גירוי וניתוח נוירוגנזה למבוגרים במוח המרכזי של דרוזופילה

פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה מדגים שיטת פגיעה מוחית מרכזית המפעילה נוירוגנזה למבוגרים Drosophila, שבו בדרך כלל אין. אנו צופים כי שימוש בטכניקה זו כדי להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס נוירוגנזה למבוגרים יהיה רלוונטי להתחדשות עצבית אנושית. לימוד טכניקה זו דורש סבלנות והתמדה.

אנו ממליצים לתרגל על חמישה עד 10 מוחות מדי יום במשך מספר שבועות לפני איסוף המוח לניתוח. לאחר יראת זבובים על כרית דו תחמוצת הפחמן. מיין זבובים צעירים של F1 תוך שש שעות מהעיקול והניח אותם בבקבוקונים נקיים המכילים מזון עם 40 זבובים או פחות לכל בקבוקון.

אם מתכננים לתייג תאים מתחלקים עם EdU להכין 200 microliters של 50 מיל או יותר EdU ב 10% סוכרוז ומניחים את הפתרון מוכן על 23 מילימטר עגול כיתה שלוש נייר מסנן במין ריק, ואז למקם את זבובים זכר במין להאכלה מראש שש שעות לפני הפציעה. לאחר מכן, לחטא Minutien פינס על ידי הצבת כ 100 סיכות בצינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר מלא 70%אתנול במשך חמש דקות. לאחר מכן לחטא את כרית פחמן דו חמצני מברשת צבע על ידי ריסוס 70% אתנול וניגוב יבש עם רקמה נקייה ללא מוך.

לאחר שהכלים נקיים ויבשים, העבירו 40 זכרי F1 ממוינים או פחות אל כרית הנקייה והפרידו אותם לשתי קבוצות. קבוצה אחת תשמש כשליטת זבובים ללא פגע. וקבוצת הניסוי השנייה תהיה נתונה לפגיעה מוחית טראומטית חודרת.

לאחר מכן, באמצעות מלקחיים למשוך ארבעה עד חמישה סיכות Minutien חדש מתוך צינור צנטריפוגה מיקרו ומניחים אותם ליד הקצה של כרית פחמן דו חמצני. לאחר מכן, תחת טווח הניתוח, בחר סיכת מינוטין ישרה עם נקודה חדה. יש לעשות שימוש חוזר בפינים חדים ולהניח סיכות פגומות או קהות בצינור נפרד המכיל 70% אתנול לסילוק בטוח.

לאחר מכן, עבור זבובים עם מתג הגנוטיפ הצלב הסטנדרטי על מנורת המיקרוסקופ הסטריאו מצוידת במסנני העירור והפליטה המתאימים לחלבון הפלואורסצנטי הירוק המאפשר עירור ב 440 עד 460 ננומטר ומאפשר הדמיה ב 500 עד 560 ננומטר. לאחר מכן בחר זבוב קבוצת הניסוי ולמקם את הזבוב כך הנסיין יש מבט גופרית של קפסולת הראש עם הזבובים ראש ימינה. באמצעות מלקחיים להרים ולהחזיק את סיכת Minutien שנבחר ביד אחת, ואת מברשת צבע ביד השנייה.

לאחר מכן מניחים את המברשת על החלק המקדים של בית החזה של גבי ולדחוף למטה בעדינות כדי לייצב את הזבוב. כוונו את קצה סיכת Minutien לגופי תאי הפטריות בצד ימין של הראש וחדרו את קפסולת הראש. אם השימוש בציוני דרך מכוון לחתך הראש הגבי בין האוקלי לשפת הגב של העין.

לאחר השלמת הפציעה, השתמש במכחול כדי לדחוף את הראש בעדינות את סיכת Minutien. אם השימוש במוח לרצף RNA או QRT PCR גורם לנו לפציעה שנייה בצד שמאל של הראש. לאחר שכל הזבובים הניסיוניים נפצעו, הכניסו את השליטה ונפגעו בזבובים לבקבוקונים נפרדים המכילים מזון.

הנח את הבקבוקונים אופקית כדי למנוע זבובים להיתפס במזון. מניחים את זבובי הצלב הסטנדרטיים ב 25 מעלות צלזיוס וטיסות פרמטווין ב 30 מעלות צלזיוס לגיל. אם הזדקנות ארוכה יותר מ 24 שעות להעביר את הזבובים על מזון נקי כל יום עד יומיים.

עלייה משמעותית בשגשוג נצפתה 24 שעות לאחר פציעה באמצעות אנטי pH3 סמן לתאים העוברים מיטוזה באופן פעיל. כשלושה תאים חיוביים pH3 נצפים בכל אחד מהמוחות המרכזיים שליטה. ו-11 תאי pH3 חיוביים בכל אחד מהמוחות המרכזיים הפצועים.

עד שבעה ימים, בממוצע של שני תאים חיוביים EdU נמצאים בכל אחד ממוחות תא הבקרה. ו-11 תאים חיוביים של EdU בכל אחד מהמוחות המרכזיים הפצועים, שזה דומה לתוצאות שהושגו 24 שעות לאחר פציעה עם נוגדן pH3. ב 14 ימים פקדים ממוצע תא חיובי EdU אחד לכל מוח מרכזי, ומוח פצוע ממוצע 29 תאים חיוביים EdU לכל מוח מרכזי.

ההדגמות על כך שהתפשטות התאים נמשכת לפחות בשבוע השני בעקבות פגיעה מוחית טראומטית חודרת. התגובה השגשוג החזקה ביותר במוח המרכזי נצפתה כאשר המוחות נפגעים ב -24 השעות הראשונות לאחר העיקול. עד שבעה ימים לאחר העיקול, פציעה חודרת עדיין גורמת לעלייה משמעותית בשגשוג.

עם זאת, על ידי 14 ימים, היכולת של התאים לחלק פוחתת באופן משמעותי לתא אחד מחלק לכל מוח. וזה דומה לזה של מוחות שליטה. באמצעות מערכת תיוג פרמטווין יותר שיבוטים פרמטווין זוהו בדגימות פצועות ביומיים, בשבועיים, בהשוואה לבקרות.

עם מספר השיבוטים גדל עם הזמן בעקבות פציעה. שבועיים לאחר הפציעה היו נוירונים חדשים בגוף הפטריות ב-50% מהמוחות הפצועים. נוירונים חדשים אלה הקרינו דנדריטים שלהם בערך קליפס גוף פטריות, אקסונים לאונות הגוף פטריות.

אזורים אחרים במוח שנראו להתחדש כוללים את גוף אליפסואיד אונות אנטנה וקרן לרוחב. הקפד להשתמש סיכת Minutien חד בעת ביצוע פגיעות המוח כמו שימוש בסיכה עמום או כפוף יגדיל את התמותה. כמו כן הקפד לא לדחוף חזק מדי על הזבובים עם מברשת צבע כמו זה גם יגדיל את התמותה.

בעקבות הליך זה, אימונוהיסטוכימיה יכולה לשמש כדי לכמת את ההתפשטות העצמית וגם לזהות נוירונים חדשים גליה.