קביעת תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם בהתפתחות מוקדמת עם קריספנטים אימהיים

תפקידם של גנים רבים המתבטאים באימהות במהלך ההתפתחות המוקדמת אינו ידוע כיום. טכניקת קריספר אימהית זו מאפשרת זיהוי מהיר של גנים בעלי השפעה אימהית ותפקידם בהתפתחות. ריבוי הרנ"א מנחה את הרנ"א לגן יחיד, ומאפשר לחוקרים לזהות פנוטיפים חדשים של השפעה אימהית בדור אחד.

מחקר זה מועיל להבנת הפונקציה של תעתיקי mRNA בגמטות, הנחוצים לעוברים מוקדמים. המפתח לטכניקה זו הוא להזריק מיקרו לעוברים בשלב מוקדם בשלב של תא אחד, ולבדוק את רוב הרנ"א המנחה יכול לבצע מוטציות סומטיות בעוברים המוזרקים. כדי ליצור תבנית RNA מנחה עבור כל אוליגונוקלאוטיד ספציפי לגן, יש לנתח את האוליגונוקלאוטיד הקבוע ולמלא את השלוחות בפולימראז DNA T4.

לאחר הרכבת ארבע תבניות הרנ"א המנחות, יש לטהר ולרכז אותן יחד באמצעות ערכת ניקוי DNA ורכזת. סנתז את תערובת ה-sgRNA מתבנית ה-RNA של הבחור המאוגד, באמצעות ערכת שעתוק T7 במבחנה, ובצע את התעתיק במבחנה כמתואר בכתב היד. כדי לוודא את שלמות ה-sgRNA, יש להטיל 1% אגרוז 0.5 מיקרוגרם למיליליטר, ג'ל אתידיום ברומיד טריס-בוראט-EDTA.

הניחו את הג'ל המוצק במאגר הריצה Tris-Borate-EDTA. מערבבים תערובת sgRNA אחת של מיקרוליטר, ומאגר טעינה אחד של ג'ל RNA של מיקרוליטר. טען דגימה זו בג'ל והפעל את הג'ל ב 100 וולט במשך חמש דקות.

דמיינו את הפסים באמצעות אור אולטרה סגול. הגדר צלבים מסוג פראי ותיבות הזדווגות של דגי זברה. החזיקו את הדגים הזכריים והנקביים באותו מיכל, אך הפרידו ביניהם באמצעות מחיצה של תיבת הזדווגות, או כפי שמוצג כאן, על ידי הצבת הנקבה בתוך מיכל הטלת ביצים.

לאחר הרכבת קוקטייל ההזרקה, אפשרו לזכר ולנקבה להזדווג על ידי הסרת מחיצת תיבת ההזדווגות, או כפי שמוצג כאן, על ידי הצבת הזכר באותה תוספת הטלת ביצים כמו הנקבה. כדי לסנכרן את העוברים, אספו אותם לאחר 10 דקות באמצעות מסננת פלסטיק, ושטפו אותם לצלחת פטרי באמצעות מדיה 1XE3. הוציאו 10 עד 15 עוברים והכניסו אותם לצלחת פטרי נפרדת כדי לשמור אותם כבקרות לא מוזרקות.

החזירו את העוברים הנותרים לבארות צלחת ההזרקה. להזריק תמיסת sgRNA של חלבון ננוליטר אחד, לתוך דיסק הבלסטו המתפתח של עובר של תא אחד. השתמשו במלקחיים כדי לשבור את קצה המחט הסתומה וכיילו מחדש את המחט כדי להוציא בולוס ננוליטר אחד.

למחרת לאחר ההזרקה, אספו שישה עוברים בריאים שהוזרקו ושני עוברי בקרה מהצלחת הלא מוזרקת. הכניסו כל עובר בנפרד לתוך באר אחת של צינור רצועת PCR ותייגו את החלק העליון של הצינורות. תכנן פריימרים ייחודיים לסינון עבור כל אתר מדריך כדי להגביר מקטע דנ"א מזווג של 100 עד 110 בסיסים הכולל את אתר היעד CRISPR-Cas9.

במידת האפשר, מקם את אתר היעד באמצע הקטע המוגבר, ואפשר זיהוי של מחיקות גדולות יותר. עבור כל אחד מארבעת אתרי היעד המנחים, הגדר שמונה תגובות PCR של 25 מיקרוליטרים באמצעות חמישה מיקרוליטרים של הדנ"א העוברי היחיד המוכן ו-20 מיקרוליטרים של תערובת ה-PCR, והנחה תערובת פריימרים ספציפית לסינון, כדי לזהות מוטציות סומטיות באתר היעד. יצוק 2.5% אגרוז, 0.5 מיקרוגרם למיליליטר אתידיום ברומיד טריס-בוראט-EDTA ג'ל באמצעות מסרקים היוצרים בארות ברוחב של כ-0.625 ס"מ.

לאחר מכן הכניסו את הג'ל המתמצק לתא האלקטרופורזה המכיל את חיץ הריצה Tris-Borate-EDTA. הוסף חמישה מיקרוליטרים של צבע 6X טעינה למוצר PCR. טען 25 מיקרוליטר של תערובת זו לתוך הג'ל, להבטיח כי דגימות מוזרק ובקרה פועלים על אותה שורת ג'ל.

לאחר שכל הדגימות נטענות, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של אתידיום ברומיד לכל ליטר אחד של חיץ ריצה Tris-Borate-EDTA, עד לקצה החיובי של קופסת הג'ל. הפעל את הג'ל ב-120 וולט עד שאיסורי הדנ"א ייפתרו או שהדנ"א יתקרב לקצה הנתיב. כדי לזהות את הפנוטיפים של ההשפעה האימהית ואת העוברים של הקריספר האימהי, הגדירו את הנקבות המוזרקות F0 כנגד זכרים מסוג בר ושלטו בצלבים מסוג בר בתיבות הזדווגות סטנדרטיות של דגי זברה בשעות אחר הצהריים שלפני הניסוי.

