Name: כרומטוגרפיה אולטרה-גבוהה ממוקדת למחצה בשילוב ניתוח ספקטרומטריה המונית של מטבוליטים פנוליים בפלזמה של קשישים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: למדו לזהות מטבוליטים פנוליים בפלזמה באמצעות שיטת UPLC-MS/MS למחצה ממוקדת. הפרוטוקול מדגים התערבות תזונתית בקשישים ומאפשר ניתוח מדויק של תרכובות פנוליות לקידום בריאות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים אסירי תודה על התמיכה הכספית של CONACYT, מקסיקו (CB- 2016-01-286449), ו- UACJ-PIVA (פרויקטים 313-17-16 ו 335-18-13). OAMB רוצה להודות CONACYT למלגת הדוקטורט שלו. תמיכה טכנית ממשרד ייצור המולטימדיה של UACJ מוכרת בהכרת תודה.

דגימות הפלזמה המשמשות בפרוטוקול זה נאספו במחקר קודם בעקבות כל ההנחיות האתיות ואושרו על ידי ועדת האתיקה והביואתיקה המוסדית (CIEB-2018-1-37) מאוניברסיטת אוטונומה דה סיודאד חוארז. הפרוטוקול המלא לחילוץ וזיהוי של תרכובות פנוליות ומטבוליטים בפלזמה על ידי UPLC-MS/MS מיוצג באיור 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63164/63164fig01.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של מיצוי וזיהוי של תרכובות פנוליות ומטבוליטים בפלזמה בשיטת UPLC-MS/MS הממוקדת למחצה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63164/63164fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
1. הכנה לדוגמה
<ol><li>לאחסן את דגימות הפלזמה ב -80 °C (80 °F) עד לניתוח.</li>
	<li>להפשיר את דגימות הפלזמה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. הערה: ניתן להניח את הדגימות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להאיץ את התהליך (5 דקות).</li>
	<li>מניחים 200 μL של דגימת פלזמה במיקרוטוב 2 מ"ל ומערבבים עם 1,000 μL של אתנול טהור. מערבולת דגימת הפלזמה עבור 30 s. הערה: יש להשתמש תמיד בכפפות בעת עבודה עם דגימות פלזמה.</li>
	<li>צנטריפוגה המדגם ב 6,580 x g במשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את supernatant עם micropipette או פיפטה פסטר ומניחים אותו microtube חדש. לאחסן את supernatant ב 4 °C (65 °F).</li>
	<li>מערבבים את הכדור מהשלב הקודם עם 1,000 μL של 100% אתנול, מערבולת עבור 30 s, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 6,580 x g במשך 5 דקות. הערה: הכדור הוא ארוז מאוד צריך להיות resuspended היטב כדי להבטיח מגע בין המדגם ואתנול טהור. מומלץ להשתמש במיקרופיפט כדי לשטוף את הכדור עם אתנול.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה, לאסוף את supernatant ולערבב עם supernatant שהושג בעבר משלב 1.4. במיקרו-טיוב של 2 מ"ל.</li>
	<li>הסר אתנול מן המדגם באמצעות חנקן טהור (99.997%) ב 135 פסאיי. שמור את המחט 1 ס"מ מן החלק העליון של microtube כדי למנוע אובדן מדגם לשטוף עד המדגם יבש. אין צורך בחום כדי לאדות את האתנול. הערה: זרימת החנקן חייבת להיות נמוכה כדי למנוע אובדן מדגם. לאחר האתנול מיובש, לשמור על זרימת החנקן לפחות 5 דקות כדי להבטיח יובש מדגם. ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה; יש לאחסן דגימות בטמפרטורה של -20 °C (60 °F). הימנע מאחסון הדגימות במשך יותר מ 12 שעות.</li>
	<li>Resuspend את הדגימות היבשות ב 100 μL של תערובת של אצטוניטריל: מים בשיעור של 50:50 (v:v).</li>
	<li>לסנן את המדגם דרך קרום מזרק ניילון 0.45 מיקרו מיקרו מיקרו 0.45 מיקרו. הערה: ניתן לאחסן את הדגימות בבקבוקון בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לפני הניתוח. אחסן את הדגימות עבור לא יותר מ 8 שעות. מומלץ להזריק את הדגימות למערכת UPLC מיד לאחר הסינון.</li>
</ol>2. ניתוח UPLC-MS/MS
<ol><li>הזרקו 3 μL של דגימה על UPLC המצויד בעמודה דו-פאזית הפוכה C18 (50 מ"מ x 2.1 מ"מ; 1.8 מיקרומטר). הגדר את טמפרטורת הדגימה האוטומטית ב 20 °C (50 °F) ואת התרמוסטט עמודה ב 25 °C (60 °F). הזרקו כל דגימה בשלושה עותקים.</li>
	<li>השתמש 0.1% (v:v) חומצה פורמית במים כמו ממס A, ו 100% אצטוניטריל כמו ממס B. הגדר את קצב הזרימה ב 0.4 mL / min ותוכנית הדרגתית כדלקמן: 0-1 דקות 10% B, 1-4 דקות 30% B, 4-6 דקות 38% B, 6-8 דקות 60% B, 8-8.5 דקות 60% B, 8.5-9 דקות 10% B (טבלה 1).</li>
	<li>הגדר את ספקטרומטר המסה ליינון מצב שלילי. השתמש חנקן כגז ייבוש ב 340 °C (50 °F) וקצב זרימה של 13 L/ min. הגדר את לחץ nebulizer ב 60 פסאיי. הגדר את מתח הנימים ב- 4,000 V, את מתח הפיצול על 175 V ואת מתח הרחפן ב- 65 V. השתמש באנרגיית התנגשות ב- 20 V (טבלה 2).</li>
	<li>סרוק את המסות בין יחס טעינה של 100-1100 מסה לטעינה (m/z) ועבור MS/MS, סרוק מסות בין 50-1000 מ'/ז ' (טבלה 2). הגדר רכישת נתונים למצב MS/MS אוטומטי. השתמש במסת הייחוס הבאה: 119.036 ו- 966.0007.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>זמן (דקה)</td>
			<td>ממס A (0.1 % חומצה פורמית במי HPLC)</td>
			<td>ממס B (100 % אצטוניטריל)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 ל-1</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 עד 4</td>
			<td>70</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 עד 6</td>
