Name: ייצור יעיל וניתן להרחבה של גרסאות ציד אנושיות באורך מלא בתאי יונקים באמצעות מערכת ביטוי חולפת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: למד פרוטוקול יעיל לייצור גרסאות ציד אנושיות באורך מלא בתאי HEK293. השיטה מבטיחה טוהר של מעל 95% ומספקת חלבון איכותי גבוהה לחקר מחלת הנטינגטון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למחלקה למדעי הרוקחות, אוניברסיטת מדינת ניו יורק בבאפלו, על ביצוע ניתוח טרשת נפוצה של HTT. עבודה זו הייתה מאמץ משותף עם קרן CHDI. אנו מודים באופן ספציפי לאליזבת מ. דוהרטי; איגנסיו מוניוז-סנג'ואן; דאגלס מקדונלד, קרן CHDI; ורורי קרטיס, קוריה, על הקלט שלא יסולא בפז שלהם במהלך הכנת כתב היד הזה. אנו מודים גם למישל לוצ'ה, מית'רה מחמודי וסטפני פוקס על תמיכתן במאמץ מחקרי זה.

<ol><li>Walker, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease.</a> Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).</li>
<li>McColgan, P., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+a+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: a clinical review.</a> European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).</li>
<li>Duyao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+repeat+length+instability+and+age+of+onset+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide repeat length instability and age of onset in Huntington's disease.</a> Nature Genetics. 4 (4), 387-392 (1993).</li>
<li>MacDonald, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Nasir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Huntington%27s+disease+gene+results+in+embryonic+lethality+and+behavioral+and+morphological+changes+in+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes.</a> Cell. 81 (5), 811-823 (1995).</li>
<li>Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hdh+in+the+brain+and+testis+results+in+progressive+neurodegeneration+and+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice.</a> Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).</li>
<li>Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+huntingtin+by+cyclin-dependent+kinase+5+is+induced+by+DNA+damage+and+regulates+wild-type+and+mutant+huntingtin+toxicity+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).</li>
<li>Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+huntingtin+in+the+adult+mouse+leads+to+progressive+behavioral+deficits%2C+bilateral+thalamic+calcification%2C+and+altered+brain+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis.</a> PLoS Genetics. 13 (7), 1006846(2017).</li>
<li>Dragatsis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+early+embryonic+deletion+of+huntingtin+from+pyramidal+neurons+on+the+development+and+long-term+survival+of+neurons+in+cerebral+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum.</a> Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).</li>
<li>Benn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+modulates+transcription%2C+occupies+gene+promoters+in+vivo%2C+and+binds+directly+to+DNA+in+a+polyglutamine-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Huntingtin modulates transcription, occupies gene promoters in vivo, and binds directly to DNA in a polyglutamine-dependent manner.</a> Journal of Neuroscience. 28 (42), 10720-10733 (2008).</li>
<li>Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The biology of huntingtin.</a> Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).</li>
<li>Davies, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+neuronal+intranuclear+inclusions+underlies+the+neurological+dysfunction+in+mice+transgenic+for+the+HD+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of neuronal intranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HD mutation.</a> Cell. 90 (3), 537-548 (1997).</li>
<li>DiFiglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+huntingtin+in+neuronal+intranuclear+inclusions+and+dystrophic+neurites+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain.</a> Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).</li>
<li>Gutekunst, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+neuropil+aggregates+in+Huntington%27s+disease%3A+Relationship+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nuclear and neuropil aggregates in Huntington's disease: Relationship to neuropathology.</a> Journal of Neuroscience. 19 (7), 2522-2534 (1999).</li>
<li>Hodgson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+YAC+mouse+model+for+Huntington%27s+disease+with+full-length+mutant+huntingtin%2C+cytoplasmic+toxicity%2C+and+selective+striatal+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration.</a> Neuron. 23 (1), 181-192 (1999).</li>
