Name: מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (NEPTUNE) ביום עוברי 7.5 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: למדו את פרוטוקול NEPTUNE להזרקת לנטיווירוס לחלל האמניוטי בעכבר ביום עוברי 7.5. שיטה זו מאפשרת שיבוט גנטי אחיד של הצלחת העצבית עם השפעות מזעריות על ההתפתחות העוברית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לבטינה סמש וג'יה סאן (Infinigene) על טיפול מומחה בעכברים; פלוריאן סלומונס וגורן מנסון מ-Biomedicum Imaging Core (BIC) לסיוע ברכישת תמונות וייעוץ. מימון: אנו מודים למממנים הבאים על תמיכתם בפרויקט זה: מועצת המחקר השוודית, מכון קרולינסקה (קרנות KI, מענק לפיתוח קריירה, מימון KID לדוקטורנטים, ומימון SFO StratNeuro, המרכז לרפואה חדשנית), קרן אולי ואלוף אריקסון, קרן טורנשפירן, קרן ג'ינסונס, פרס סוון ו-אבה-כריסטינה האגברגס ומענק מחקר, מענק פרויקט קנוט ואליס ולנברג, קרן פרדריק ואינגריד תורינגס, לארס הירטס מיין, הקרן לסרטן בילדות (Barncancerfonden), קרן אוהלן, קרן אקה ויברגס, קרן טורה נילסונס ומענק ההתחלה של הקרנות השוודיות ל-ERA. איור 4D,E נוצרו עם BioRender.com.

<ol><li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheiler%2C+K+%22The+House+mouse.+Atlas+of+embryonic+development%22">The House mouse. Atlas of embryonic development</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1989).</li>
<li>Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarresi%2C+MJF+%22Developmental+biology%22">Developmental biology</a>. , Sinauer Associates Inc. Publishers. Sunderland, Massachusetts. (2016).</li>
<li>Taylor, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+success+of+clinical+genome+sequencing+across+a+broad+spectrum+of+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders.</a> Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).</li>
<li>Pizzo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+variants+in+the+genetic+background+modulate+cognitive+and+developmental+phenotypes+in+individuals+carrying+disease-associated+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants.</a> Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).</li>
<li>Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurulation+in+the+mouse%3A+Manner+and+timing+of+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure.</a> The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).</li>
<li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+and+bending+of+the+avian+neuroepithelium%3A+Morphometric+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses.</a> Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).</li>
<li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analyses+of+neuroepithelial+cell+shapes+during+bending+of+the+mouse+neural+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate.</a> Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).</li>
<li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li>
<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).</li>
<li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047(2010).</li>
<li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).</li>
<li>Slevin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ultrasound-guided+microinjection+for+interventional+studies+of+early+embryonic+and+placental+development+in+vivo+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice.</a> BMC Developmental Biology. 6, 10(2006).</li>
<li>Mangold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+manipulation+of+nervous+system+gene+expression+with+NEPTUNE%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE.</a> Cell Reports Methods. 1, 100043(2021).</li>
<li>Kameneva, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+human+embryos+identifies+multiple+sympathoblast+lineages+with+potential+implications+for+neuroblastoma+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin.</a> Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).</li>
<li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li>
<li>Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+brain-directed+AAV+gene+therapy+results+in+rapid%2C+robust%2C+and+persistent+transduction+of+mouse+choroid+plexus+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101(2013).</li>
<li>Heavner, W., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+development+and+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Eye development and retinogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391(2012).</li>
<li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, 103947(2013).</li>
<li>Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+histology+of+rodent+and+human+major+salivary+glands%3A+-overview+of+the+Japan+Salivary+Gland+Society-sponsored+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica+et+Cytochemica%22%5BJournal%5D)">Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).</li>
<li>Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+contribution+to+lingual+mesenchyme%2C+epithelium+and+developing+taste+papillae+and+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds.</a> Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).</li>
<li>Marmigère, F., Ernfors, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+and+connectivity+of+neuronal+subtypes+in+the+sensory+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).</li>
<li>Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+the+bHLH+factor+neurogenin-2+marks+a+subpopulation+of+neural+crest+cells+biased+for+a+sensory+but+not+a+neuronal+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).</li>
<li>Portales-Casamar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+toolbox+of+MiniPromoters+to+drive+selective+expression+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).</li>
<li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li>
<li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