			<td>62</td>
			<td>38</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 עד 8</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 עד 8.5</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>8.5 עד 9</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: שיפוע פאזה נייד המשמש להפרדה של תרכובות פנוליות על ידי UPLC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מצב יינון</td>
			<td>שלילי</td>
		</tr>
<tr>
<td>גז ייבוש</td>
			<td>חנקן בטמפרטורה של 340 °C (65 °F), קצב זרימה 13 L/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>לחץ נבולייזר</td>
			<td>60 פסאיי</td>
		</tr>
<tr>
<td>מתח נימי</td>
			<td>175 V</td>
		</tr>
<tr>
<td>מסות סריקת טרשת נפוצה</td>
			<td>100-1100 מ'/ז'</td>
		</tr>
<tr>
<td>מסות סריקה של MS/MS</td>
			<td>50-1000 מטר/z</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: פרמטרי יינון עבור ניתוח MS/MS.
3. בניית מסד נתונים
<ol><li>חפש תרכובות פנוליות, מטבוליטים פנוליים, או תרכובות אחרות של עניין בספרות המדעית.</li>
	<li>פתח את תוכנת ניהול מסדי הנתונים הכלולה במערכת UPLC. בחר | קובץ ספריית מתחם מסד נתונים אישי חדש (PCDL) | צור PCDL חדש. בחר את סוג ה- PCDL: מטבולומיקה של LC/ MS. הגדר שם עבור ה- PCDL. לאחר מכן בחר צור.</li>
	<li>בסרגל הכלים, בחר PCDL ולאחר מכן באפשרות אפשר עריכה . לאחר מכן לחץ על לחצן חפש תרכובות . הערה: מכיוון שמדובר ב- PCDL חדש, תוצאות הטבלה יהיו ריקות. פעולה זו תשתנה לאחר הוספת תרכובות חדשות ל- PCDL.<ol>
<li>הוסף תרכובות לספריית מתחם מסד הנתונים האישי המיוחד על-ידי העתקתן מהספרייה הכללית של המכשיר. פתח את מסד הנתונים הקיים של המכשיר הכלול בתוכנת ניהול מסדי הנתונים. לחץ על הלחצן חפש תרכובות. באפשרות חיפוש יחיד , הזן את קריטריוני החיפוש המורכבים כדי למצוא את דריבית הריבית. הערה: ניתן למצוא תרכובות לפי שם, נוסחה מולקולרית, מסה מדויקת וזמן שמירה.</li>
		<li>בטבלת התוצאות המורכבות, בחר את דריבית הריבית. כדי לבחור יותר ממתחם אחד, לחץ על המתחם הראשון, החזק את מקש CTRL לחוץ ולאחר מכן לחץ על כל דריבית עניין. לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כל התרכובות המסומנות ובחר צרף ל- PCDL.</li>
		<li>בחלון החדש, חפש ובחר את קובץ מסד הנתונים האישי המיוחד. סמן את התיבות כלול ספקטרום עבור תרכובות אם קיים ולכלול מידע ניידות יון עבור תרכובות אם קיים. לחץ על לחצן צרף . בתיבת הדו-שיח החדשה, בחר כן כדי לבדוק את התרכובות החדשות שנוספו. בחר לא כדי להמשיך לחפש תרכובות עניין נוספות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אם תרכובות העניין אינן זמינות בספריה הכללית של המכשיר, הוסף תרכובות חדשות באופן ידני.<ol>
<li>פתח את מסד הנתונים האישי המיוחד. לאחר הפתיחה, בצע את שלב 3.3. בחרו באפשרות 'עריכת תרכובות '. לחץ על לחצן הוסף חדש .</li>
		<li>בחלק העליון של החלון, השלם את המידע עבור המתחם החדש. מלא את הנוסחה, השם, שם IUPAC, מספר CAS, מזהה Chemspider ומזהים אחרים.</li>
		<li>השתמש במידע הזמין בספריות המקוונות החינמיות (Chemspider, PubChem ו- Phenol Explorer) כדי למלא את המידע עבור דריבית העניין החדשה. לאחר שתסיים, לחץ על הלחצן שמור כחדש כדי לשמור את המידע המורכב החדש במסד הנתונים האישי המיוחד. הערה: בעת הוספת מידע מספריות בחינם, הקפד לכלול את המידע המורכב ללא נוכחות של כלוריד או יוני יודיד. זה עשוי לשנות את המסה המדויקת ואת הנוסחה המולקולרית של מתחם העניין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על התהליך עם כל תרכובות העניין כדי להשלים את מסד הנתונים האישי המיוחד.</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>השתמש בתוכנת המנהל האיכותי של המכשיר כדי לזהות את התרכובות הפנוליות והמטבוליטים הפנוליים הקיימים בדגימות.</li>
	<li>פתח את הקובץ לדוגמה. בחלונית Chromatogram, בחר הגדר כרומטוגרמה וחלץ את כרומטוגרמה היון הכוללת (TIC), את כרומטוגרמה היון המופקת של MS (EIC) ואת ה- EIC של MS/ MS. בחר באפשרות שילוב הכרומטוגרמה.</li>
	<li>בחלונית 'חיפוש תרכובות ', בחרו 'חפש לפי אפשרויות נוסחה'. בחלון החדש, בחר מקור נוסחה ולאחר מכן באפשרות מסד נתונים/ספריה . מצא את מסד הנתונים האישי שנוצר בעבר ולחץ על פתח.</li>
	<li>בחר באפשרות התאמת נוסחאות והגדר עמידות להתאמת מסה של 5 חלקים למיליון (ppm). הערה: ניתן להגדיר עמידות התאמה שונה של מסות במהירות של 10 עמודים לדקה; הבדל זה תלוי בספקטרומטר המסה המשמש.</li>
	<li>בחר באפשרות יונים שליליים ובחר בתיבת הדו-שיח -H בלבד. באפשרות 'תוצאות ', סמנו את תיבות הדו-שיח 'חלץ EIC', 'חלץ ספקטרום נקי', 'חלץ ספקטרום גולמי' וכלול תיבות הדו-שיח 'מבנה '.</li>
	<li>בחרו באפשרות 'מסנני תוצאות '. מארק להזהיר אם הציון הוא ולהגדיר את משחק הניקוד ב 80.00%. מארק אל תתאים אם התוצאה היא וקבע את הציון על 75.00%. הערה: ניתן לשנות את ציוני ההתאמה/לא תואמים לערכים נמוכים יותר במידת הצורך. פעולה זו תפחית את דיוק הזיהוי.</li>
	<li>לחץ על מצא תרכובות על ידי נוסחה כדי לזהות תרכובות של עניין במדגם.</li>
</ol>