<li>Hoffner, G., Djian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+aggregation+in+Huntington+disease%3A+does+structure+determine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine aggregation in Huntington disease: does structure determine toxicity.</a> Molecular Neurobiology. 52 (3), 1297-1314 (2015).</li>
<li>Waldvogel, H. J., Kim, E. H., Tippett, L. J., Vonsattel, J. P. G., Faull, R. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathology+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Behavioral+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The neuropathology of Huntington's disease.</a> Current Topics in Behavioral Neurosciences. 22, 33-80 (2014).</li>
<li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+conformation+of+polyglutamine+track+revealed+by+a+crystal+structure+of+huntingtin+N-terminal+region+with+insertion+of+three+histidine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues.</a> Prion. 7 (3), 221-228 (2013).</li>
<li>Hoop, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+exon+1+fibrils+feature+an+interdigitated+%CE%B2-hairpin-based+polyglutamine+core%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intein-based+strategy+for+the+production+of+tag-free+huntingtin+exon+1+proteins+enables+new+insights+into+the+polyglutamine+dependence+of+Httex1+aggregation+and+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
<li>Seong, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+facilitates+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin facilitates polycomb repressive complex 2.</a> Human Molecular Genetics. 19 (4), 573-583 (2009).</li>
<li>Li, W., Serpell, L. C., Carter, W. J., Rubinsztein, D. C., Huntington, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+full-length+human+huntingtin%2C+an+elongated+HEAT+repeat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of full-length human huntingtin, an elongated HEAT repeat protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15916-15922 (2006).</li>
<li>Vijayvargia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin%27s+spherical+solenoid+structure+enables+polyglutamine+tract-dependent+modulation+of+its+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Huntingtin's spherical solenoid structure enables polyglutamine tract-dependent modulation of its structure and function.</a> eLife. 5, 11184(2016).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+production+in+human+cells+and+biochemical+characterization+of+full-length+normal+and+mutant+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Scalable production in human cells and biochemical characterization of full-length normal and mutant huntingtin.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121055(2015).</li>
<li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryo-electron+microscopy+structure+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cryo-electron microscopy structure of huntingtin.</a> Nature. 555 (7694), 117-120 (2018).</li>
<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+mutant+and+wildtype+huntingtin+proteins+produced+from+a+toolkit+of+scalable+eukaryotic+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of mutant and wildtype huntingtin proteins produced from a toolkit of scalable eukaryotic expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (17), 6986-7001 (2019).</li>
<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAP40+orchestrates+huntingtin+structure+for+1+differential+interaction+with+polyglutamine+2+expanded+exon+1%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+polyQ+expansion+does+not+alter+the+conformation+of+the+Huntingtin-HAP40+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex.</a> Structure. 29 (8), 804-809 (2021).</li>
<li>Colin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+phosphorylation+acts+as+a+molecular+switch+for+anterograde%2Fretrograde+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin phosphorylation acts as a molecular switch for anterograde/retrograde transport in neurons.</a> EMBO Journal. 27 (15), 2124-2134 (2008).</li>
<li>Thompson, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK+phosphorylates+Huntingtin+and+targets+it+for+degradation+by+the+proteasome+and+lysosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome.</a> Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).</li>
<li>Ratovitski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+%28PTMs%29%2C+identified+on+endogenous+Huntingtin%2C+cluster+within+proteolytic+domains+between+HEAT+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications (PTMs), identified on endogenous Huntingtin, cluster within proteolytic domains between HEAT repeats.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2692-2708 (2017).</li>
