוימות עקב תנאי ממס והבדלים ברצפי DNA7. B-DNA, הצורה הנפוצה ביותר, מאופיין בשיא חיובי סביב 260-280 ננומטר ושיא שלילי סביב 245 nm6. הפסגות/רצועות הדנ"א בצורת B הן בדרך כלל קטנות מכיוון שזוגות הבסיס מאונכים לסליל הכפול, ומעניקים כיראליות חלשה למולקולה. A-DNA נותן שיא חיובי דומיננטי ב 260 ננומטר ושיא שלילי סביב 210 nm6. Z-DNA,סל שמאלי, נותן רצועה שלילית ב 290 ננומטר ושיא חיובי סביב 260 nm6. DNA זה גם נותן שיא שלילי מאוד ב 205 nm6.
בנוסף לקונפורמציות אלה, DNA יכול גם ליצור טריפלקסים, מרובעים וסיכות ראש, שכולם ניתן להבחין על ידי ספקטרוסקופיה CD. G-quadruplex המקביל לתת להקה חיובית דומיננטית ב 260 ננומטר, בעוד G-quadruplex אנטי מקביל נותן רצועה שלילית ב 260 ננומטר ושיא חיובי ב 290 ננומטר, מה שהופך אותו קל להבחין בין שתי צורות של מבנים quadruplex6. טריפלקסים לא נותנים ספקטרום אופייני8. לדוגמה, הספקטרום של DNA באורך 36 נוקלאוטיד עם פוטנציאל ליצור סליל משולש תוך-עיני המכיל זוגות בסיס G.G.C ו- T.A.T בנוכחות Na+ מראה רצועה שלילית חזקה ב 240 ננומטר ושיא חיובי רחב. השיא החיובי הרחב מראה תרומות של 266, 273 ו-286 ננומטר. אותו אוליגונוקלאוטיד בנוכחות Na+ ו- Zn+ מציג ארבע להקות שליליות (213, 238, 266 ו-282 ננומטר) ושיא חיובי של 258 ננומטר. לכן, הספקטרום של DNA טריפלקס יכול להשתנות בהתאם לתנאי מלח8.
בנוסף לקונפורציות אלה, ספקטרום תקליטורים אפשר זיהוי של צורה אחרת של DNA הנקרא X-DNA. X-DNA נוצר כאשר רצף ה- DNA מכיל שאריות אדנין ותימין חלופיות. ספקטרום התקליטור של X-DNA מכיל שתי פסגות שליליות ב 250 ו 280 ננומטר. מעט מאוד מידע זמין על X-DNA, אם כי זה כבר ספקולציות לתפקד כמו כיור עבור supercoiling חיובי6,9. שינויים בספקטרום התקליטורים יכולים גם לחשוף פרטים על אינטראקציות חלבון ליגנד, ולכן, נוספו לארסנל של שיטות מולקולריות לאיתור אינטראקציות בין חלבון תרופתי10,11,12,13,14. ספקטרום תקליטור שימש גם כדי לפקח על השינויים במבנה המשני של חלבונים במהלך תהליך הקיפול15. באופן דומה, ספקטרום תקליטור יכול לשמש גם לבדיקת אינטראקציות ליגנד-DNA16,17.
ספקטרוסקופיה CD, אם כן, היא שיטה קלה וזולה להבחין בין צורות שונות של התאמת DNA, בתנאי שיש גישה לציוד ותוכנה לא כל כך זולים. השיטה רגישה ומהירה ביותר. זה רק דורש כמות קטנה של DNA, נותן לו יתרון על הטכניקה החלופית של ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית (NMR). קל גם לבצע טייטציות עם ליגנדים ומצעים. האילוץ העיקרי הוא שהדנ"א צריך להיות טהור מאוד. מומלץ להשתמש ב- DNA מטוהר של ג'ל פוליאקרילמיד (PAGE).
המידע המתקבל על ידי ספקטרום תקליטור שימש בעיקר כדי להסיק תכונות מבניות חלבון ולזהות קונפורמיות DNA ברורות. במחקר זה, ספקטרום תקליטור שימשו כדי לשלב את התוצאות שהתקבלו מניסוי in vivo Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) כדי לתאר אם חלבון של עניין/ גורם שעתוק חזוי יכול להביא לשינוי קונפורמציה באזור האמרגן של הגנים המשפיעים שלה. שיתוף פעולה זה מסייע בהתקדמות של טכניקות ספקטרוסקופיות תקליטור מסורתיות על ידי חיזוי המנגנון של ויסות התמלול על ידי גורם התמלול החזוי באתר התחלת התמלול (TSS) של מקדם.