<ol><li>Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+incidence%2C+and+clinical+impact+of+sarcopenia%3A+facts%2C+numbers%2C+and+epidemiology-update+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle%22%5BJournal%5D)">Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).</li>
<li>Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcopenia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Sarcopenia.</a> The Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).</li>
<li>Beaudart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition+and+physical+activity+in+the+prevention+and+treatment+of+sarcopenia%3A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review.</a> Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).</li>
<li>Ozer, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenolic+compositions+and+antioxidant+activities+of+Maya+nut+%28Brosimum+alicastrum%29%3A+Comparison+with+commercial+nuts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Properties%22%5BJournal%5D)">Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts.</a> International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).</li>
<li>Subiria-Cueto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brosimum+alicastrum+Sw.+%28Ram%C3%B3n%29%3A+An+alternative+to+improve+the+nutritional+properties+and+functional+potential+of+the+wheat+flour+tortilla%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla.</a> Foods. 8 (12), 1-18 (2019).</li>
<li>Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bebida+adicionada+con+Brosimum+alicastrum+sw.%3A+Una+alternativa+para+requerimientos+dietarios+especiales%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Salud+P%C3%BAblica+y+Nutrici%C3%B3n%22%5BJournal%5D)">Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales.</a> Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).</li>
<li>Rodríguez-Tadeo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionality+of+bread+and+beverage+added+with+brosimum+alicastrum+sw.+Seed+flour+on+the+nutritional+and+health+status+of+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly.</a> Foods. 10 (8), 1-21 (2021).</li>
<li>Muñoz-Bernal, ÓA., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuevo+acercamiento+a+la+interacci%C3%B3n+del+reactivo+de+Folin-Ciocalteu+con+az%C3%BAcares+durante+la+cuantificaci%C3%B3n+de+polifenoles+totales%5BTitle%5D)+AND+%22TIP+Revista+Especializada+en+Ciencias+Qu%C3%ADmico-Biol%C3%B3gicas%22%5BJournal%5D)">Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales.</a> TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).</li>
<li>Luca, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactivity+of+dietary+polyphenols%3A+The+role+of+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).</li>
<li>Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+intestinal+microbiota+in+the+bioavailability+and+physiological+functions+of+dietary+polyphenols%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols.</a> Molecules. 24 (2), (2019).</li>
<li>de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranberry+polyphenols+and+prevention+against+urinary+tract+Infections%3A+Relevant+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations.</a> Molecules. 25 (15), (2020).</li>
<li>Alsaleh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry%3A+A+guide+for+the+clinician%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Experimental+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry: A guide for the clinician.</a> Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).</li>
<li>Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-performance+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+as+a+sensitive+and+powerful+technology+for+metabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies.</a> Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).</li>
<li>Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption%2C+metabolism+and+excretion+of+cranberry+%28poly%29phenols+in+humans%3A+A+dose+response+study+and+assessment+of+inter-individual+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability.</a> Nutrients. 9 (3), (2017).</li>
<li>Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+metabolism+of+hydroxycinnamic+acids+%28chlorogenic%2C+caffeic%2C+and+ferulic+acids%29+by+HepG2+cells+as+a+model+of+the+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).</li>
<li>Rodriguez Lanzi,, Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenolic+metabolites+in+plasma+and+tissues+of+rats+fed+with+a+grape+pomace+extract+as+assessed+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).</li>
<li>Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+detection+and+identification+strategy+for+untargeted+metabolomics+based+on+UPLC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531(2020).</li>
<li>Nagy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+identification+of+dimethoxycinnamic+acids+in+human+plasma+after+coffee+intake+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).</li>
<li>Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+phenolic+acids+and+their+methylates%2C+glucuronides%2C+sulfates+and+lactones+metabolites+in+human+plasma+by+LC-MS%2FMS+after+oral+ingestion+of+soluble+coffee%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).</li>
<li>McCord, J., Strynar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+per-and+polyfluorinated+chemical+species+with+a+combined+targeted+and+non-targeted-screening+high-resolution+mass+spectrometry+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow.</a> Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).</li>
<li>Muñoz-Bernal, ÓA., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochemical+characterization+and+antiplatelet+activity+of+Mexican+red+wines+and+their+by-products%5BTitle%5D)+AND+%22South+African+Journal+of+Enology+and+Viticulture%22%5BJournal%5D)">Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products.</a> South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).</li>
<li>Muñoz-Bernal, ÓA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriquecimiento+de+un+vino+tinto+con+un+extracto+de+compuestos+fen%C3%B3licos+provenientes+de+orujo+de+uva%3A+bioaccesibilidad%2C+an%C3%A1lisis+sensorial+y+respuesta+biol%C3%B3gica%5BTitle%5D)+AND+%22Universidad+Aut%C3%B3noma+de+Ciudad+Ju%C3%A1rez%22%5BJournal%5D)">Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica.</a> Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).</li>
<li>Low, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+sharing+in+PredRet+for+accurate+prediction+of+retention+time%3A+Application+to+plant+food+bioactive+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds.</a> Food Chemistry. , 357(2021).</li>
<li>Sánchez-Patán, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbial+catabolism+of+grape+seed+flavan-3-ols+by+human+faecal+microbiota.+Targeted+analysis+of+precursor+compounds%2C+intermediate+metabolites+and+end-products%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products.</a> Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+urinary+%28poly%29phenolic+profiles+after+4-week+red+raspberry+%28Rubus+idaeus+L.%29+intake+with+or+without+fructo-oligosaccharide+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation.</a> Molecules. 25 (20), (2020).</li>
</ol>

כל המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

זיהוי וכימות של פיטוכימיקלים ביואקטיביים הנספגים לאחר צריכת תוסף מזון או מזון חיוניים להדגמה והבנה של היתרונות הבריאותיים של תרכובות אלה ואת המזונות המכילים אותם. בעבודה הנוכחית פותחה שיטת UPLC-MS/MS, שמטרתה רק זיהוי של התרכובות הפנוליות העיקריות והמטבוליטים שלהן שהגדילו את הריכוז בפלזמה לאחר התערבות תזונתית של 30 יום עם שני מוצרי מזון שגובשו במיוחד עבור קשישים. ההנחה הייתה כי, אם תרכובת אחת גדלה או הופיעה בפלזמה רק לאחר תקופת ההתערבות, תרכובת זו נספגה ו/או biotransformed מן המזונות המשמשים בהתערבות. 
<p class="jove_...

