הכנה ביולוגית וטכניקה מכנית לקביעת תכונות ויסקולסטיות של סיבים זונולריים

החשיבות של השיטה שלנו טמונה ביכולתה לענות על השאלה, מה הם המאפיינים viscoelastic של סיבים זונולריים, הסיבים להשעות את העדשה בתוך העין? היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שהיא יכולה לכמת את המאפיינים הוויסקואלסטיים של הסיבים הזונולריים הקטנים והעדינים מעכברים עם וללא שינויי גנים ממוקדים. מוטציות בגנים קידוד חלבונים מיקרופיבריים בבסיס מספר תנאים סינדרומיים תורשתיים.

באמצעות הטכניקה שלנו, אנו יכולים לחקור כיצד מוטציות ספציפיות משנות את התכונות הביומכניות של המיקרופיברילים. כדי להתחיל, לאחר המתת חסד העכבר, להסיר את העיניים באמצעות מלקחיים עדינים. הכנס את קצה מחט הקיבעון דרך דופן העין ומקם אותה במרכז ההומור הזגוגי, תוך הקפדה שלא לפגוע בעדשה.

להעביר בזהירות את העין המשופדת לצינור מלא 4% paraformaldehyde ו פוספט חוצץ מלוחים. פתח את השסתום המחבר את המחט למאגר מקובע הממוקם 25 ס"מ מעל המדגם אשר שומר על לחץ חיובי שווה ערך ל 15 עד 20 מילימטרים של כספית בתוך העין במהלך תקופת הקיבעון ולהשאיר את המדגם לתקן בן לילה. למחרת, להסיר את מחט הקיבעון ולשטוף את העין במשך 10 דקות מלוחים חוצצים פוספט.

על ידי שימוש במספריים כירורגיים עיניים ומיקרוסקופ סטריאו, לעשות חתך בעובי מלא בדופן העין ליד ראש עצב הראייה. להרחיב את החתך קדימה לכיוון קו המשווה ולאחר מכן סביב היקף קו המשווה של העין תוך חסכון בזהירות את תהליכי ciliary עדינים וסיבים זונולריים הקשורים. חשוף את המשטח האחורי של העדשה על ידי הסרת החלק האחורי של כדור הארץ.

מוציאים את העין המנותחת מתמיסת החיץ באמצעות מלקחיים ומניחים אותה על מגבון משימה יבש כשהקרנית פונה כלפי מטה. גרור בעדינות את הקרנית מעל פני השטח של המגבון כדי לייבש אותו. החל טיפה של דבק מיידי לתחתית צלחת פטרי 50 מילימטר ולתקן את הפלטפורמה אליו.

מניחים את המנה על צלחת הבמה של מיקרוסקופ סטריאו, כך הבאר עם הדבק הוא בתצוגה. כדי להתאים את העין בבארות הפלטפורמה של צלחת פטרי, להוסיף שלושה microliters של דבק מיידי. בזהירות למקם אותו לתוך הבאר במהירות להתאים, כך האחורי של העדשה פונה כלפי מעלה.

ייבשו את הצד החשוף של העדשה על ידי הכתמה עדינה עם הפינה של ניגוב יבש. למדידת התגובה הוויסקולאסטית הזונורית, הפעל את קנה המידה, הנח את צלחת הפטרי בקנה המידה, ולאחר מכן התחל את תוכנית רישום קנה המידה ואת תוכנת המצלמה. הפעל את בקר הסרוומוטור.

הפעל את יישום הבקר במחשב והגדר את פרמטרי התנועה עם מרווחים של 50 מיקרומטר. צור כיפוף של 90 מעלות במוט נימי. החלק את הנימים המכופפים לתוך מחזיק הבדיקה הנימית והידק את הברגים המאבטחים.

לקצה הנימי, מוסיפים חרוז קטן של דבק ריפוי UV. הזז את קצה הבדיקה הנימית באמצעות ההתאמות הידניות על המניפולטור והנח אותו ישירות מעל החלק העליון של העדשה. באמצעות בדיקה חזותית קדמית ותצוגה צדדית באמצעות מצלמת מיקרוסקופ, בדוק כי החלק התחתון של דבק UV מופיע מרוכז מעל החלק העליון של העדשה.

תוך כדי התבוננות במצלמה, הנמיכו את קצה הבדיקה עד שדבק ה- UV ייצור קשר עם העדשה ויכסה 1/3 עד 1/2 מהמשטח העליון שלה. לרפא את הדבק באמצעות מקור אור UV כיווני כמעט גלוי של 380 עד 400 אורך גל ננומטר ועוצמה של כמילי-ואט אחד. מוסיפים את תמיסת PBS לצלחת הפטרי עד שהעין מכוסה לעומק של שני מילימטרים לפחות.

מניחים עדשה גלילית מול המיקרוסקופ ובאופן קרוב לצלחת פטרי מבלי לגעת בה. בו-זמנית, הפעל את הרישום בתוכנית שעון עצר. צלם תמונה של העין והגשוש באמצעות המצלמה.

לאחר 60 שניות, התחל תזוזה של 50 מיקרומטר. חזור על הפעולה כל 60 שניות עד להשלמת הניסוי כפי שצוין על ידי שבירת כל הסיבים הזונוריים. שמור את נתוני רישום קנה המידה עם השלמת הפעלה וייצא אותם לתבנית גיליון אלקטרוני תואמת.

כמו כן, שמור את תמונות העדשה שהושגו במהלך הריצה. יבא את הנתונים לגיליון אלקטרוני. באמצעות קריאת קנה המידה הראשונה והאחרונה, אינטרפולציה של הסחף בקריאה ברקע לאורך זמן עקב אידוי, ולאחר מכן הפחת את הרקע האינטרפולציה מהקריאה בכל נקודת זמן.

לאחר ביצוע הבדיקה ותיקון לאידוי, הגרף של הנתונים הצמיגיים הפוך. הגודל של הכוחות המיידיים והרגועים גדל עם כל צעד עד כ 1,000 שניות, ואז יורד כמו הסיבים הזונולריים מתחילים לשבור עד נקודת הזמן 1, 500 השניה הוא הגיע כאשר כל הסיבים שבורים. להדגמה זו, התגובה הצמיגית עבור סוג פראי ו MAGP-1 עכברים לקויים הושוו גם.

בזמן הראשוני של אפס עד 600 שניות, הגרפים דומים זה לזה דבר המצביע על כך שהתכונות הצמיגיות של הסיבים הזונולריים לא שונו באופן משמעותי. עם זאת, בעכבר נוקאאוט MAGP-1, הסיבים לשבור בטרם עת. כוחות שבירת סיבים זונולריים הושגו בשיטת משיכה למעלה עבור MAGP-1 לעומת עכברים מסוג בר בשלבים בני חודש ושנה.

התוצאות הצביעו על כך שחוזק הסיבים עולה עם הגיל לעכברים מסוג בר. כל מגע מקרי עם צלחת פטרי במהלך שלבים אלה עלול לגרום לקיר העין לזוז ביחס לעדשת העין, מה שעלול לפגוע בסיבים הזונולריים. בדיקה מושכת זו מסייעת בזיהוי חלבונים התורמים לחוזק המתיחה של מיקרופיברילים.

נשתמש במידע זה כדי לבנות מודלים מציאותיים יותר של פנים הסיבים הזונולריים.