ישנם מספר שלבים בפרוטוקול זה המשפיעים על ההישרדות העוברית, על איכות הזריקות ועל הקריאה. גיל ההיריון של העוברים מוגדר כ- E0.5 בצהרי היום של תקע הנרתיק לאחר הזדווגות לילה. ביצוע בדיקת אולטרסאונד להריון ב- E6.5 בשעות אחר הצהריים המאוחרות / ערב מבטיח כי העוברים מפותחים מספיק כדי להיות מזוהים על ידי אולטרסאונד. הבדיקה (1) מאפשרת סינון מראש של מספר העכברים החיוביים לתקע בהריון, (2) מוודאת שאף וירוס לא מופשר שלא לצורך ומבוזבז במקרה שעכברות בעלות תוסף חיובי אינן בהריון, ו-(3) מפחיתה התערבויות מיותרות בעכברים (נמנעת מניתוח בנקבות שאינן בהריון).
ב- E7.5, העוברים רגישים לכוחות חיצוניים ויש לטפל בהם בזהירות. לדוגמה, משיכת קרני הרחם או סחיטת ה- deciduas יכולים להוביל לספיגת עוברים. רקמת הרחם צריכה תמיד להישמר לחה כאשר מחוץ לבטן הנשית כדי למנוע את התייבשות הרקמה. רוב המחליטים צריכים להישאר בתוך הבטן הנשית, כאשר רק 3-4 חשופים לזריקות. חדות המחט היא גורם מכריע נוסף להזרקות מוצלחות. קצות מחט קהים או שבורים גורמים לניקוב חוזר ונשנה של deciduas או דחיסה כנגד חימר המידול לפני הכניסה ל- AC, מה שעלול להגביר את קצב הספיגה. לכן, מחטים טחונות היטב וחדות תמיד צריך להיות מאוחסן בבטחה ולהחליף לאחר מקסימום של 2 נקבות.
פרוטוקול זה מתאר כיצד למקד את הצלחת העצבית בזריקה אחת בודדת של לנטי-וירוס. יתר על כן, הוא מראה כיצד ניתן להתאים את יעילות ההתמרה משיבוטים חד-תאיים למוח כולו. עם זאת, רקמות אחרות שאינן עצביות, כולל העור ואפיתל הפה, ממוקדות גם כן. בנוסף, כל סוגי התאים (אבות ותאים ממוינים) מתמרים, מה שהופך גישה זו ליעילה אך לא ספציפית. השימוש ב- MiniPromoters במבנה הנגיפי מוביל לביטוי הספציפי של הטרנסגן בנוירונים או באסטרוציטים15. יש לכך יתרון בכך שהוא נמנע משימוש בחיות Cre מהונדסות ייעודיות ולכן מקטין את כמות העבודה (תחזוקת זנים וגנוטיפ) ואת העלויות.
המגבלות של NEPTUNE כוללות את הקושי הטכני שלה, אתגרים בהשגת נשים הרות בקצב צפוי ועקבי, ואת העלויות של רכישת מכשור מיוחד. יתר על כן, ניתן לראות במיקוד לא סלקטיבי של תאים על ידי lentivirus גם יתרון וגם מגבלה של הטכניקה. הזרקה של נפחים גדולים יותר לתוך AC גורמת exencephaly13, אם כי מומים במוח exencephaly נמנעים עם כרכים המתוארים כאן15. השפעה שלילית על התפתחות המוח היא אפוא סיכון עם ננו-זריקות ברחם שיש להימנע מהן בזהירות על ידי הזרקת נפחים נכונים המותאמים לשלב העוברי ולגודל AC.
התאמות עתידיות של הטכניקה עשויות להתמקד בטרופיזם ויראלי. לנגיפים הקשורים לאדנו (AAVs) יש סרוטיפים שונים, שהוכחו כמכוונים בחוזקה לסוגי תאים שונים במערכת העצבים המרכזית17,26. עם זאת, AAVs אינם משתלבים בגנום התא המארח ולכן עלולים ללכת לאיבוד בתאים עם קצב חלוקה גבוה. למרות שישנן מספר דרכים להגדיל את הספציפיות של NEPTUNE, בעלי חיים מהונדסים הם עדיין תקן הזהב כשמדובר מניפולציה גנים in vivo. עכברי Cas9 ו-lentivirus המקודדים ל-sgRNA שימשו לבדיקה גנטית באפידרמיס העוברי27 ועשויים להיות מותאמים גם למערכת העצבים המרכזית המתפתחת.
זריקות ל-AC ב-E7.5 מכוונות ביעילות לתאים של הנוירואקטודרם לפני תחילת הנוירולציה ומכוונות למוח המתפתח בצורה יעילה יותר מאשר באלקטרופורציה של הרחם . זה מאפשר לחקור רמזים גנטיים החשובים להתפתחות המוח מנקודת זמן מוקדמת יותר. בניגוד למודלים גנטיים קלאסיים של עכברים, NEPTUNE מציעה גישה גמישה לביצוע ניתוח גנים פונקציונלי. פנוטיפים בעקבות ביטוי יתר או מחיקת גנים ניתן לחקור תוך ימים עד שבועות בהשוואה לחודשים או שנים. זריקות של מבנים נגיפיים מרובים מאפשרות מניפולציה של מספר גנים בתוך עובר אחד ומונעות יצירת חיות נוקאאוט כפולות או משולשות. לכן, NEPTUNE לא רק חוסך זמן אלא גם יכול להפחית את מספר בעלי החיים המשמשים במחקר.