סרקופיניה היא הפרעת שלד מתקדמת הקשורה לאובדן מואץ של שרירים באוכלוסייה המבוגרת. מצב זה מגביר את הסיכון לנפילות ומוביל לפעילות מוגבלת של חיי היומיום. סרקופיניה קיימת בכ-5%-10% מהאנשים מעל גיל 65 וכ-50% מבני 80 ומעלה1. לא אושרו תרופות ספציפיות לטיפול בסרקופיניה, ולכן מניעה עם פעילות גופנית ותזונה מאוזנת היטב חשובה 1,2. התערבויות תזונתיות עם מזונות שפותחו במיוחד מועשרים בחלבון חלב וחומצות אמינו חיוניות הראו תוצאות חיוביות במניעת סרקופניה2. במחקרים אחרים, המחברים כללו ויטמינים ונוגדי חמצון, כמו ויטמין E ואיזופלבונים, בתזונה, הגדלת היתרונות לרווח שרירים על המותניים והירכיים3.
ברוסימום עליקסטרום סובה (בספרדית: Brosimum alicastrum Sw. ) הוא עץ הגדל באזורים הטרופיים של מקסיקו. זה כבר נצרך על ידי תרבויות המאיה בשל הערך התזונתי הגבוה שלה4. זהו מקור טוב של חלבון, סיבים, מינרלים, ונוגדי חמצון פנוליים, כגון חומצה כלורוגנית5. מאז זה יכול להיות טחון לאבקה ומשמש במוצרי אפייה או נצרך משקאות, מחקרים אחרונים העריכו את השילוב של קמח זרעי רמון (RSF) לתוך מזונות שונים כדי לשפר את הערך התזונתי שלהם. משקה בטעם קפוצ'ינו בתוספת RSF פותח, שהיה עשיר בסיבים תזונתיים והיה בו יותר מ-6 גרם חלבון למנה, והיה מקובל מאוד על הצרכנים; לכן, זה נחשב חלופה פוטנציאלית לעמידה בדרישות תזונתיות מיוחדות6. במחקר מעקב, RSF שימש גם כדי לנסח מאפין ומשקה חדש עשיר בחלבון, סיבים תזונתיים, micronutrients, ונוגדי חמצון פנוליים. המאפין והמשקה שימשו בהתערבות תזונתית לקשישים, שצרכו את שני המוצרים פעמיים ביום במשך 30 יום. לאחר תקופה זו, המצב התזונתי והסרקופי של המשתתפים השתפר, ואת התוכן הפנולי הכולל של פלזמה גדל7. עם זאת, הקביעה של סך התרכובות פנוליות בפלזמה בוצעה על ידי שיטה ספקטרופוטומטרית, ולכן זיהוי של תרכובות פנוליות בפועל שנקלטו לא היה אפשרי; יתר על כן, שיטה זו אינה ספציפית לחלוטין עבור תרכובות פנוליות, ולכן כמה הערכת יתר עלולה להתרחש8.
זיהוי וכימות של תרכובות פנוליות הנספגות לאחר צריכת מזונות עשירים בנוגדי חמצון אלה היא משימה קשה אך יש צורך להדגים את הפעילות הביולוגית של פיטוכימיקלים אלה. הזמינות הביולוגית של רוב התרכובות הפנוליות נמוכה; פחות מ -5% מהם ניתן למצוא ללא שינוי מבני בפלזמה. תרכובות פנוליות עוברות מספר ביוטרנספורמציות, כגון מתילציה, סולפונציה או גלוקורונידציה, המתבצעות על ידי enterocytes ו hepatocytes9. תרכובות פנוליות הן גם biotransformed על ידי המיקרוביוטה לתוך קטבוליטים חיידקיים שעשויים להפעיל את ההשפעות המועילות שלהם בגוף לאחר נספג לתוך פלזמה10. לדוגמה, חומצה פנילאצטית היא תוצר של טרנספורמציה חיידקית של פלבנואידים ופרואנתוציאנידינים אוליגומריים, אשר יכול לעכב עד 40% של חיידקים (Escherichia coli) הידבקות בדרכי השתן לאחר צריכת חמוציות11.
המגוון המבני של תרכובות פנוליות טבעיות, הוסיף למגוון של המטבוליטים שלהם ואת הזמינות הביולוגית הנמוכה שלהם, עושה את הזיהוי שלהם בפלזמה אפילו יותר מאתגר. פרופיל מטבולומי, באמצעות פלטפורמות ניתוח ספקטרוסקופיות כמו תהודה מגנטית גרעינית (NMR) וספקטרוסקופיית מסה טנדם (MS/ MS), היא כנראה הגישה הטובה ביותר להשגת מטרה זו; למרבה הצער, הציוד אינו נגיש בקלות, ופיתוח פרוטוקולי ניתוח עדיין מוגבל12. מספר מחקרים דיווחו על טרשת נפוצה /טרשת נפוצה בשילוב עם מערכת הפרדה (כגון כרומטוגרפיה נוזלית) כאסטרטגיה להפחתת המורכבות של ספקטרום המסה במחקרים מטבולומיים. ההקדמה האחרונה של שיטות הפרדה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UPLC) צמצמה את זמן הניתוח והגדילה את הרזולוציה והרגישות בהשוואה לפרוטוקולים נוזליים קונבנציונליים בעלי ביצועים גבוהים, כך שמערכות UPLC-MS/MS התקבלו במהירות באופן נרחב על ידי קהילת חילוף החומרים האנליטית13. בדרך זו, כמה מחקרים חקרו מטבוליטים פנוליים וזיהו נגזרות glucuronidated מחומצה caffeic, קוורצטין, וחומצה פרולית, כמו גם נגזרות sulfonated מחומצה סירינגית וניל בפלזמה של אנשים לאחר צריכת חמוציות14. פרוטוקולים קודמים התכוונו למצוא תרכובות פנוליות ומטבוליטים פנוליים ביופלואידים כגון פלזמה. פרוטוקולים אלה התבססו על זיהוי וכימות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) יחד עם גלאי UV-vis15. עם זאת, פרוטוקולים כאלה דורשים שימוש בסטנדרטים אותנטיים כדי להעריך זיהוי מוחלט וכימות מדויק. מגוון רחב של מחקרים זיהו את המטבוליטים הנפוצים ביותר ביופלוידים (צורות זועפות, glucuronidated ומתילציה) על ידי UPLC-MS ו UPLC-MS / MS; עם זאת, חלק גדול של מטבוליטים חיידקיים לא דווח בשל היעדר מסדי נתונים המכילים את המידע המלא שלהם16. זיהוי מטבוליט מסובך על ידי העלות והזמינות המסחרית של תקני מטבוליט. לכן, האסטרטגיה הטובה ביותר עשויה להיות לא ממוקדת או חצי ממוקדת ניתוח מטבוליטים MS / MS, אשר מסתמך על השימוש במידע תכונה מולקולרית (m / z, מסה מדויקת מונואיסטופית, הפצה איזוטופית, ודפוס פיצול) כדי לקבוע את הזהות הכימית ומשווה אותו עם מסדי נתונים מקוונים זמינים באופן חופשי המכילים מטבוליטים פוליפנול מזוהים ביופלוידים לאחר צריכת פוליפוליפנול-richts12 . מסדי הנתונים החשובים ביותר המשמשים במחקרי UPLC-MS/MS לזיהוי תרכובות פנוליות והמטבוליטים שלהם הם מסד הנתונים של מטבולום אנושי (HMDB), ספריית ליפידבלסט, ספריית METLIN, ומאגרי מידע משלימים אחרים, כגון PubChem, ChemSpider, ו- Phenol Explorer17.
במחקר הנוכחי פותחה שיטת UPLC-MS/MS ממוקדת למחצה לניתוח דגימות הפלזמה של קבוצת הקשישים המעורבים במחקר צריכת המאפינס והמשקאות המכיל RSF7. נתונים ממאגרי מידע מקוונים שונים בחינם של מטבוליטים פלזמה נאספו ושולבו במסד נתונים מיוחד. מסד נתונים זה ניתן לגשת באופן אוטומטי על ידי תוכנת הציוד כדי לזהות את המטבוליטים פוליפנולי בחמש דגימות פלזמה לפני ואחרי ההתערבות התזונתית 30 יום. זה נעשה כדי לזהות את התרכובות הפנוליות העיקריות, או המטבוליטים שלהם, כי הם נספגים מן מזונות פונקציונליים מנוסחים במיוחד שנועדו למניעת סרקופיניה.