<li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+western+blot+data%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A defined methodology for reliable quantification of western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li>
<li>Tarazona, M. P., Saiz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+SEC%2FMALS+experimental+procedures+and+theoretical+analysis+for+studying+the+solution+properties+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56 (1-3), 95-116 (2003).</li>
<li>Folta-Stogniew, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomeric+states+of+proteins+determined+by+size-exclusion+chromatography+coupled+with+light+scattering%2C+absorbance%2C+and+refractive+index+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors.</a> Methods in Molecular Biology. 328, Clifton, N.J. 97-112 (2006).</li>
<li>McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+indices+of+proteins+in+relation+to+amino+acid+composition+and+specific+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).</li>
<li>Atwal, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+has+a+membrane+association+signal+that+can+modulate+huntingtin+aggregation%2C+nuclear+entry+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity.</a> Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).</li>
<li>Kegel-Gleason, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+interactions+with+membrane+phospholipids%3A+Strategic+targets+for+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Huntington%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Huntingtin interactions with membrane phospholipids: Strategic targets for therapeutic intervention.</a> Journal of Huntington's Disease. 2 (3), 239-250 (2013).</li>
<li>Michalek, M., Salnikov, E. S., Werten, S., Bechinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+interactions+of+the+amphipathic+amino+terminus+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane interactions of the amphipathic amino terminus of huntingtin.</a> Biochemistry. 52 (5), 847-858 (2013).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Nissley, D. A., O'Brien, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+co-translational+processing+plays+a+role+in+huntington%27s+pathogenesis-A+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered co-translational processing plays a role in huntington's pathogenesis-A hypothesis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 54(2016).</li>
<li>Kumar, N., Gammell, P., Clynes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+control+strategies+to+improve+productivity+and+survival+during+CHO+based+production+culture%3A+A+summary+of+recent+methods+employed+and+the+effects+of+proliferation+control+in+product+secreting+CHO+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture: A summary of recent methods employed and the effects of proliferation control in product secreting CHO cell lines.</a> Cytotechnology. 53 (1-3), 33-46 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים עם התוכן של מאמר זה.

אנו מתארים כאן שיטת טרנספקציה, ביטוי וטיהור חולפת ליצירת מבנים מרובים של חלבוני FL HTT עם טוהר והומוגניות מתאימים לשימוש כסטנדרטים לפיתוח בדיקת אימונואסאי וטרשת נפוצה, בקרות לניתוח כתמים מערביים ולמחקרי מבנה-תפקוד. שיטת ביטוי חולפת זו ניתנת להרחבה ורב-תכליתית ומאפשרת למשתמש ליצור כמויות נמוכות של מיליגרם של גרסאות FL HTT ביעילות רבה יותר מאשר שימוש בקווי תאים יציבים או בשיטות מבוססות וירוסים שתוארו קודם לכן21,22,23,24. באופן שגרתי, ניתן להפיק 2-5 מ"ג של FL HTT מטוהר מאוד מייצור חלבון בקנה מידה של 2 ליטר תוך פחות משבוע באמצעות שיטת הביטוי החולפת לאחר בניית הפלסמיד, עם תפוקה אופיינית של 1-2.5 מ"ג של FL HTT לליטר של תרבית תאים.
שיטת הביטוי החולפת המתוארת כאן מתגברת על מכשולים רבים בביטוי קווי תאים יציבים, כגון הזמן הארוך הדרוש ליצירת קווי תאים וקשיים באחסון ושמירה על קווי תאים יציבים. PEI הוא גם זול יחסית בהשוואה לריאגנטים אחרים בשוק, מה שהופך את הטרנספקציה בקנה מידה גדול לכדאית מבחינה כלכלית. יש גם מגבלות בפרוטוקול: יעילות ההעברה תלויה במידה רבה באיכות הפלסמידים, בצמיחת התאים האופטימלית ובמידת האחסון וההכנה של PEI. המפעילים צריכים לנקוט זהירות מיוחדת ולבצע בקרות איכות באותם צעדים קריטיים כדי למנוע ירידה דרסטית בתפוקת החלבון. שרף Anti-FLAG המשמש בפרוטוקול הוא גם יקר יחסית ומראה לכידה מופחתת של FL HTT לאחר מספר טיהורים והתחדשות. חוקרים מסוימים עשויים למצוא את זה מעשי יותר לעבור לתג אחר כדי לאפשר התחדשות חזקה יותר של שרף הזיקה.