שיפוץ כרומטין הוא מנגנון מוגדר היטב הידוע לווסת תהליכים מטבוליים DNA על ידי הפיכת הכרומטין ארוז היטב נגיש לגורמים רגולטוריים שונים כגון גורמי שעתוק, רכיבים של שכפול DNA, או נזק חלבונים תיקון. משפצים כרומטין תלויי ATP, הידועים גם בשם משפחת החלבונים SWI/SNF, הם חלבונים מפתח לשיפוץ הנמצאים בתאים אאוקריוטים18,19. קיבוץ פילוגנטי סיווג את משפחת החלבונים SWI/SNF ל-6 תת-קבוצות20: דמוי Snf2, דמוי Swr1, דמוי SSO1653, דמוי Rad54, דמוי Rad5/16 ומרוחק. SMARCAL1, חלבון העניין במחקר זה, שייך לתת-קבוצה רחוקה20. חלבון זה שימש כדי לחקור את אופן הרגולציה שעתוק באמצעות ספקטרוסקופיה CD.
רוב החברים בחלבוני שיפוץ הכרומטין התלויים ב-ATP הוכחו כמי שממקמים מחדש או מפנים נוקלאוזומים או מחליפים וריאנטים של היסטון באופן תלוי ATP21,22. עם זאת, כמה מבני המשפחה לא הוכחו לשפץ נוקלאוזומים, למשל, SMARCAL1. למרות שמחקרים הראו כי SMARCAL1 מקשר עם כרומוזומים פוליטן, ראיות ניסיוניות לגבי יכולתו לשפץ נוקלאוזומים חסר 23. לכן, הו להניח כי SMARCAL1 עשוי לווסת את התמלול על ידי שינוי הקונפורמציה של DNA24. ספקטרוסקופיית תקליטורים סיפקה שיטה קלה ונגישה לאימות השערה זו.
SMARCAL1 הוא חלבון שיפוץ כרומטין תלוי ATP המתפקד בעיקר כהליקאז חישול25,26,27. זה כבר להניח כדי לווסת את התמלול על ידי שיפוץ קונפורמציה DNA24. כדי לבדוק השערה זו, התפקיד של SMARCAL1 בוויסות שעתוק גנים במהלך נזק DNA המושרה doxorubicin נחקר. במחקרים אלה, SMARCAL1 שימש לניתוח ויוו ו ADAAD עבור במבחנה assays28,29. מחקרים קודמים הראו כי ADAAD יכול לזהות DNA באופן תלוי מבנה אך רצף עצמאי30,31. החלבון נקשר בצורה אופטימלית למולקולות דנ"א בעלות גדיל כפול לאזורי מעבר חד-גדיליים, בדומה לדנ"א של לולאת גזע, והידרוליזים ATP 30,31.
ניסויי In vivo הראו כי SMARCAL1 מווסת את הביטוי של MYC, DROSHA, DGCR8 ו- DICER על ידי איגוד לאזורי האמרגן28,29. אזור האינטראקציה זוהה על ידי ניסויי ChIP28,29. טכניקת ChIP משמשת לניתוח האינטראקציה של חלבון עם ה- DNA הקוגניט שלו בתוך התא. מטרתו היא לקבוע אם חלבונים ספציפיים, כגון גורמי שעתוק על מקדמים או אתרי כריכת DNA אחרים, קשורים לאזורים גנומיים ספציפיים. החלבון הקשור לדנ"א מקושר לראשונה באמצעות פורמלדהיד. זה ואחריו בידוד של הכרומטין. הכרומטין המבודד מוצמד לשברים של 500 bp על ידי עיכול סוניקציה או נוקלאז, והחלבון הקשור לדנ"א הוא אימונופרציפיטאט באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבון. הקישור הצולב הפוך, והדנ"א מנותח באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR) או PCR כמותי בזמן אמת.
תוצאות ChIP הובילו להשערה כי SMARCAL1 אולי מתווך רגולציה תמלול על ידי גרימת שינוי קונפורמציה באזורי האמרגן של גנים אלה. ממפה QGRS ותוכנת Mfold שימשו לזיהוי הפוטנציאל של אזורי מקדם אלה ליצור מבנים משניים28,29. ממפה QGRS משמש לחיזוי G-quadruplexes32, בעוד Mfold33 מנתח את היכולת של רצף ליצור מבנים משניים כגון לולאות גזע.
לאחר ניתוח מבנה משני, ניסויי במבחנה נוספים בוצעו עם רקומביננטי 6X ATPase A דומיין פעיל תלוי DNA (ADAAD), ההומולוג בקר של SMARCAL1, מטוהר Escherichia coli34. בדיקות ATPase בוצעו באמצעות ADAAD כדי לקבוע כי רצפי DNA שזוהו יכול לשמש כמשפיעים28,29. לבסוף, ספקטרוסקופיה CD בוצעה כדי לפקח על השינויים הקונפורמציה המושרה במולקולת ה- DNA על ידי ADAAD28,29.
כדי להוכיח שפעילות ה-ATPase של החלבון חיונית לגרימת שינוי קונפורמציה במולקולת הדנ"א, נוספה חומצה אתילנדיאמין טטראאצטית (EDTA) ל-Chelate Mg+2 או ATPase פעיל תלוי DNA A מעכב תחום Neomycin (ADAADiN), מעכב ספציפי של חלבון SWI/SNF, נוספה 35,36 . טכניקה ספקטרוסקופית זו CD ניתן להשתמש עם כל חלבון מטוהר כי הוכח על ידי ChIP או כל מבחנת רלוונטית אחרת להיקשר לאזור גנומי חזוי של מקדם.