<table><tbody><tr><td>אצטוניטריל</td><td>טדיה</td><td>Al1129-001</td><td>LC ספקטרומטריית מסה</td></tr><tr><td>דגימה אוטומטית</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4226A</td><td>1290 סדרת אינפיניטי</td></tr><tr><td>C18 עמודת פאזה הפוכה</td><td>Agilent Technologies</td><td>959757-902</td><td>Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 מ"מ, 1.8 &mu; m; צנטריפוגה HD ברזולוציה מהירה</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5452000018</td><td>מיני ספין; רוטור F-45-12-11</td></tr><tr><td>תא עמודים עם תרמוסטט</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1316C</td><td>1290</td></tr><tr><td>גלאי מערך דיודות מסדרת אינפיניטי (UV-Vis)</td> <td>Agilent Technologies</td><td>G4212B</td><td>1260 Infinity</td></tr><tr><td>series מקור יינון אלקטרוספריי</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3251B</td><td>מרסס כפול מקור ESI</td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>J.T. Baker</td><td>0128-02</td><td>מגיב בייקרACS</td></tr><tr><td>Mass Hunter Data Acquisition</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Mass Hunter Personal Compound Datbase ומנהל ספרייה</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Mass Hunter ניתוח איכותי</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>מותג</td><td>BR780546</td><td>צינור מיקרוצנטריפוגה, 2 מ"ל עם מכסה</td></tr><tr><td>טהור אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E7023-1L</td><td>200 הוכחה, לביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>Q-TOF LC/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6530B</td><td>6530 מסה</td></tr><tr><td>מדויקת מסה רביעונית</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4204A</td><td>1290 מסנן מזרק מסדרת אינפיניטי</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>44514-NN</td><td>17 מ"מ, 0.45 &mu; m, קרום ניילון</td></tr><tr><td>תרמוסטט</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td>1290 סדרת אינפיניטי</td></tr><tr><td>בקבוקון</td><td>Agilent Technologies</td><td>8010-0199</td><td>ענבר, PFTE סיליקון אדום 2 מ"ל עם ראש בורג וכובעים כחולים</td></tr><tr><td>הכנסת בקבוקון</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2089</td><td>הכנסת בקבוקון 200 &mu; L לפתיחה סטנדרטית של 2 מ"ל, מים חרוטיים</td></tr><tr><td></td><td>Tedia</td><td>WL2212-001</td><td>LC ספקטרומטריית מסה</td></tr></tbody></table>

כרומטוגרפיה אולטרה-גבוהה ממוקדת למחצה בשילוב ניתוח ספקטרומטריה המונית של מטבוליטים פנוליים בפלזמה של קשישים

Semi-Targeted Ultra-High-Performance Chromatography Coupled to Mass Spectrometry Analysis of Phenolic Metabolites in Plasma of Elderly Adults

קבוצה של 23 קשישים קיבלה ארוחות פונקציונליות (משקה ומאפין) שפותחו במיוחד למניעת סרקופניה (אובדן מסת שריר הקשורה לגיל). דגימות פלזמה נלקחו בתחילת ההתערבות ולאחר 30 ימים של צריכת הארוחות הפונקציונליות. כרומטוגרפיה אולטרה-גבוהה ממוקדת למחצה בשילוב עם ניתוח מסה דו-מושבית (UPLC-MS/MS) בוצעה כדי לזהות תרכובות פנוליות והמטבוליטים שלהן. חלבוני פלזמה היו מזורזים עם אתנול והדגימות היו מרוכזות ו resuspended בשלב הנייד (1:1 acetonitrile: מים) לפני הזרקה למכשיר UPLC-MS / MS. ההפרדה בוצעה עם עמודת שלב הפוך C18 , ותרכובות זוהו באמצעות המסה הניסיונית שלהם, הפצה איזוטופית, ודפוס שבר. תרכובות עניין הושוו לאלה של מאגרי נתונים וספרייה ממוקדת למחצה פנימית. תוצאות ראשוניות הראו כי המטבוליטים העיקריים שזוהו לאחר ההתערבות היו חומצה פנילצטית, גליציטין, 3-הידרוקסיפנילוולרית, וגומיסין M2.