קווי תאים שונים ותנאי ביטוי שונים נבדקו כדי למטב את רמות הביטוי של FL HTT. תאי HEK293 נבחרו לביטוי של FL HTT בגלל הביטוי הגבוה של חלבון וקלות הטיפול בפורמט תרבית מתלים, מה שהופך את השיטה למתאימה לביטוי בקנה מידה גדול בשייקרים או בביוריאקטורים. ניתן להשיג רמת ביטוי גבוהה יותר של חלבון FL HTT בטמפרטורות תרבותיות נמוכות יותר כגון 32 מעלות צלזיוס במקום להשתמש בטמפרטורה המקובלת של 37 מעלות צלזיוס. ייתכן שהטמפרטורה הנמוכה יותר עשויה להאט את סינתזת החלבון ולקדם קיפול נכון של FL HTT40. עם זאת, תופעה זו אינה ספציפית ל- FL HTT או לקווי התאים שנבדקו. הטמפרטורה המופחתת לאחר הטרנספקציה נמצאת בשימוש נרחב בביטוי חלבונים פרמצבטיים בתאי CHO. למרות שהמנגנון אינו מובן במלואו, ההערכה היא שטמפרטורות נמוכות עוצרות את מחזור התאים בשלב G1 ומסיטים את האנרגיה התאית לייצור חלבונים41.
HTT באורך מלא מטוהר מתאי יונקים יחד עם המלווה Hsp7024, ושלבי שטיפה של Mg-ATP יכולים להסיר את חלבון Hsp70. באופן מעניין, Hsp70 משותף לא נצפה ב-FL HTT מטוהר ממערכת ביטוי תאי חרקים21,22,23. זה עשוי לשקף הבדל ב-PTMs של FL HTT או בתגובות חלבון הלם חום לביטוי יתר של FL HTT בתאי יונקים וחרקים. לאחר הסרת החלבון הרקומביננטי מ-Hsp70, נדרשים דטרגנטים לא יוניים כגון CHAPS או DDM כדי לייצב את הצורה המונומרית של FL HTT.
מצבי האוליגומריזציה של גרסאות FL HTT נותחו באמצעות Blue Native PAGE ו- SEC-MALS. חלק קטן של HTT דימרי ואוליגומרי מסדר גבוה יותר היה נוכח כאשר נותח על ידי Blue Native PAGE או SEC-MALS. יש לציין כי נראה כי אוליגומרים בעלי סדר גבוה יותר שנוצרו על ידי FL HTT אינם מתואמים עם אורך polyQ, ואפילו מוטציית המחיקה של Exon1 מציגה יחס דומה של אוליגומר-דימר-מונומר. ההבדלים בפועל בתכולת האוליגומרים בין מבנים אלה נובעים ככל הנראה מהבדלים קלים בייצור ובטיפול בכל אצווה. בניגוד לאגרגטים וסיברילים שנוצרו על ידי HTT Exon140,41, האוליגומרים בעלי הסדר הגבוה יותר של FL HTT נותרו מסיסים וניתן היה לנתח אותם על ידי SEC ו- Native PAGE.
FL HTT מונומרי מטוהר הוא יציב יחסית בלבד. אחסון ממושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, דגירה קצרה בטמפרטורת החדר או ריכוזים > 1 מ"ג/מ"ל ימירו כולם FL HTT מונומרי לצורות דימריות ואוליגומריות בעלות סדר גבוה יותר למרות שלא נצפו משקעים נראים לעין בתנאים אלה. FL HTT מונומרי מטוהר שנשמר ב-≤1 מ"ג/מ"ל נשאר יציב יחסית ב-80°C- במאגר האחסון (50 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 5% v/v גליצרול, 0.5% w/v CHAPS ו-5 mM DTT) כפי שתואר קודםלכן 24. עד 6 מחזורי הפשרה בהקפאה של FL HTT שהוכנו ואוחסנו באופן זה לא גרמו למשקעים נראים לעין של החלבון, אם כי מעבר קל למצב אוליגומרי גבוה יותר נצפה על ידי SEC-MALS (איור משלים S2). דגימות נותחו גם על ידי SDS PAGE לאחר מחזורי הפשרה חוזרים ונשנים. לא נצפו משקעים נראים לעין; לא נצפו אגרגטים או מוצרי השפלה נוספים על ידי SDS-PAGE (איור משלים S3). היציבות ארוכת הטווח של FL HTT מטוהר עדיין תחת חקירה. בהיעדר נתונים חד משמעיים לטווח ארוך, אנו ממליצים לאחסן FL HTT מטוהר ב -80 °C למשך לא יותר מ 6 חודשים.