<table><tbody><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>פישר מדעי</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט דיסודיום מלח הידרט</td><td>Sigmaaldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>CD קוורץ קובט</td><td>STARNA</td><td>21-Q-1</td><td></td></tr><tr><td>Chirascan V100 CD ספקטרומטר</td><td>יישומי פוטופיזיקה</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>EDTA דיסודיום מלח דיהידראט</td><td>SRL</td><td>43272</td><td></td></tr><tr><td>גלוטתיון ספרוז 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td>כרומטוגרפיה של זיקה לגלוטתיון</td></tr><tr><td>Hellmanex III תמיסת ניקוי Hellma</td><td></td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>L-Lactic Dehydrogenase</td><td>Sigmaaldrich</td><td>&nbsp; L2625</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום אצטט טטרהידרט</td><td>פישר מדעי</td><td>BP215-500</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט</td><td>פישר מדעי</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NADH מלח דיסודיום</td><td>סיגמאלדריץ'</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>פוספואנולפירובט מלח מונוציקלוהקסילאמוניום</td><td>SRL</td><td>40083</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן אצטט</td><td>פישר מדעי</td><td>P178-3</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate Kinase</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P1506</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>נטול מים Fisher מדעי</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בייסי מונוהידראט</td><td>פישר מדעי</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>סינרגיה HT קורא מיקרו-צלחת</td><td>BioTek</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Base Fisher מדעי</td><td>BP152-500</td><td></td></tr></tbody></table>