המוח וחוט השדרה הם בין האיברים הראשונים שהחלו להיווצר במהלך העובר 1,2. למרות שהגנים הקשורים להפרעות נוירו-התפתחותיות מזוהים, החקירה התפקודית של וריאנטים גנטיים פיגרה אחרי 3,4. מכיוון שיצירת עכברי נוקאאוט מותנים יכולה להימשך חודשים או שנים, טכניקה חלופית לחקור במהירות את תפקוד הגנים במוח המתפתח מעניינת. בעוברי עכברים, נוירולציה - התהליך המורפוגנטי שבו הצלחת העצבית הופכת לצינור העצבי כדי להוליד את מערכת העצבים המרכזית (CNS) - מתרחשת בין הימים 8 ל -10 לאחר ההתעברות5. לפני תחילת הנוירולציה, הלוח העצבי, כחלק מהאקטודרם, מורכב משכבה אחת של תאי עמודה שיתפשטו ויתמינו לסוגי תאי הנוירונים והגלייה הרבים בתוך מערכת העצבים 6,7. לכן, כדי לגרום באופן ניסיוני לשינויים ארוכי טווח בביטוי גנים במערכת העצבים המרכזית, מיקוד הלוח העצבי מציע יתרונות ברורים, כולל הנגישות של כל תאי האב.
במדעי המוח, באלקטרופורציה של ovo 8,9 והתמרה ויראלית של עוברי עכברים שימשו למניפולציה של ביטוי גנים עובריים של CNS. עובר האפרוח המתפתח היה מודל בחירה לחקר תפקוד הגן במהלך התפתחות חוט השדרה בשל הנגישות של עובר האפרוח בביצית והקלות הנובעת מכך של מניפולציה של ביטוי גנים. בפרט, ב ovo פלזמה אלקטרופורציה מייצרת תנאי ניסוי ובקרה בכל חוט השדרה אפרוח. אלקטרופורציה גורמת לחדירת קרום התא ומכוונת את הדנ"א הטעון שלילית הרחק מהקתודה (השלילית) לעבר האנודה (החיובית) על ידי הפעלת פולס חשמלי באמצעות שתי אלקטרודות על העובר. בעכברים, אלקטרופורציה ברחם הוגבלה בדרך כלל לשלבים עובריים שבהם הנוירולציה הושלמה, והמוח או חוט השדרה כבר מורכבים מכמה שכבות תאים, וכתוצאה מכך יעילות אלקטרופורציה נמוכה10. אלקטרופורציה פלסמידית גורמת לביטוי גנים חולף ובדרך כלל מכוונת לתאים מעטים.
מונחה אולטרסאונד במיקרו-הזרקות ברחם שימש למניפולציה של מבנים עובריים שונים כגון העור והמוח11,12,13,14. עם זאת, זריקות המכוונות ל-CNS המורין המתפתח הראו יעילות נמוכה או השפיעו לרעה על ההישרדות העוברית12,13,14. לכן, פותח פרוטוקול משופר להעברת לנטיוירוס בעל טיטר גבוה לתוך חלל מי השפיר (AC) ב- E7.5, אשר כונה NEPTUNE עבור neural plate targeting עם in uteronano-injection15. זריקות הביאו ליעילות מיקוד ארוכת טווח של >95% מהמוח כולו ב-E13.5. יתר על כן, הוכנס שלב בימוי במהלך אימות אולטרסאונד של הריון כדי למיין נקבות והריונות לפי שלב התפתחותי כדי למזער הליכים מיותרים על חיות מחקר ולמקסם את הצלחת ההזרקה. יעילות ההזרקה והישרדותה קשורות קשר הדוק לעלייה בגודל זרם החילופין. לכן, מאמר זה מתאר כיצד למדוד את גודל ה-AC לפני ההזרקה כדי לספק נפח מתאים ל-AC שלא יגרום לספיגה מחדש של העובר. NEPTUNE הוא חלופה חזקה לגישות הנוכחיות ברחם וניתן להתאים אותו למספר שימושים, כולל, אך לא רק, רווח ואובדן של מחקרי תפקוד, מעקב אחר שושלת או סינון15,16.

<table><tbody><tr><td>מזרק 1 מ"ל</td><td>BD Bioscience</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>27 גרם מחט</td><td>BD Bioscience</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>3.5 אינץ' נימים</td><td>Drummond Scientific</td><td>3000203G/X</td><td>שימשו למשיכת מחטי בית</td></tr><tr><td>70 מגה-הרץ מתמר מסדרת MS</td><td>Visual Sonics</td><td>MS700</td><td></td></tr><tr><td>Aquasonic ג'ל אולטרסאונד שקוף</td><td>מעבדות פרקר</td><td>מרץ-50</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip Applier 9 מ"מ</td><td>Angthos</td><td>12020-09</td><td></td></tr><tr><td>CD1 עכברים</td><td>צ'ארלס ריבר, גרמניה</td><td>Crl:CD1(ICR)</td><td>נקבות: מגיל 8 שבועות זכרים: מגיל 12 שבועות</td></tr><tr><td>צמר גפן</td><td>OneMed Sverige AB</td><td>120788</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים חבישה עדינים ישרים 13 ס"מ</td><td>Agnthos</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>EG-400 Narishige מטחנת מיקרופיפטה Narishige</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EZ קליפסים 9 מ"מ</td><td>Angthos</td><td>59027</td><td>מספריים</td></tr><tr><td>איריס, סופר קאט, ישר, 9 ס"מ</td><td>Agnthos</td><td>307-336-090</td><td></td></tr><tr><td>איזופלואורן</td><td>בקסטר רפואי AB</td><td>EAN: 50085412586613</td><td>נרכש מבית המרקחת השוודי</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clarke</td><td>7557</td><td></td></tr><tr><td>סרט ממברנה</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11053</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>דוגמנות Clay</td><td>Sense AB</td><td>10209</td><td></td></tr><tr><td>שולחן טיפול בעכבר</td><td>Visual Sonics</td><td>50249</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II ערכת מזרק אוטומטי</td><td>Drummond</td><td>3-000-205A</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>צלחת פטרי Bemis</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>עם פתח מרכזי (קיר נמוך)</td>צלחת פטרי <td>Visual Sonics</td><td>SA-11620</td><td></td></tr>, <tr><td>(&Oslash; xH): 92 x 16 מ"מ</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Reli+On Virkon</td><td>DuPont</td><td>130000132037</td> חומר <td>חיטוי</td></tr><tr><td>קרום סיליקון</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11054</td><td></td></tr><tr><td>Steri 250, מעקר חרוזים חם</td><td>Angthos</td><td>31100</td><td></td></tr><tr><td>סרט כירורגי (1.25 ס"מ x 9.14 מ')</td><td>Medicarrier</td><td>67034</td><td></td></tr><tr><td>Vevo קומפקט כפול (Med. Air & O2) מערכת הרדמה</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-12055</td><td></td></tr><tr><td>Vevo Imaging Station 2</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-11983</td><td></td></tr><tr><td>Vevo2100</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-20047</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 6-0; מחט C-3, נימה סגולה 45 ס"מ</td><td>Agnthos</td><td>J384H</td><td></td></tr></tbody></table>

מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (neptune) ביום עוברי 7.5

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

מניפולציה של ביטוי גנים במוח העכבר המתפתח ברחם טומנת בחובה פוטנציאל גדול למחקרים בגנטיקה תפקודית. עם זאת, בעבר הוא הוגבל במידה רבה למניפולציה של שלבים עובריים לאחר הנוירולציה. פותח פרוטוקול להזרקת חלל מי השפיר ביום העוברי (E)7.5 ולהעברת לנטי-וירוס, קידוד cDNA או shRNA, תוך התמקדות ב->95% מהצלחת העצבית ותאי הצמרת העצבית, מה שתורם למוח, לחוט השדרה ולמערכת העצבים ההיקפית בעתיד. פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים להשגת התמרה מוצלחת, כולל שחיקה של מחטי נימי הזכוכית, אימות הריון, היערכות התפתחותית באמצעות הדמיית אולטרסאונד, ונפחי הזרקה אופטימליים המותאמים לשלבים עובריים. 
בעקבות פרוטוקול זה, ניתן להשיג התמרה של >95% מהמוח המתפתח עם lentivirus גבוה titer ובכך לבצע מניפולציה גנטית של מוח שלם. לעומת זאת, ניתן להשיג התמרת פסיפס באמצעות טיטרים נגיפיים נמוכים יותר, מה שמאפשר סריקה גנטית או מעקב אחר שושלת. ההזרקה ב-E7.5 מכוונת גם לאקטודרם ולפסגה העצבית התורמת לתאים שונים של העין, הלשון ומערכת העצבים ההיקפית. טכניקה זו מציעה אפוא את האפשרות לתמרן את ביטוי הגנים ברקמות שמקורן בלוחות עצביים ובאקטודרמים של עכברים משלבי קדם-נוירולציה, עם היתרון של הפחתת מספר העכברים המשמשים בניסויים.