גרסאות חלבון FL HTT רקומביננטיות באיכות גבוהה והשיטות לייצורן מבוקשות מאוד על ידי קהילת המחקר HD. חלבונים אלה נמצאים בשימוש כתקנים אנליטיים של אימונואסאי וטרשת נפוצה, במחקרים מבניים ובפיתוח מבחנים חדשניים ספציפיים ל-FL HTT. שיטות הביטוי הארעיות בקנה מידה גדול המתוארות כאן ייצרו באופן עקבי כמויות מיליגרם של גרסאות FL HTT עם טוהר של >95%, וסיפקו כלים חיוניים למחקרי HTT. ייצור של עשרות מיליגרם של גרסאות FL HTT polyQ מטוהרות מאוד ומוטנטים אחרים לתמיכה במחקר HD הפך לשגרה.

מחלת הנטינגטון (HD) היא מחלה נוירודגנרטיבית נדירה המאופיינת בעיקר בתנועה מוטורית לא יציבה ולא רצונית, כמו גם בשינויים קוגניטיביים ופסיכיאטריים, כגון שינויים באישיות ואדישות 1,2. HD קשורה להרחבה של מערכת ה-CAG החוזרת הממוקמת באקסון 1 של הגן huntingtin (HTT) ליותר מ-35 חזרות, עם מספר גבוה יותר של חזרות CAG בקורלציה עם התפרצות מוקדמת יותר של המחלה 3,4. התוצר התרגומי של HTT, חלבון הנטינגטון (HTT), מעורב בחיוניות העצבית ובהתפתחות המוח 5,6,7,8,9.
HTT הוא חלבון פיגומים המדווח כמשתתף במגוון רחב של תהליכים תאיים, הובלת שלפוחית, חלוקת תאים, סיליוגנזה ואוטופגיה10,11. עם זאת, הפתוגנזה המולקולרית של HD אינה ברורה לחלוטין, וזיהוי של אינטראקטורים חלבוניים מרכזיים המתווכים את ההשפעה הפתולוגית של mHTT מורחב polyQ חסר. חלק מהמחקרים מצביעים על רווח של תפקוד רעיל מ-mHTT המונע על ידי נטיית האוליגומריזציה של חלבון ה-HTT המורחב, שכן אגרגטים של HTT זוהו בתאי עצב ובגליה בחולי HD ובמודלים של בעלי חיים של המחלה 12,13,14,15,16,17 . כדי לתדלק את חקירת התפקוד והמבנה של גרסאות FL HTT ו-mHTT ולספק לחוקרים תקני חלבון באיכות גבוהה לפיתוח בדיקות, יש צורך באספקה חזקה ומדרגית של חלבון רקומביננטי הומוגני.
בשל גודלו (aa 1-3,144, מספור המבוסס על אורך polyQ23), חוסר יציבות פרוטאוליטית ונטייה לצבירה, FL HTT הוכח כקשה לביטוי ולבידוד כחלבון מסיס. בעבר, אזור אקסון 1 (aa 2-90) של HTT התבטא וטוהר בקנה מידה גדול באמצעות תגים שונים שיכולים להגדיל את המסיסות של החלבון ב Escherichia coli18,19,20. FL HTT בא לידי ביטוי וטוהר לראשונה במערכת ביטוי תאי חרקים באמצעות baculovirus 21,22, ומבנים של מיקרוסקופיית אלקטרונים 30 Å (EM) ברזולוציה נמוכה של FL Q23-HTT ו-Q78-HTT בעלי קשרים כימיים דווחו23. החקירה של מבנה HTT התקדמה עוד יותר כאשר הייצור של FL Q17, Q46 ו- Q128-HTT עם שינויים פוסט-טרנסלציוניים מקוריים (PTMs) הושג בתאים אנושיים באמצעות קווי תאים יציבים או מערכות ביטוי אדנו-וירוס24. מחקרים אלה מצביעים על כך שלמרות ש- HTT מטוהר קיים בעיקר במצב המונומרי, הוא גם נוטה ליצור אוליגומרים מסדר גבוה ואגרגטים.