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין dna לחלבון

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

ספקטרוסקופיה של דיכרויזם מעגלי (CD) היא שיטה פשוטה ונוחה לחקור את המבנה המשני ואת האינטראקציות של ביומולקולים. ההתקדמות האחרונה בספקטרוסקופיית תקליטורים אפשרה לחקור אינטראקציות בין חלבון DNA ודינמיקה קונפורמציה של DNA במיקרו-סביבה שונה בפירוט להבנה טובה יותר של ויסות התמלול ב- vivo. האזור סביב אזור תמלול פוטנציאלי צריך להיות לא אחיד כדי שתעתיק יתרחש. זהו תהליך מורכב הדורש תיאום של שינויים histone, כריכה של גורם שעתוק ל- DNA, ופעילויות אחרות שיפוץ כרומטין. באמצעות ספקטרוסקופיה CD, ניתן ללמוד שינויים קונפורמציה באזור המקדם הנגרמים על ידי חלבונים רגולטוריים, כגון שיפוץ כרומטין תלוי ATP, כדי לקדם שעתוק. ניתן לעקוב אחר השינויים הקונפורמציה המתרחשים בחלבון. בנוסף, ניתן לטפל בשאילתות לגבי הזיקה של החלבון לדנ"א היעד שלו ולייחודיות הרצף שלו על ידי שילוב מוטציות בדנ"א היעד. בקיצור, ההבנה הייחודית של שיטה רגישה וזולה זו יכולה לחזות שינויים בדינמיקה הכרומטית, ובכך לשפר את ההבנה של רגולציה תמלול.

ADAAD מייצב מבנה דמוי לולאת גזע על מקדם MYC ראיות ניסיוניות קודמות הראו כי SMARCAL1 הוא רגולטור שלילי של MYC29. ניתוח של אזור המקדם הארוך של 159 bp של הגן MYC על ידי ממפה QGRS הראה כי לגדיל הקדמי יש פוטנציאל ליצור G-quadruplex (טבלה 2). ספל הראה כי שני גדילי ה- DNA MYC יכולים ליצור מבנה דמוי לולאת גזע (טבלה 2). רצף דנ"א באורך 34 bp המכיל את ה-G-quadruplex (GECE) ה...

האינטראקציה של שיפוץ כרומטין תלוי ATP עם ליגנד DNA מתוארת באמצעות ספקטרוסקופיה CD. ניתן להשתמש בשינויים הקונפורמציה המושרים על מקדם גנים שניתח על ידי הפסגות שנוצרו כדי להבין את מנגנון הרגולציה התמלולית.