תהליך שלב אחר שלב לזיהוי מטבוליטים פנוליים באמצעות ניתוח UPLC-MS/MS הממוקד למחצה, במצב שלילי, של דגימות פלזמה מתואר באיור 2. ראשית, הכרומטוגרמה הכוללת של היון (TIC) מתמצית פנוליקים פלזמה (המתקבלת לאחר משקעי חלבון של דגימת הפלזמה הכוללת) הושגה באמצעות התוכנה האיכותית של המכשיר. לאחר מכן, נעשה שימוש בכרומטוגרמת היון שחולצה, והמסה המדויקת ותבנית הפיצול (ניתוח MS/MS) של כל אות (או תכונה מולקולרית) הושוו לאלה של מסד נתונים אישי מסוים שנוצר גם בתוכנת המכשיר. אותות עם התאמה המ...

מטרת פרוטוקול זה היא לזהות מטבוליטים פנוליים בפלזמה באמצעות שיטת ספקטרומטריה כרומטוגרפיה-מסה ממוקדת למחצה.

A group of 23 elderly persons was given functional meals (a beverage and a muffin) specially formulated for the prevention of sarcopenia (age-related loss ...

מטרת פרוטוקול זה היא לזהות מטבוליטים פנוליים בפלזמה על ידי שיטת UPLC-MS/MS ממוקדת למחצה. חלבוני פלזמה היו מואצים עם אתנול ודגימות מרוכזים, והושעו מחדש בשלב הנייד, לפני הזרקת ציוד UPLC. תרכובות זוהו באמצעות ספרייה ממוקדת למחצה שהורכבה במעבדה, באמצעות מנהל PCDL עבור מטבולומיקה, תוכנה ומאגרי מידע מקוונים שונים בחינם.יישמנו התערבות תזונתית עם מאפין ומשקאות מנוסחים עם קמח זרעי brosimum alicastrum. בסוף ההתערבות, המצב התזונתי והסרקופי של המשתתפים שופרו, והתוכן הפנולי הכולל של פלזמה הוגדל. אבל אנחנו צריכים לזהות אילו תרכובות פנוליות נספגו ותרמו את ההשפעה החיובית.זיהוי וכימות של תרכובות פנוליות הנספגות לאחר צריכת מזונות עשירים בנוגדי חמצון אלה היא משימה קשה אך הכרחית, אם יש צורך להדגים פעילות ביולוגית של פיטוכימיקלים אלה. הזמינות הביולוגית של רוב הרכיבים הפנוליים נמוכה, יתר על כן פחות מ -5% מהם נכנסים ללא טרנספורמציה מבנית לפלסמה. רובם עוברים מספר ביו-טרנספורמציה, כגון מתילציה, סולפונציה או גלוקורונידציה.מגוון רחב של מחקרים זיהה את המטבוליטים הנפוצים ביותר בפלואידים ביולוגיים על ידי UPLC-MS ו- UPLC-MS / MS. עם זאת, חלק גדול של מטבוליט חיידקים אינו מדווח על היעדר מסדי נתונים המכילים את המידע המלא שלהם. זיהוי מטבוליט מסובך על ידי העלות והזמינות המסחרית של תקני מטבוליט.לכן, האסטרטגיה הטובה ביותר עשויה להיות לא ממוקדת או ניתוח מטבוליטים MS/MS ממוקד למחצה. ניתוח זה מסתמך על השימוש במידע תכונה מולקולרית, מסה ליחס טעינה מונואיזוטופית מסה מדויקת, התפלגות איזוטופית, ודפוס פיצול. כדי לקבוע את הזהות הכימית ולהשוות אותו עם מסדי נתונים מקוונים זמינים בחינם המכילים מטבוליטים פוליפנול מזוהה ביופלואידים לאחר צריכת דיאטות עשירות פוליפנול.במחקר הנוכחי, פיתחנו שיטת UPLC-MS/MS ממוקדת למחצה לניתוח דגימות הפלזמה של קבוצת קשישים המעורבים בהתערבות תזונתית. לאחסן דגימות פלזמה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח. להפשיר דגימות פלזמה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות או ב 37 צלזיוס במשך חמש דקות.מניחים 200 מיקרוליטרים של דגימת פלזמה במיקרו-צינור שני מילימטר ומערבבים עם 1000 מיקרוליטרים של אתנול טהור. דגימת פלזמה מערבולת במשך 30 שניות. דגימת צנטריפוגה ב-6, 580 כוח צנטריפוגלי לחמש דקות.לאחר צנטריפוגה, לאסוף את supernatant עם micropipette או פיפטה פסטר ומניחים אותו microtube חדש. שמור את הסופר-נרטיב. מערבבים גלולה עם 1000 מיקרוליטר אתנול טהור, קודקוד במשך 30 שניות, ולאחר מכן צנטריפוגה באותם תנאים.לאסוף את supernatant ולערבב עם supernatant הראשון. הסר אתנול מן המדגם באמצעות חנקן טהור ב 135 פסאיי. שמור את המחט סנטימטר אחד מן החלק העליון של microtube כדי למנוע אובדן מדגם לשטוף עד מדגם יבש.Resuspend דגימות יבשות ב 100 microliters של אחד הוא תערובת אחת של אצטוניטריל עם מים. סנן דרך קרום מזרק ניילון 45 מיקרו ישירות לתוך HPLC בקבוקון מיקרו להוסיף להזריק שלושה מיקרוליטרים של מדגם על UPLC מצויד C 18 הפוך פאזה עמודה. הגדר את טמפרטורת הדגימה האוטומטית על 20 מעלות צלזיוס ואת תרמוסטט הטור ב 25 צלזיוס.הזרקו כל דגימה בשלושה עותקים. השתמש 0.1% חומצה פורמית במים כמו ממס A, ו 100% acetonitrile כמו ממס B.הגדר את קצב הזרימה ב 0.4 מילימטרים לדקה ותוכנית הדרגתית כדלקמן, אפס עד דקה אחת 10%B, דקה אחת עד ארבע דקה 30%B, ארבע עד שש דקות 38%B, שש עד שמונה דקות 60%B, שמונה עד 8.5 דקות 60%B, 8.5 עד תשע דקות 10%B. הגדר את ספקטרומטר המסה ביינון מצב שלילי.השתמש חנקן כמו גז ייבוש ב 300 צלזיוס וקצב הזרימה ב 13 ליטר לדקה. הגדר את לחץ nebulizer ב 30 פסאיי. הגדר מתח נימי ב 4, 000 וולט, מתח מקוטע ב 175 וולט, ומתח Skimmer ב 65 וולט.סרוק את המסות בין 100 ל 1100 מ '/z ועבור ספקטרומטריית המסה, סרוק מסות בין 50 ל 1000 מ '/z. הגדר רכישת נתונים למצב MS/MS אוטומטי. השתמש במסת ההפניה הבאה, 119.036 ו- 966.0007.