אולטרה-צנטריפוגציה אנליטית של FL Q128-HTT, עם אזור פוליQ מורחב מאוד, העניקה יותר שברים אוליגומריים ואגרגטים מאשר החלבון עם אזור הפוליQהלא מורחב 24. באמצעות קו תאים יציב, אסטרטגיה הותאמה בהצלחה לייצוב FL HTT על ידי ביטוי משותף עם שותף האינטראקציה HAP40. מבנה קריו-EM של קומפלקס FL HTT ו-HAP40 נפתר ברזולוציה ממוצעת של 4 Å באמצעות קומפלקס החלבון המטוהר (PDB:6EZ8)25. אסטרטגיית ביטוי משותף זו הותאמה בהצלחה למערכת baculovirus, וסדרה של גרסאות HTT באיכות גבוהה עם אורכי polyQ שונים בוטאו וטוהרו מתאי חרקים26. מאז, יותר מבני cryo-EM של קומפלקס HTT עם אורכי polyQ משתנים ומבני HAP40 ורזולוציה גבוהה יותר נפתרו והופקדו בבסיס נתוני החלבון27,28 (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O).
ביצענו אופטימיזציה של שיטת טרנספקציה וביטוי בתאי HEK293, תוך שימוש בפוליאתילנימין (PEI), לביטוי חולף מהיר של FL HTT. כהוכחה עקרונית, גרסאות FL HTT המכילות 23 גלוטמינים (FL Q23-HTT) טוהרו לראשונה ואופיינו באמצעות שינוי של שיטת טיהור שתוארה קודםלכן 24. שיטת העברה חולפת זו היא נוחה, יעילה מאוד ומדרגית; הוא יכול לייצר HTT מטוהר עם תפוקות של 1-2 מ"ג/ליטר, בדומה לשיטת קו התאים היציב שדווחה24. מאחר שהחלבון מיוצר בקו תאים אנושי, ל-HTT המיוצר יש סיכוי גבוה יותר להיות PTMs אנושיים מקומיים כאשר הוא נתון לניתוח פרוטאומיקה של ספקטרומטריית מסה 11,29,30,31. כמויות מיליגרם של גרסאות FL Q48-HTT, FL Q73-HTT ו-exon1-deleted (ΔExon1-HTT) של FL HTT יוצרו, מה שמוכיח כי שיטת הביטוי החולפת שימושית במיוחד בייצור מהיר של גרסאות חלופיות של HTT מבלי להיות תלויים במאמץ הגוזל זמן הנדרש להקמת קווי תאים יציבים לייצור.
הפרוטוקול הבא מדגים את השיטה הסטנדרטית המשמשת במעבדה של מחברים אלה לתרבית תאים, טרנספקציה, טיהור חלבונים ואפיון חלבונים לאחר טיהור כדי לייצר FL Q23-HTT מתרבית תאים של 2 ליטר. ניתן להרחיב את הפרוטוקול לתרביות גדולות יותר או להתאים אותו לטיהור גרסאות HTT אחרות. עד 10 תרביות תאי L של FL HTT ומוטציות שונות באתר או חיתוך של הומולוגים HTT ו- HTT בוצעו בהצלחה במעבדה תוך שימוש באותו פרוטוקול. FL HTT מטוהר מכיל אחוז גבוה של מונומרים יחד עם דימרים ואוליגומרים מסדר גבוה יותר. אותו פרופיל מצטבר נצפה בין הגרסאות המיוצרות (Q23, Q48, Q73 ונמחק Exon1). מכיוון שצבירה יכולה להתרחש כאשר לא ננקטת זהירות נכונה, נערך מחקר פורמולציה ויציבות הפשרה בהקפאה כדי לזהות את התנאים הטובים ביותר לטיפול בחלבונים. שיטות, כגון Blue Native PAGE ו-SEC/MALS-RI, מתוארות גם כדי לנתח את תוכן האוליגומרים של HTT כחלק מתהליך בקרת האיכות. כדי להועיל לקהילת המחקר של HD, פלסמידים וחלבוני HTT שתוארו במחקר זה מופקדים גם במאגר הקהילתי HD במכון קוריאל (www.coriell.org/1/CHDI).