עוברים שהוזרקו ב-E7.5 עם hPGK-H2B-GFP lentivirus11,12 נאספו ב-E13.5 ונבדקו תחת מיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי (איור 5A). התמרה מוצלחת של הלוח העצבי גורמת לעוברים עם ביטוי חזק של כתב פלואורסצנטי במוח בעיקר וברקמות אחרות שמקורן באקטודרם, למשל העור (איור 5A,B). הזרקה של נפח גבוה מדי (גדול מהנפחים המומלצים כאן, למשל ≥500 nL) מגבירה את הלחץ בזרם החילופין ויכולה לגרום לספיגה מלאה (נתונים שאינם מוצגים) או לפגמים בתעלה העצבית כגון אקסנצפליה (איור 5A). זריקות מוצלחות ב-E7.5 גורמות להתמרה אחידה מהמוח הקדמי למוח האחורי (איור 5C-J).
titers Lentiviral סביב 2 × 1010 יחידות זיהומיות (IFU) להשיג מעל 95% מיקוד, בעוד titers של ~1 × 109 IFU להשיג 15% יעילות מיקוד15. בנוסף, מבנים שבעבר היה קשה לכוון אליהם באמצעות אלקטרופורציה, כגון מקלעת הכורואיד17,18, הם גם ממוקדים (איור 5 E,F). ניתן לשנות את יעילות ההתמרה על-ידי התאמת הטיטר הנגיפי המועבר ל-AC. זריקות של טיטר נמוך גורמות להתמרה של שיבוטים חד-תאיים (איור 5C, איור 5E ואיור 5G,H) בעוד שהשימוש בנגיף בעל טיטר גבוה מתמר כמעט ב-100% מהמוח כולו (איור 5D, איור 5F, איור 5H ואיור 5J ). לכן, NEPTUNE יכול לשמש להתמרה קלונית, מעקב אחר שושלות וגישות סינון גנטיות או לחקר ההשפעות הגלובליות של ביטוי יתר של גנים או הפחתת ויסות במוח כולו.
התפתחות העין של יונקים היא תוצאה של תקשורת מאורגנת היטב בין שלוש נגזרות של האקטודרם העוברי: הרשתית העצבית (NR) ואפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) נגזרים מהנוירואפיתל של המוח הקדמי הגחוני, בעוד שאקטודרם פני השטח מוליד את העדשה העתידית ואת אפיתל הקרנית. עם זאת, הסטרומה המרכזית והאנדותל האחורי, שתי השכבות האחרות של הקרנית, נגזרות מתאי פסגה עצביים של המזנכימה הפריוקלית19,20. מקטעים קורונליים דרך עוברי E13.5, שהוזרקו ב-E7.5 עם לנטי-וירוס בעל טיטר גבוה, הראו, בדומה למוח, התמרה גבוהה ואחידה של הרקמה העצבית של העין, כמו גם העדשה, הקרנית והמזנכימה (איור 5K). ככל שהנוירולציה מתקדמת, זריקות ב-E8.5 וב-E9.5 גורמות להמשך ההתמקדות בעדשה ובאפיתל הקרנית (איור 5L ואיור 5N), בעוד שטרנסדוקציה של רקמות העין שמקורן בנוירואקטודרם יעילה פחות ב-E8.5 (איור 5L,M) או לא מכוונת ל-E9.5 (איור 5N).
בעוד שרוב החלקיקים הנגיפיים מדביקים את הרקמות החשופות בעת ההזרקה, חלק מהחלקיקים מתמרים רקמות שמקורן שאינו אקטודרמלי שמתפתחות מאוחר יותר (איור 6A). בלוטות וצינורות הרוק מתפתחים סביב E11.5 מהאפיתל האוראלי21 וממוקדים ב-NEPTUNE (איור 6B). לאחר זריקות ב- E9.5, האפיתל הלשוני של הלשון מתמר היטב; עם זאת, המזנכימה הבסיסית היא שלילית (איור 6C; סוגריים מציינים תאים מתמרים; כוכביות מציינות אות אוטופלואורסצנטי ולא תאים מתמרים). בנוסף, ישנם אשכולות חיוביים בתוך האפיתל הלשוני, המופרדים על ידי מקטעים שליליים (איור 6C, ראשי חץ לבנים), מה שמרמז על התמרה של משטח הפפילה. תאי פסגה עצבית תוארו במזנכימה הלשון הבסיסית ובתוך האפיתל הלשוני, שם הם מעורבים בהתפתחות של פפילות טעם ובלוטות טעם22. ואכן, זריקות ב-E7.5 גורמות להתמרה נרחבת של המזנכימה של הלשון ב-E13.5 (איור 6D), מה שמרמז על כך שהזרקות מוקדמות מכוונות לתאי הצמרת העצבית, מה שתורם למזנכימה בלשון.
אצל בעלי חוליות, גרעיני השורש הגבי (DRGs) הם מרכיב מרכזי במערכת העצבים ההיקפית (PNS), שכן כל הקלט הסומטוסנסורי מהפריפריה של הגוף (טמפרטורה, כאב, לחץ) מועבר למוח באמצעות הפעלה של נוירוני DRG23. גם תאי העצב וגם תאי הגליה של ה-DRG מופקים מתאי הצמרת העצבית24. הזרקת Lentiviral, שבה מקדם ה-hPGK שנמצא בכל מקום שולט בביטוי של הכתב הפלואורסצנטי, מובילה למיקוד נרחב של מערכת העצבים המרכזית וההיקפית (איור 7A), תוך התמרת תאי עצב ואבות בחוט השדרה (איור 7B), כמו גם של ה-DRG (איור 7C). שימוש ב-MiniPromoter עבור דאבלקורטין25 מאפשר להגביל את ביטוי ה-GFP לתאי עצב בלבד (15 ואיור 7D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3.jpg"> איור 