חפש תרכובות פנוליות, מטבוליטים פנוליים ותרכובות אחרות של עניין בספרות מדעית. פתח את תוכנת ניהול מסדי הנתונים הכלולה במערכת UPLC. בחר קובץ ולאחר מכן בחר ספריה מורכבת חדשה של מסד נתונים אישי, PCDL.לאחר מכן בחר, צור PCDL חדש. בחר את סוג חילוף החומרים PCDL LC/MS. הגדר את השם עבור PCDL.לאחר מכן בחר צור. בסרגל הכלים, בחר PCDL ולאחר מכן באפשרות אפשר עריכה. לאחר מכן לחץ על לחצן חפש תרכובות.ניתן להוסיף תרכובות לספרייה האישית בשתי דרכים, תחילה על-ידי העתקתן מהספרייה הכללית של המכשיר. לשם כך, פתח את מסד הנתונים הקיים של המכשירים הכלולים בניהול הנתונים עד כה. לחץ על הלחצן חפש תרכובות.באפשרות החיפוש היחיד, הזן את קריטריוני החיפוש המורכבים כדי למצוא את דריבית הריבית. בטבלת התוצאות המורכבות, בחר את דריבית הריבית. כדי לבחור יותר ממתחם אחד, לחץ על המתחם הראשון ולאחר מכן החזק את מקש CTRL לחוץ ולאחר מכן לחץ על כל דריכת ריבית.לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כל התרכובות המסומנות ובחר צרף ל- PCDL. בחלון החדש, חפש ובחר את קובץ מסד הנתונים האישי המיוחד. סמן את התיבה כלול ספקטרום עבור תרכובת אם קיימת.לחץ על לחצן צרף. בתיבת הדו-שיח החדשה, בחר כן כדי לבדוק את התרכובות החדשות שנוספו. בחר לא כדי להמשיך לחפש תרכובות עניין נוספות.שנית, ניתן להוסיף תרכובות חדשות באופן ידני אם הן אינן זמינות בספריה הכללית של המכשיר. עבור זה פתוח, מסד הנתונים האישי המיוחד. לאחר הפתיחה, בחר PCDL ולאחר מכן באפשרות אפשר עריכה.בחרו באפשרות 'עריכה של תרכובות'. לחץ על לחצן הוסף חדש. בחלק העליון של החלון, השלם את המידע של המתחם החדש.מלא את הנוסחה, השם, שם IUPAC, מספר CAS, מזהה Chemspider ומזהים אחרים. באמצעות מידע הזמין בספריות המקוונות החינמיות, Chemspider, PubChem, ו- Phenol Explorer כדי למלא את המידע של דריבית העניין החדשה. לאחר שתסיים, לחץ על הלחצן שמור כחדש כדי לשמור את המידע המורכב החדש במסד הנתונים האישי המיוחד.חזור על התהליך עם כל תרכובות העניין כדי להשלים את מסד הנתונים האישי המיוחד. השתמש בתוכנת המנהל האיכותי של המכשיר כדי לזהות תרכובות פנוליות ומטבוליטים פנוליים. פתח את הקובץ לדוגמה.בחלונית Chromatogram, בחר להגדיר Chromatograms ולחלץ את סך כרומטוגרמה יון TIC, שחולצו יון-כרומטוגרמה של MS EIC ו- EIC של MS / MS. בחר באפשרות שילוב כרומטוגרמה. בחלונית 'חיפוש תרכובות', בחרו 'חפש לפי אפשרויות נוסחה'.בחלון החדש, בחר מקור נוסחה ולאחר מכן באפשרות ספריית קו נטוי של מסד הנתונים. מצא את מסד הנתונים האישי שנוצר בעבר ולחץ על פתוח. בחר באפשרות התאמת הנוסחה והגדר עמידות להתאמה המונית של חמישה חלקים למיליון, ppm.בחרו באפשרות היונים השליליים ובחרו בתיבת הדו-שיח מינוס H בלבד. באפשרות התוצאות, סמן את החילוץ EIC, חלץ ספקטרום נקי, חלץ ספקטרום גולמי וכלול תיבות דו-שיח מובנות. בחר באפשרות מסנני התוצאות.ואז לסמן להזהיר אם הציון הוא, ולאחר מכן להגדיר את משחק הניקוד ב 80%ואז לסמן לא להתאים אם הציון הוא ולהגדיר את הציון ב 75%ואז לחץ על תרכובות למצוא על ידי תרכובות לפי נוסחה כדי לזהות תרכובות של עניין במדגם. תהליך צעד אחר צעד לזיהוי מטבוליטים פנוליים באמצעות ניתוח UPLC MS / MS ממוקד למחצה של דגימות פלזמה מוצג באיור הבא. ראשית, סך כל יון-כרומטוגרמה הושג באמצעות מסד נתונים PCDL שנוצר באופן עצמי שהכיל 645 תרכובות פנוליות ואת המטבוליטים שלהם, שהתקבלו ממסדי נתונים מקוונים בחינם.לאחר מכן, יון-כרומטוגרמה שחולצה ודפוס פיצול, או היונים עם פחות מחמש ppm מסה, סובלנות התאמה הושגו. לבסוף, ההתפלגות האיזוטופית של הפסגות שזוהו הושוותה לזו של התרכובות התיאורטיות. מניתוח זה, בסך הכל 25 תרכובות פנוליות ומטבוליטים זוהו בדגימות הפלזמה.כדי להעריך את האפקטיביות של שיטת העיצוב בזיהוי של תרכובות פנוליות לספוג או המטבוליטים שלהם, חמש דגימות של משתתפי המחקר הושגו לפני ואחרי התערבות 30 יום נותחו. השפע היחסי של כל תרכובת חושב על ידי חלוקת השטח מתחת לעקומה לאחר הטיפול על ידי AUC לפני הטיפול. טבלה 4 מציגה את הרשימה של 12 תרכובות פנול שהראו עלייה בפלזמה לאחר צריכת 30 יום של קמח brosimum alicastrum המכיל מזונות.חומצה פנילאצטית היה רק מטבוליט נמצא באופן עקבי בריכוז גבוה יותר לאחר הטיפול. גליציטין, איזופלבון גליקוסילאט, ושלוש חומצה הידרוקסיפנית גדלו בשלוש מתוך חמש הדגימות, אך ירדו בשתיים האחרות. Gomisin M2, ליגנן, זוהה בשלוש מתוך חמש דגימות רק לאחר ההתערבות התזונתית.תרכובות פנוליות אחרות מטבוליטים נמצאו רק במדגם אחד ורק לאחר הטיפול. השיטה שפיתחה נייר נוכחי, מראה כי ברוב החלקים זה היה מתאים היטב למטרה שלשמה הוא נוצר. המדגם לכל טיפול היה פשוט ויעיל.הפרדת UPLC וזיהוי MS/MS ממוקד למחצה של מטבוליטים פנוליים הושגו.

