מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (NEPTUNE) ביום עוברי 7.5

NEPTUNE מאפשר מיקוד ומניפולציה גנטית של מערכת העצבים העוברית של העכבר מהיום העוברי 7.5 ומאפשר יצירת מודלים של איתור נוק-דאון או שושלת בימים. פרוטוקול זה ניתן להתאמה, גמיש ומהיר. אנו יכולים לספק ספריות נגיפיות shRNA, cdRNA או ברקוד כדי לענות על שאלות שונות בימים ולא בחודשים או שנים.

אנו מצפים ש-NEPTUNE יספק תובנות במדעי המוח, אך ניתן יהיה להתאים אותו גם למערכות איברים אחרות. זיהוי חלל מי השפיר יכול להיות מאתגר למדי, אז קח את הזמן שלך להסתכל על תמונת האולטרסאונד ואולי יש ספר לימוד או משאב אנטומיה אחר בהישג יד. כדי להתחיל להעמיס את המחט, החליקו את מחט הזכוכית על בוכנת המתכת, תוך שמירה על קולט מחובר אך משוחרר מעט.

לאחר מכן, דחפו את המחט הנימית יחד עם בוכנה המתכת דרך האטם הקדמי עד שהיא מגיעה למרווח. לחצו על Empty כדי לדחוף את הבוכנה לתוך המחט ולהוציא את השמן מקצה המחט. לאחר מכן לחצו על Fill כדי ליצור בועת אוויר, המחלקת את השמן ואת התמיסה.

לבסוף, הורידו את המחט, טבלו את הקצה בתמיסה, ולחצו שוב על Fill כדי לטעון את המחט. לאחר קיבוע עכבר נקבה מורדמת עם חללי מי שפיר בגודל אידיאלי על שולחן החימום, יש למרוח ג'ל עיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות בקרנית ולהזריק משכך כאבים תת עורית. לאחר מכן, לעקר את הבטן התחתונה על ידי ניגוב עם מטלית ספוגה עם 0.5 מיליגרם לכל מיליליטר chlorhexidine פתרון לייבש את העור.

לאחר מכן, באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך עור אנכי של 1.5 עד 2 ס"מ בקו האמצע בבטן התחתונה. לאחר מכן הרימו את העור בעדינות ושחררו אותו משכבת השריר שמתחתיו כסנטימטר אחד סביב נקודת החתך כדי להקל על התפירה לאחר הניתוח. לאחר מכן, בצע חתך אנכי של סנטימטר אחד בקו האמצע לתוך שכבת השריר.

באמצעות זוג מלקחיים אחד, להרים צד אחד של העור ואת שכבת השרירים, ועם זוג אחר, לחפש את קרני הרחם. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים, להחזיק את הרקמה בין העוברים בזהירות לשלוף את שתי קרני הרחם מן הבטן. לספור ולמספר את העוברים, מהשחלה לצוואר הרחם או מצוואר הרחם לשחלה, משני הצדדים.

לאחר מכן, עם צמר גפן לח, דחפו בעדינות את כל העוברים בחזרה לחלל הבטן, למעט שלושת הראשונים שיש להזריק. לאחר מכן, הניחו טיפה של PBS על קרום אלסטי המודבק לפתח המרכזי העגול של צלחת פטרי מותאמת הזמינה מסחרית והחזיקו אותה מיד מעל העוברים. הכנס מלקחיים סגורים לתוך החתך של אלסטי, ולאחר מכן לשחרר את המלקחיים כדי לפתוח את החתך האלסטי, מפיל את הנוזל על העוברים.

באמצעות מלקחיים, למשוך את החלק של הרחם המתאים לשלושת העוברים דרך אלסטי בעדינות להניח את צלחת פטרי על הבטן של העכבר. באמצעות ארבע רגלי חימר, מהדקים ומהדקים את צלחת הפטרי מעל הבטן כדי להפחית את הלחץ על העכבר, וגם להפחית את רגישות ההדמיה לנשימה ולדופק של העכבר. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים וצמר גפן לח, להתאים את הרחם ואת אלסטי כדי להבטיח כי אלסטי אטום סביב העור של העכבר, מניעת דליפת PBS.

לאחר מכן, כדי לקבע את הרחם, לחץ על גליל החימר המידול מימין לעוברים או לרחם והוסף PBS לצלחת פטרי עד שהעוברים והרחם מכוסים לחלוטין ב- PBS. כדי להקל על הקלטת הזריקות, טבלו את בדיקת האולטרסאונד לתוך ה- PBS והתאימו את העכבר או את שולחן הניתוחים, כך שהעובר הראשון מיושר עם בדיקת האולטרסאונד. סרוק את כל שלושת העוברים ובדוק את חללי מי השפיר.