5: יעילות גבוהה או התמרה קלונית עם NEPTUNE. (A) עוברי E13.5 תחת מיקרוסקופ דיסקציה המוארים בתאורה סטנדרטית (פאנל שמאלי) ואותם עוברים מוארים עבור GFP (פאנל ימני). עובר לא מוזרק בקצה השמאלי, עובר מוזרק בהצלחה בקצה הימני, מניב אות חיובי במוח (העובר הימני ביותר). עובר אקסנצפלי עקב נפח עודף מוזרק (עובר אמצעי). (B) מיקוד העור והמוח באמצעות הזרקת E7.5. סרגל קנה מידה = 50 μm. (C, D) E13.5 תמונות קונפוקליות של המוח הקדמי עם התמרה קלונית נמוכה (C) או התמרה ביעילות גבוהה (D). (ג, ה, ז, א) התמרה קלונאלית של אזורים שונים במוח. (ד, ו, ח, י) התמרה ביעילות גבוהה של אזורים שונים במוח. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. יעילות התמרה שונה מייצגת תחומים אחרים של מערכת העצבים המרכזית. (ה, ו) מיקוד מקלעת כורואיד, באופן משובט (E) או ביעילות גבוהה (F). פסי קנה מידה = 200 μm. (G, H) מיקוד קלונאלי (G) ומיקוד ביעילות גבוהה (H) של המוח האחורי, מוגדל ב- (I, J). פסי קנה מידה = 200 μm. (K) ביטוי כתב GFP בעין ב- E13.5 לאחר הזרקת רחם ב- E7.5 (L, M) ביטוי כתב GFP בעין ב- E15.5 לאחר הזרקת רחם ב- E8.5 (L), אזור קופסה מוגדל ב- (M), או ב- E9.5 (N). כלי דם אוטופלואורסצנטיים מסומנים בכוכבים לבנים. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: NEPTUNE = neural plate targeting עם in uteronano-injection; C = קרנית; LE = אפיתל עדשה; LF = סיבי עדשה; M = Mesenchyme; NR = רשתית עצבית; ON = עצב הראייה; RPE = אפיתל פיגמנט רשתית; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; CNS = מערכת העצבים המרכזית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig06.jpg"> איור 6: בהתמרת רחם של רקמות לא עצביות. (A) תמונה קונפוקלית של חלל הפה E15.5. לעובר הוזרק נגיף כתב פלואורסצנטי ב-E9.5. סרגל קנה מידה = 200 μm. (B, C) (B) הגדלה של לוח הכניסה; אפיתל צינור הרוק מומר עם וירוס. (ג) הגדלה של לוח משובץ; אפיתל לשוני גבי מומר עם וירוס כתב GFP (סוגר לבן). המזנכימה הבסיסית שמקורה בתאי הצמרת העצבית היא שלילית. ראשי חץ לבנים מציינים פפילה עם תאי פסגה עצביים שליליים המוקפים בתאי אפיתל מותמרים של וירוסים (תאי דם/כלי דם אוטופלואורסצנטיים מסומנים בכוכבים לבנים). פסי קנה מידה = 50 μm. (D) תמונה סכמטית וקונפוקלית של מזנכימה של לשון E13.5 לאחר זריקות עם וירוס מדווח פלואורסצנטי ב- E7.5. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: D = דורסל; M = Mesenchyme; N = Nasopharynx; SLD = צינור תת-לשוני; SMD = צינור תת-מנדיבולרי; T = לשון; V = גחון; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig07.jpg"> איור 7: התמרה של תאי גנגליון שורש גביים שמקורם בצמרת עצבית. (A) מיקוד NEPTUNE ב-E7.5 מאפשר מיקוד הן של מערכת העצבים המרכזית והן של PNS. (B) תמונה קונפוקלית של חוט השדרה E13.5 ו-DRGs המוזרקים עם hPGK-H2B-GFP כתב lentivirus ב-E7.5 מראה התמרה של שני אבות עצביים SOX2+ ונוירונים NeuN+. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (C) אזור בקופסה של B המציג את ה-DRG עם ביטוי GFP באוכלוסיות התאים SOX2+ (חצים לבנים) ו-NeuN+ (ראשי חץ לבנים). סרגל קנה מידה = 20 μm. (D) תמונה קונפוקלית של חוט השדרה E13.5 ו- DRG מוזרק עם DCX-H2B-GFP lentivirus ב- E7.5, המכוון לתאי DCX+ בלבד. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (E) אזור בקופסה של D המציג DRG עם ביטוי GFP המוגבל לנוירוני DCX+ (ראשי חץ לבנים). DCX- תאים שליליים עבור GFP (חצים לבנים). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: NEPTUNE = neural plate targeting עם in utero nano-injection; CNS = מערכת העצבים המרכזית; PNS = מערכת העצבים ההיקפית; DRGs = גרעיני שורש הגב; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להזריק לעכבר את חלל מי השפיר ב-E7.5 עם לנטי-וירוס, מה שמוביל להתמרה אחידה של כל הצלחת העצבית, עם השפעה מזיקה מינימלית על ההישרדות או ההתפתחות העוברית.

מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (NEPTUNE) ביום עוברי 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

NEPTUNE מאפשר מיקוד ומניפולציה גנטית של מערכת העצבים העוברית של העכבר מהיום העוברי 7.5 ומאפשר יצירת מודלים של איתור נוק-דאון או שושלת בימים. פרוטוקול זה ניתן להתאמה, גמיש ומהיר. אנו יכולים לספק ספריות נגיפיות shRNA, cdRNA או ברקוד כדי לענות על שאלות שונות בימים ולא בחודשים או שנים.אנו מצפים ש-NEPTUNE יספק תובנות במדעי המוח, אך ניתן יהיה להתאים אותו גם למערכות איברים אחרות. זיהוי חלל מי השפיר יכול להיות מאתגר למדי, אז קח את הזמן שלך להסתכל על תמונת האולטרסאונד ואולי יש ספר לימוד או משאב אנטומיה אחר בהישג יד. כדי להתחיל להעמיס את המחט, החליקו את מחט הזכוכית על בוכנת המתכת, תוך שמירה על קולט מחובר אך משוחרר מעט.לאחר מכן, דחפו את המחט הנימית יחד עם בוכנה המתכת דרך האטם הקדמי עד שהיא מגיעה למרווח. לחצו על Empty כדי לדחוף את הבוכנה לתוך המחט ולהוציא את השמן מקצה המחט. לאחר מכן לחצו על Fill כדי ליצור בועת אוויר, המחלקת את השמן ואת התמיסה.לבסוף, הורידו את המחט, טבלו את הקצה בתמיסה, ולחצו שוב על Fill כדי לטעון את המחט. לאחר קיבוע עכבר נקבה מורדמת עם חללי מי שפיר בגודל אידיאלי על שולחן החימום, יש למרוח ג'ל עיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות בקרנית ולהזריק משכך כאבים תת עורית. לאחר מכן, לעקר את הבטן התחתונה על ידי ניגוב עם מטלית ספוגה עם 0.5 מיליגרם לכל מיליליטר chlorhexidine פתרון לייבש את העור.לאחר מכן, באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך עור אנכי של 1.5 עד 2 ס"מ בקו האמצע בבטן התחתונה. לאחר מכן הרימו את העור בעדינות ושחררו אותו משכבת השריר שמתחתיו כסנטימטר אחד סביב נקודת החתך כדי להקל על התפירה לאחר הניתוח. לאחר מכן, בצע חתך אנכי של סנטימטר אחד בקו האמצע לתוך שכבת השריר.באמצעות זוג מלקחיים אחד, להרים צד אחד של העור ואת שכבת השרירים, ועם זוג אחר, לחפש את קרני הרחם. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים, להחזיק את הרקמה בין העוברים בזהירות לשלוף את שתי קרני הרחם מן הבטן. לספור ולמספר את העוברים, מהשחלה לצוואר הרחם או מצוואר הרחם לשחלה, משני הצדדים.לאחר מכן, עם צמר גפן לח, דחפו בעדינות את כל העוברים בחזרה לחלל הבטן, למעט שלושת הראשונים שיש להזריק. לאחר מכן, הניחו טיפה של PBS על קרום אלסטי המודבק לפתח המרכזי העגול של צלחת פטרי מותאמת הזמינה מסחרית והחזיקו אותה מיד מעל העוברים. הכנס מלקחיים סגורים לתוך החתך של אלסטי, ולאחר מכן לשחרר את המלקחיים כדי לפתוח את החתך האלסטי, מפיל את הנוזל על העוברים.באמצעות מלקחיים, למשוך את החלק של הרחם המתאים לשלושת העוברים דרך אלסטי בעדינות להניח את צלחת פטרי על הבטן של העכבר. באמצעות ארבע רגלי חימר, מהדקים ומהדקים את צלחת הפטרי מעל הבטן כדי להפחית את הלחץ על העכבר, וגם להפחית את רגישות ההדמיה לנשימה ולדופק של העכבר. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים וצמר גפן לח, להתאים את הרחם ואת אלסטי כדי להבטיח כי אלסטי אטום סביב העור של העכבר, מניעת דליפת PBS.לאחר מכן, כדי לקבע את הרחם, לחץ על גליל החימר המידול מימין לעוברים או לרחם והוסף PBS לצלחת פטרי עד שהעוברים והרחם מכוסים לחלוטין ב- PBS. כדי להקל על הקלטת הזריקות, טבלו את בדיקת האולטרסאונד לתוך ה- PBS והתאימו את העכבר או את שולחן הניתוחים, כך שהעובר הראשון מיושר עם בדיקת האולטרסאונד. סרוק את כל שלושת העוברים ובדוק את חללי מי השפיר.לאחר מכן, באמצעות מכונת אולטרסאונד, למדוד את קוטר חלל מי השפיר כדי לקבוע את נפח ההזרקה המתאים. באמצעות בקר ההזרקה, הגדר את נפחי ההזרקה שנקבעו ואת מהירות ההזרקה להאטה, עם קצב הזרקה של 23 ננוליטר לשנייה. לאחר הורדת המחט לתוך ה- PBS, באמצעות הגלגלים הראשיים במערכת המסילה, לחץ על ריק בבקר הננו-אינג'קטור עד שהנוזל יגיע לקצה המחט.לאחר מכן, הרם את המחט מתוך ה- PBS ולחץ על הזרקת כדי לוודא שטיפה של נפח רצוי משוער משוחררת. הורידו שוב את המחט לתוך ה-PBS והזיזו את הננו-אינז'קטור עם גלגל ה-Y-plane על המיקרומניפולטור כדי ליישר את המחט עם בדיקת האולטרסאונד והעובר. התאם את זווית המחט עם גלגל זווית ההזרקה כדי להבטיח זווית הזרקה כמעט ניצבת ביחס לדופן הרחם.לאחר מכן, באמצעות גלגל ההזרקה על המיקרומניפולטור, הכנס את המחט לחלל מי השפיר בתנועה אחת. אם קצה המחט נעלם מתמונת האולטרסאונד, הזז את הבדיקה קדימה או אחורה כדי להחזיר את המחט לפוקוס. לאחר מכן, הזרקת את עוצמת הקול הרצויה על ידי לחיצה על Inject למספר הפעמים המתאים.לאחר הזרקת הנפח הנדרש, יש להמתין 5 עד 10 שניות לפני החזרת המחט בתנועה עדינה אחת. העבירו את השלב לעובר הבא וחזרו על ההזרקה לשני העוברים האחרים כפי שהודגם. לאחר מכן, הרם את בדיקת האולטרסאונד והמחט מתוך ה- PBS באמצעות המיקרומניפולטור, וסובב את המחט הרחק מהמפעיל כדי למנוע נזק ופציעה.באמצעות מלקחיים, החזירו את העובר הראשון והשני לבטן על ידי דחיפתם בעדינות דרך האלסטי. לאחר מכן, תפסו בעדינות את הרקמה הסמוכה לעובר השלישי ומשכו את הרחם לכיוון הקצה העליון של החתך האלסטי. משכו בעדינות את העוברים הרביעי עד השישי עם מלקחיים ואפשרו לעובר השלישי להיכנס שוב לבטן.לאחר שהוזרקו כל העוברים עם חללי מי השפיר האופטימליים, דחפו בעדינות את העוברים והרחם בחזרה לבטן העכבר. התמרה מוצלחת של הלוח העצבי גורמת לעוברים עם ביטוי חזק של כתב פלואורסצנטי במוח וברקמות אחרות שמקורן באקטודרם, כמו העור. הזרקת נפחים גבוהים מדי עלולה לגרום לפגמים בתעלה העצבית, כגון אקסנצפליה.הזרקות מוצלחות ביום העוברי 7.5 גורמות להתמרה אחידה מהמוח הקדמי למוח האחורי, כולל מקלעת הכורואיד. זריקות של טיטר נמוך גורמות להתמרה של שיבוטים חד-תאיים, בעוד שנגיף טיטר גבוה מתמר כמעט 100% מהמוח כולו. בניתוחים קורונליים דרך עוברי יום 13.5 העוברים הראו התמרה גבוהה ואחידה של רקמה עצבית של העין, העדשה, הקרנית והמזנכימה.לאחר הזרקה ביום העוברי 9.5, בלוטות הרוק והצינורות מתפתחים סביב היום העוברי 11.5 מהאפיתל האוראלי. האפיתל הלשוני של הלשון מומר היטב, ואילו המזנכימה הבסיסית היא שלילית. בנוסף, האשכולות החיוביים בתוך האפיתל הלשוני מופרדים על ידי חלקים שליליים, מה שמרמז על התמרה של משטח הפפילר.זריקות ביום העוברי 7.5 גורמות להתמרה נרחבת של מזנכימה הלשון ביום העוברי 13.5, מה שמרמז על כך שהזרקות מוקדמות מכוונות לתאי פסגה עצביים, ותורמות למזנכימה בלשון. זריקות Lentiviral גם להוביל מיקוד נרחב של מערכת העצבים המרכזית וההיקפית, מתמר הן נוירונים ואבות בחוט השדרה, כמו גם את הגרעינים שורש הגב. הכנה טובה היא חיונית.ודא כי אין דליפה וכי העוברים קבועים היטב, כך שתוכל להתמקד לחלוטין על זריקות לתוך חלל החולדה. לאחר NEPTUNE, הניתוח יכול להיעשות בשיטות שונות, כגון ניתוח אימונופלואורסצנטי של המוח, ריצוף RNA חד-תאי, או מתן אפשרות לעוברים המוזרקים להיוולד לצורך ניתוח התנהגותי.