מניחים את הדגים הזכריים והנקביים באותו מיכל, אך מפרידים ביניהם באמצעות מחיצה של תיבת הזדווגות, או מניחים את הנקבה בתוך מיכל הטלת ביצים. בבוקר הניסוי, אפשרו לזכר ולנקבה להתחיל להזדווג על ידי הסרת מחיצת תיבת ההזדווגות, או הצבת הזכר באותה תוספת הטלת ביצים כמו הנקבה. אספו את העוברים כל 10 דקות על ידי הזזת הביצה המטילה לתוך תחתית מיכל הזדווגות חדש המכיל מי מערכת מתוקים, ותייגו את המיכל עם תג המזהה את נקבת F0 הבודדת.

לוקחים את מיכל ההזדווגות הישן ויוצקים את המים דרך מסננת T כדי לאסוף את העוברים ממצמד בודד אחד של 10 דקות. תחת מיקרוסקופ מנתח עם מקור אור טרנסצנדנטי, התבונן בעוברים העוברים העוברים התפתחות מדי שעה, במשך שש עד שמונה השעות הראשונות, ומדי יום במשך חמשת הימים הבאים. להעביר את עוברי הקריספר האימהיים הפוטנציאליים לצלחת פטרי המכילה מדיה 1XE3, ולבדוק פנוטיפ מורפולוגי 24 שעות לאחר ההפריה, ואת הכדאיות, בחמישה ימים לאחר ההפריה.

אחר הצהריים שלפני הניסוי, הקימו זוגות הזדווגות של נקבות F0 על ידי הפרדה פיזית פיזית בין זכרים מסוג בר לבין הנקבות, באמצעות מחיצת תיבת הזדווגות או הנחת הנקבה בתא הטלת הביצים. בבוקר הניסוי, הסר את המחיצה הפיזית כדי להתחיל את ההזדווגות. בסימן הראשון של הטלת ביצים, להפסיק את הרבייה על ידי הפרדת הזכר ונקבות F0, ולשמור על כל נקבה מופרדת F0 בתיבות הזדווגות בודדות.

לאחר הפריה חוץ גופית, אפשרו לעוברים ההפלואידים להתפתח עד לתצפית על פנוטיפ הקריספר האימהי, והכניסו את העוברים הללו לצלחת פטרי אחרת. לאחר שזוהו עוברי הקריספר האימהיים, אפשרו להם להתפתח במשך שש שעות לפחות לאחר ההפריה. כדי לחלץ את הדנ"א הגנומי מלפחות 10 עוברי קריספר הפלואיד אימהיים, הכניסו עובר הפלואיד יחיד לבאר בודדת של צינור רצועת PCR, הסירו עודפי E3 מהבאר והוסיפו 50 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסידי 50 מילימולר.

דוגרים על העוברים במשך 20 דקות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס, ומקררים אותם לארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של חומצה טריס-הידרוכלורית טוחנת אחת עם pH 7.5, ומערבולות במשך חמש עד 10 שניות. כדי לזהות אילו אתרים מנחים מכילים אינדלים, תכננו פריימרים לריצוף כדי להגביר מקטע דנ"א, כולל כל ארבעת אתרי היעד של CRISPR/Cas9.

הגדר שני 25 מיקרוליטרים של תגובות PCR לכל עובר, באמצעות חמישה מיקרוליטרים של הדנ"א הגנומי המוכן, ופריימרים לריצוף. לאחר סיום ה-PCR, יש לטהר ולרכז את שתי הדגימות באמצעות ערכת ניקוי DNA ורכז, ולהגיש את מקטע הדנ"א לריצוף סנגר, תוך שימוש בפריימרים לריצוף קדימה ואחורה. יש לקבץ את כל הרנ"א המנחה יחד עם אזורים חופפים מינימליים עד אפסיים בין רנ"א מנחה במהלך יצירת הקריספר האימהי.

אם נוצרו אינדלים, יש לראות כתם בדגימות המוזרקות על ג'ל אגרוז, אך לא בבקרה הלא מוזרקת. ניתן להשתמש בשיטת הקריספר האימהי כדי לבצע פנוקופיה של מוטציות ידועות באפקט האימהי, כגון מוטלי, TMI ואאורה. כדי לזהות את הנגעים הגנטיים התורמים לפנוטיפ הקריספר האימהי, זרע מטופל UV והפריה חוץ גופית משולבים ליצירת הפלואידים של קריספר אימהי.

יצירת ההפלואיד מאפשרת לסנגר ריצוף של האלל האימהי, וזיהוי של אינדלים של קריספר אימהי. כאשר מזהים פנוטיפ אפקט לא מאמין, הוא חיוני כי אתה מסוגל לראות את זה במספר נקבות F0, כי זה מגדיל את הסיכויים כי הפנוטיפ נגרם על ידי אובדן תפקוד, לא מחוץ למטרה או השפעות לא ספציפיות. לאחר זיהוי פנוטיפ של השפעה אימהית, ניתן להשתמש בעוברי הקריספר האימהיים כדי לבחון את ההשפעות על היבטים שונים של העובר המוקדם, כגון שלד הסינוסים או הפרדת DNA.

זה מאפשר לחוקרים להבין את הגורם המולקולרי של הפנוטיפ. שיטה זו בודקת באופן ישיר את תפקודם של גנים לא ידועים המתבטאים באופן אימהי בדור אחד, ומזרזה את הבנתנו את התהליכים, הפועלים במהלך העובר המוקדם.