לאחר מכן, באמצעות מכונת אולטרסאונד, למדוד את קוטר חלל מי השפיר כדי לקבוע את נפח ההזרקה המתאים. באמצעות בקר ההזרקה, הגדר את נפחי ההזרקה שנקבעו ואת מהירות ההזרקה להאטה, עם קצב הזרקה של 23 ננוליטר לשנייה. לאחר הורדת המחט לתוך ה- PBS, באמצעות הגלגלים הראשיים במערכת המסילה, לחץ על ריק בבקר הננו-אינג'קטור עד שהנוזל יגיע לקצה המחט.

לאחר מכן, הרם את המחט מתוך ה- PBS ולחץ על הזרקת כדי לוודא שטיפה של נפח רצוי משוער משוחררת. הורידו שוב את המחט לתוך ה-PBS והזיזו את הננו-אינז'קטור עם גלגל ה-Y-plane על המיקרומניפולטור כדי ליישר את המחט עם בדיקת האולטרסאונד והעובר. התאם את זווית המחט עם גלגל זווית ההזרקה כדי להבטיח זווית הזרקה כמעט ניצבת ביחס לדופן הרחם.

לאחר מכן, באמצעות גלגל ההזרקה על המיקרומניפולטור, הכנס את המחט לחלל מי השפיר בתנועה אחת. אם קצה המחט נעלם מתמונת האולטרסאונד, הזז את הבדיקה קדימה או אחורה כדי להחזיר את המחט לפוקוס. לאחר מכן, הזרקת את עוצמת הקול הרצויה על ידי לחיצה על Inject למספר הפעמים המתאים.

לאחר הזרקת הנפח הנדרש, יש להמתין 5 עד 10 שניות לפני החזרת המחט בתנועה עדינה אחת. העבירו את השלב לעובר הבא וחזרו על ההזרקה לשני העוברים האחרים כפי שהודגם. לאחר מכן, הרם את בדיקת האולטרסאונד והמחט מתוך ה- PBS באמצעות המיקרומניפולטור, וסובב את המחט הרחק מהמפעיל כדי למנוע נזק ופציעה.

באמצעות מלקחיים, החזירו את העובר הראשון והשני לבטן על ידי דחיפתם בעדינות דרך האלסטי. לאחר מכן, תפסו בעדינות את הרקמה הסמוכה לעובר השלישי ומשכו את הרחם לכיוון הקצה העליון של החתך האלסטי. משכו בעדינות את העוברים הרביעי עד השישי עם מלקחיים ואפשרו לעובר השלישי להיכנס שוב לבטן.

לאחר שהוזרקו כל העוברים עם חללי מי השפיר האופטימליים, דחפו בעדינות את העוברים והרחם בחזרה לבטן העכבר. התמרה מוצלחת של הלוח העצבי גורמת לעוברים עם ביטוי חזק של כתב פלואורסצנטי במוח וברקמות אחרות שמקורן באקטודרם, כמו העור. הזרקת נפחים גבוהים מדי עלולה לגרום לפגמים בתעלה העצבית, כגון אקסנצפליה.

הזרקות מוצלחות ביום העוברי 7.5 גורמות להתמרה אחידה מהמוח הקדמי למוח האחורי, כולל מקלעת הכורואיד. זריקות של טיטר נמוך גורמות להתמרה של שיבוטים חד-תאיים, בעוד שנגיף טיטר גבוה מתמר כמעט 100% מהמוח כולו. בניתוחים קורונליים דרך עוברי יום 13.5 העוברים הראו התמרה גבוהה ואחידה של רקמה עצבית של העין, העדשה, הקרנית והמזנכימה.

לאחר הזרקה ביום העוברי 9.5, בלוטות הרוק והצינורות מתפתחים סביב היום העוברי 11.5 מהאפיתל האוראלי. האפיתל הלשוני של הלשון מומר היטב, ואילו המזנכימה הבסיסית היא שלילית. בנוסף, האשכולות החיוביים בתוך האפיתל הלשוני מופרדים על ידי חלקים שליליים, מה שמרמז על התמרה של משטח הפפילר.

זריקות ביום העוברי 7.5 גורמות להתמרה נרחבת של מזנכימה הלשון ביום העוברי 13.5, מה שמרמז על כך שהזרקות מוקדמות מכוונות לתאי פסגה עצביים, ותורמות למזנכימה בלשון. זריקות Lentiviral גם להוביל מיקוד נרחב של מערכת העצבים המרכזית וההיקפית, מתמר הן נוירונים ואבות בחוט השדרה, כמו גם את הגרעינים שורש הגב. הכנה טובה היא חיונית.

ודא כי אין דליפה וכי העוברים קבועים היטב, כך שתוכל להתמקד לחלוטין על זריקות לתוך חלל החולדה. לאחר NEPTUNE, הניתוח יכול להיעשות בשיטות שונות, כגון ניתוח אימונופלואורסצנטי של המוח, ריצוף RNA חד-תאי, או מתן אפשרות לעוברים המוזרקים להיוולד לצורך ניתוח התנהגותי.