murine-neural-plate-targeting-utero-nano-injection-neptune-at

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בניתוח הישרדות ברחם אצל עכברים מאפשר מניפולציה המולקולרי של ביטוי גנים במהלך ההתפתחות. כאן אנו מתארים את השימוש בתדר גבוה הדמיה אולטרסאונד כדי להנחות את הזריקה של וקטורים retroviral לתוך המוח העכבר ביום עובריים (E) 9.5.

אולטרסאונד מונחה Microinjection לתוך forebrain העכבר בתוך הרחם ב E9.5

ב electroporation ברחם היא שיטה ערך עבור transfecting ובתאים עצביים in vivo. בהתאם למיקום של אלקטרודות ואת timepoint ההתפתחותי של electroporation, תת מסוימים של תאים בקליפת המוח יכול להיות ממוקד. התאים הממוקדים אז יכול להיות מנותח in vivo או במבחנה על ההשפעות של שינוי גנטי.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

ב electroporation ברחם מאפשר למסירה גן מהירה באופן מרחבית, ובזמן שבשליטת במערכת לפתח את העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מתארים וישימה מאוד בפרוטוקול electroporation ברחם, שניתן להשתמש בהם כדי לספק בונה ביטוי עובריים לתוך מערכת העצבים המרכזית מספר תחומים, כולל diencephalon telencephalon, ואת הרשתית.

ג&#39;ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

שיטה המאפשרת מניפולציה תרופתי ישירה של עוברי עכברים במהלך neurulation עוקף מטבוליזם אימהית מתואר. הטכניקה ניתן להתאים ללמוד היבטים שונים של neurulation על ידי שינוי נקודת זמן סוכן תרופתי.

Tube סגירת עצבית בתרבות העובר שלם עכבר

מקור: Mangold, K., H el. al., מיקוד צלחת עצבית של עכברים על ידי הזרקת ננו ברחם (NEPTUNE) ביום העוברי 7.5. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את שיטת הזרקת הננו ברחם למיקוד צלחת עצבית במודל עכבר עוברי. תמיסה לנטי-ויראלית בעלת טיטר גבוה מוזרקת לחלל מי השפיר, שם היא משתלבת בתאי צלחת עצבית, ומאפשרת מניפולציה גנטית יציבה למחקר נוירו-התפתחותי ויישומים טיפוליים.

מניפולציה של תאי צלחת עצבית באמצעות ננו-הזרקה ברחם במודל עכבר עוברי

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר loss- ולהשיג-של שיטת הפונקציה כי הוא ישים לזהות neogenin כמו קולטן בשלב ספציפי שמוביל trophectoderm ותא פנימי בידול המונים עוברי עכברים preimplantation.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במפות גורל ועוקבי שושלת כדי למקד זריקות לבלסטומרים בודדים המולידים כליה של עוברי Xenopus laevis.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

מאמר זה מדגים כיצד hindbrain עובריים העכבר יכול לשמש כמודל לומד נוירוג'נסיס התפתחותית כל האיבר והן ההכנות בסעיף רקמות.

העכבר Hindbrain כמודל ללימוד נוירוג'נסיס עובריים

תאי גזע/מחולל קדמון מציגים דינמיקה של ביטויים שונים של רכיבי איתות מדרגה שמובילים לתוצאות שונות של אירועי הסלולר. ביטוי דינמי כזה יכול להתגלות על ידי ניטור בזמן אמת, לא על ידי ניתוח סטטי, באמצעות מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד המאפשרת ויזואליזציה של שינויים מהירים בביטויי גנים.

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

מוצג כאן פרוטוקול לביצוע מניפולציה גנטית במוח החמוס העוברי באמצעות באלקטרואידיות הרחם. שיטה זו מאפשרת מיקוד של תאי האבות העצביים בneocortex ב vivo.

ב Vivo מיקוד של תאי הצבי העצבי Neocortex חמוס על ידי באלקטרופורציה ברחם

למדו את פרוטוקול NEPTUNE להזרקת לנטיווירוס לחלל האמניוטי בעכבר ביום עוברי 7.5. שיטה זו מאפשרת שיבוט גנטי אחיד של הצלחת העצבית עם השפעות מזעריות על ההתפתחות העוברית.

מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (NEPTUNE) ביום עוברי 7.5

גלה סרטונים נוספים