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

הפרוטוקול מאפשר לנו לדמיין את השינויים בארגון מחדש השני של DNA המושרה על ידי חלבוני שיפוץ כרומטין תלויי ATP. השינוי במבנה הדנ"א יכול להיות מתואם לרגולציית התמלול. זוהי טכניקה קלה ורגישה מאוד המשתמשת בכמות קטנה מאוד של DNA טהור כדי לתעד את השינויים המבניים באוליגונוקלאוטיד.שיטה זו יכולה לספק תובנה על ויסות שעתוק בתיווך חלבוני שיפוץ כרומטין תלויי ATP. כדי להתחיל, להכין את ריכוזי העבודה של חוצצים ורכיבי תגובה אחרים טרי ולשמור אותם בארבע מעלות צלזיוס לפני הגדרת התגובות, ולאחר מכן למדוד את פעילות ATPase של החלבון בנוכחות מולקולות DNA שונות באמצעות NADH מצמיד בדיקת חמצון. מערבבים ADAAD 0.1 מילימולר, ATP שני מילימולרים, 10 ננומולר DNA, ו 1X REG חוצץ בצלחת 96 טוב לנפח סופי של 250 microliters.לאחר מכן, לדגור על התגובה במשך 30 דקות בחממה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן למדוד את כמות NAD + באמצעות התוכנה המסופקת יחד עם קורא microplate. כדי למדוד את הספיגה ב 340 ננומטר, לחץ על ת.ד. את naDH assay ומניח את צלחת 96-well על מחזיק הצלחת במכשיר, ולאחר מכן לחץ על כפתור לוח הקריאה כדי להקליט את הספיגה. אסוף את ספקטרום התקליטור בקובטות קוורץ בשקיפות גבוהה.השתמש בקובטים מלבניים או גליליים. כדי לנקות את cuvettes, לשטוף אותם עם מים מספר פעמים, ולאחר מכן לקחת סריקה של המים או חוצץ cuvette כדי לבדוק אם זה נקי. לתגובות, השתמש באוליגונוקלאוטידים מטוהרים בדנ"א.לקירור מהיר, מחממים את הדנ"א ב-94 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות על בלוק החימום ומקררים אותו מיד על קרח. לקירור איטי, לאחר חימום ה- DNA ב 94 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות, אפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר בקצב של מעלה אחת צלזיוס לדקה. כדי להקליט את הספקטרום הבסיסי, להגדיר בסך הכל חמש תגובות בקרה אחד אחד בצינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר.שמור את נפח התגובה על 300 מיקרוליטרים בכל התגובות. כדי להקליט את ספקטרום התקליטור, להגדיר בסך הכל חמש תגובות ניסיוניות אחד אחד בצינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר. כדי להקליט את הסריקה, הפעל את הגז והפעל את ספקטרומטר התקליטור.לאחר 10 עד 15 דקות, להפעיל את המנורה, להפעיל את אמבט המים ולהגדיר את טמפרטורת המחזיק על 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, פתח את תוכנת ספקטרום התקליטורים והגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס, את טווח אורך הגל ב-180 עד 300 ננומטר, את הזמן לנקודה ל-0.5 שניות ואת מספר הסריקה לחמש, ואז לחץ על מציג הנתונים המקצועי, צור קובץ חדש ושנה את שמו לפרטי הניסוי והתאריך. לאחר מכן, מערבבים את התגובות הבסיסיות והניסוי על ידי צנרת ומעבירים בזהירות את תערובות התגובה בזה אחר זה לקובט, ומבטיחים שאין בועות אוויר.אם מבצעים ניסוי בקורס זמן, לדגור את התגובות ב 37 מעלות צלזיוס לזמן הנדרש, ואז לקחת את הסריקה. הוסיפו את EDTA למאגר המכיל את הדנ"א, ה-ATP, המגנזיום והחלבון כדי לעצור הידרוליזה של ATP. כדי לעכב לחלוטין את פעילות ATPase, להגדיל את ריכוז EDTA וזמן הדגירה.הפחת את קווי הבסיס מהתגובות המתאימות בתוכנה והחליק את הנתונים בתוכנת ספקטרום התקליטורים או בתוכנת התוויית הנתונים, ולאחר מכן התווה גרף של אורך גל כנגד אליפטיות שאריות ממוצעת וניתח את הפסגות. קפלי M הראו כי שני גדילי ה- DNA MYC יכולים ליצור מבנה דמוי לולאת גזע. המבנים המקפלים M של רצף ה- DNA הקדמי וההפוך המכיל את G quadruplex GECE מוצגים כאן.ספקטרום התקליטור של GECE מקורר במהירות בהיעדר ונוכחות של ATP ו ADAAD הראה כי ADAAD גורמת שתי פסגות חיוביות, אחד ב 258 ננומטר והשני ב 210 ננומטר. התוספת של EDTA שוללת שינוי קונפורמציה זה. ספקטרום התקליטורים יש עכשיו שיא שלילי 210 ננומטר ופס חיובי רחב עם פסגות ב 230 ו 250 ננומטר.ממפה QGRS וניתוח קיפול M הראו כי אזורי האמרגן של DROSHA, DGCR8 ו- DICER הם בעלי פוטנציאל ליצור G מרובע ומבנים דמויי גזע. ספקטרום התקליטורים של זוג DROSHA חמש הראה כי ADAAD גרים שיא שלילי ב 210 ננומטר ושיא חיובי ב 260 ננומטר. ספקטרום זה הוא מאפיין של ADNA.ספקטרום התקליטורים של זוג DGCR8 אחד הראה שיא חיובי ב 210 ננומטר ושיא שלילי רחב ב 260 ננומטר. ספקטרום זה אופייני למעבר B עד X. עבור זוג DGCR8 שבע, שיאים חיוביים חזקים ב 210 ו 270 ננומטר ושיא שלילי ב 250 ננומטרים נראו.ספקטרום זה אופייני למבני דנ"א מקבילים של G מרובע. לבסוף, עבור זוג DICER אחד, שיא חיובי ב 210 ננומטר ושתי פסגות שליליות, אחד ב 230 ננומטר והשני ב 260 ננומטר נצפו. פסגות אלה אופייניות למעבר A עד X DNA.ודא כי טוהר ה- DNA והחלבון הוא 99% או יותר. cuvette צריך להיות נקי ואת הבסיס צריך להיות פחות מ millidegree אחד. כל הריאגנטים צריכים להיות טהורים כך שהרקע הוא פחות ממילימטר אחד.

cd-spectroscopy-to-study-dna-protein-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בסרטון זה, אנו מתארים את שיטת האימונופלואורסנציה כדי לדמיין את הלוקליזציה של חלבוני תיקון הדנ"א γH2AX ו- 53BP1 באתרים של הפסקות DNA דו-גדילי בגרעין התא המוקרנ.