semi-targeted-ultra-high-performance-chromatography-coupled-to-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרופיל מטבוליט לא ממוקד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (UPLC-MS) היא טכניקה רבת עוצמה לחקירת חילוף החומרים.  מאמר זה מתאר זרימת עבודה טיפוסית המשמשת לפרופיל מטבוליט לא ממוקד של סרום, כולל ארגון והכנת דגימות, רכישת נתונים, ניתוח נתונים, בקרת איכות וזיהוי מטבוליטים.

בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)

לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. ניצול כרומטוגרפיה נוזלית בהדרגה נורמלית מצמידים ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה עם מיתוג קוטביות ומחזור עבודה מהיר, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הרכב חילוף חומרים הקוטבי של חומר ביולוגי עם רגישות גבוהה, דיוק, ורזולוציה.

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

האמינות של תוצאות בניסויי metabolomics תלוי באפקטיביות והשחזור של הכנת המדגם. תאר היא שיטה קפדנית ומעמיקה שבמאפשרת מיצוי של מטבוליטים מנוזלים ביולוגיים עם האפשרות של המשך ניתוח עד אלפי תרכובות, או רק את שיעורי המתחם של עניין.

טכניקת הכנה רב שלבים לשחזר חוגים מתחם המטבוליט מרובים לעומק וניתוח Metabolomic אינפורמטיבי

כאן נתאר שיטת תפוקה גבוהה למעקב סמים מקיף המאפשר רזולוציית משופרת וזיהוי של לוחות גדולים של סמים של התעללות מטבוליטים שלהם, עם בקרת איכות המבוססת על הזרקת multisegment-נים אלקטרופורזה-ספקטרומטריית.

מעקב סמים תפוקה גבוהה ומקיף באמצעות ספקטרומטר מסה אלקטרופורזה הזרקה-נימי Multisegment

שיטה לניתוח בלתי ממוקד של מטבוליטים דגן חיטה ושומנים מוצג. הפרוטוקול כולל שיטת הפקת מטבוליט מטבוליזם והיפוך נוזל בשלב כרומטוגרפיה מתודולוגיה להמסת המסה, עם רכישת מצבי מגנטי חיובי ושלילי.

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

חומצות פנוליות הן פיטוכימיקלים חשובים הנמצאים בדגנים מלאים. יש להם תכונות ביו-אקטיביות כגון פונקציות הגנה נוגדות חמצון. עבודה זו נועדה לדווח על שיטה כללית לזיהוי HPLC, הערכת תכולה פנולית כוללת וקביעת היכולת נוגדת החמצון של חומצות פנוליות בדגנים וקטניות.

שיטה כללית לקביעת הרכב חומצה פנולית מסיסה באופן חופשי ויכולת נוגדת חמצון של דגנים וקטניות

פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה לתיוג מטבולי של תאים סניסנטיים ולא מתחלקים עם SILAC פועם, ניתוח ספקטרומטריית מסה לא ממוקדת וחישוב יעיל של זמן מחצית חיים של חלבונים.

מדידת שיעורי תחלופת חלבונים בתאי תרבית סנסנטיים ולא מתחלקים באמצעות תיוג מטבולי וספקטרומטריית מסה

אנו מתארים פרוטוקול כללי המשלב ניתוח ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה ועגינה מולקולרית במחקר הרפואה הסינית המסורתית.

ספקטרומטריית מסות טנדם ברזולוציה גבוהה לחקר מרכיבים כימיים של Gynura bicolor DC

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

למדו לזהות מטבוליטים פנוליים בפלזמה באמצעות שיטת UPLC-MS/MS למחצה ממוקדת. הפרוטוקול מדגים התערבות תזונתית בקשישים ומאפשר ניתוח מדויק של תרכובות פנוליות לקידום בריאות.

כרומטוגרפיה אולטרה-גבוהה ממוקדת למחצה בשילוב ניתוח ספקטרומטריה המונית של מטבוליטים פנוליים בפלזמה של קשישים

גלה סרטונים נוספים