הדמיה מבוססת אימונופלואורסנציה של אינטראקציות חלבון תיקון DNA

סרטון זה מדגים את טכניקת ספקטרוסקופיית הדיכרואיזם המעגלי (CD) לחקר שינויים קונפורמטיביים המתרחשים בדנ"א בנוכחות חלבון עיצוב מחדש של כרומטין תלוי ATP. השינויים בספקטרום ה-CD שנמדדו בנוכחות ובהיעדר הידרוליזה של ATP מצביעים על חשיבותו של ATP ביכולתו של המשפץ לגרום לשינויים קונפורמטיביים בדנ"א הכבול.

טכניקת ספקטרוסקופיית הדיכרואיזם המעגלי לחקר אינטראקציות DNA-חלבון

פלואורימטריית סריקה דיפרנציאלית היא שיטה בשימוש נרחב לסינון ספריות של מולקולות קטנות לאינטראקציות עם חלבונים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה להרחבת ניתוחים אלה כדי לספק אומדן של קבוע הדיסוציאציה בין מולקולה קטנה לשותף החלבון שלה.

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות גמורה (TIRFM) באמצעות מצע DNA λ ששונה site-specifically נקודה קוונטית הנקרא חלבון.

להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ו- DNA λ ששונה Site-specifically ברמת מולקולה בודדת

אנו מציגים תהליך עבודה ניסיוני של פרוטוקול וניתוח נתונים לביצוע פלואורסצנטיות צולבת של תאים חיים (FCCS) בשילוב עם העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) כדי לחקור דינמיקה של קולטני ממברנה בתאים חיים באמצעות טכניקות תיוג פלואורסצנטיות מודרניות.

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

מסך DNA, טכניקת הדמיה של מולקולות בודדות בתפוקה גבוהה, מספק פלטפורמה להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-דנ"א מגוונות. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בטכניקת מסך הדנ"א כדי לחקור את התפקיד הביולוגי והמנגנון המולקולרי של Abo1, סכיזוסקרומיצס פומבה ברומודומיין המכיל AAA+ ATPase.

פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך DNA

מאמר זה מתאר פרוטוקול לחקר אינטראקציות דנ"א-חלבון באמצעות מערכת אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין (BLI). הוא מתאר את השלבים והשיקולים החיוניים לשימוש בקינטיקה מחייבת בסיסית או מתקדמת כדי לקבוע את זיקת קשירת שיווי המשקל (KD) של האינטראקציה.

ניתוח אינטראקציות DNA-חלבון עם אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין

פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית לזיהוי הקישור בין תרכובות ומולקולות חלבון, ומציע את היתרונות של אובדן דגימת חלבון מינימלי ודיוק נתונים גבוה.

זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית

פרוטוקול זה מתאר בדיקת שכפול DNA חד-מולקולה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות בין פולימראזות DNA ומכשולים כגון מבני G-quadruplex.

הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת של דינמיקת DNA פולימראז ב-G-quadruplexes

פרוטוקול זה מספק פעולות מפורטות על הכנת דגימות, איסוף נתונים וניתוח ספקטרום פלואורסצנציה פנימי של DNA.

הדמיה סופר-רזולוציה ספקטרוסקופית של מולקולות DNA באמצעות ניגוד פנימי

חקור שינויים מבניים ב-DNA המושפעים מחלבוני ATP-dependent chromatin remodeling באמצעות ספקטרוסקופיית CD. שיטה זו מספקת תובנות לגבי מנגנוני ויסות השעתוק בביולוגיה מבנית.

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון

גלה סרטונים נוספים