<table><tbody><tr><td>רכז 100 kDa-Amicon</td><td>Millipore</td><td>פרוטוקול UFC910096</td><td>מספר מקטע-6.2.4</td></tr><tr><td>20x כחול מקורי PAGE מאגר ריצה</td> פרוטוקול <td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td>מספר מקטע-8.1</td></tr><tr><td>20x</td><td>TBS Thermo Fisher</td><td>PI28358</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-5.1</td></tr><tr><td>4x כחול מקורי מאגר דגימת PAGE</td> מספר פרוטוקול <td>Invitrogen</td><td>BN2003</td><td>-8.3</td></tr><tr><td>4x מאגר טעינה LDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>פרוטוקול מספר מדור-5.3</td></tr><tr><td>5 ליטר צלוחיות Erlenmeyer</td><td>קורנינג</td><td></td><td>431685 פרוטוקול מספר מדור-4.2</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל אגרוז</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>פרוטוקול מספר מדור-2.2</td></tr><tr><td>חומר נגד גושים</td><td>Thermo Fisher</td><td>0010057AE</td><td>מספר פרוטוקול -4.8</td></tr><tr><td>זיקה נגד FLAG M2 פרוטוקול ג'ל</td><td>סיגמא</td><td>A2220</td><td>מספר מדור-6.1.1 פרוטוקול</td></tr><tr><td>אנטי-FLAG M2</td><td>סיגמא</td><td>F3165</td><td>מספר מדור-5.7</td></tr><tr><td>אנטי קצף-אקסל אנטי קצף</td><td>סיגמא</td><td>59920C-1B</td><td>פרוטוקול מספר מדור-4.8</td></tr><tr><td>פרוטוקול ATP</td><td>סיגמא</td><td>A6419</td><td>מספר מדור-6.1.4.4</td></tr><tr><td>BEH 450 SEC</td><td>מים</td><td>186006851</td><td>2.5 ומיקרו; m x 4.6 מ"מ x 150 מ"מ פרוטוקול מספר מדור-7.3</td></tr><tr><td>כחול מקורי PAGE 5% G-250 תוסף לדוגמא</td><td>Invitrogen</td><td>BN2004</td><td>פרוטוקול מספר מדור-8.3</td></tr><tr><td>קרבניצילין</td><td>תרמו פישר</td><td>10177012</td><td>פרוטוקול מספר מדור-2.5</td></tr><tr><td>צנטריפוגה - Sorvall Lynx 6000</td><td>Thermo Fisher</td><td>75006590</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-6.1.3</td></tr><tr><td>מונה תאים - ViCELL</td><td>BECKMAN COULTER</td><td></td><td>מספר סעיף פרוטוקול-4.3</td></tr><tr><td>פרוטוקול CHAPS</td><td>Anatrace</td><td>C316S</td><td>מספר מקטע-6.1.4.6</td></tr><tr><td>תאי E. coli מוסמכים-TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-2.4</td></tr><tr><td>digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-5.1</td></tr><tr><td>גלאי מקדם שבירה דיפרנציאלי</td> מספר פרוטוקול <td>Wyatt-7.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDK פפטיד</td><td>Genscript</td><td></td><td>שירות סינתזה פפטיד פרוטוקול מספר מקטע-6.1.4.6</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-5.1</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Giga Kit</td><td>Qiagen</td><td>12391</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-3.3</td></tr><tr><td>מים ללא אנדוטוקסין</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.03</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-4.1</td></tr><tr><td>ערכת כימות אנדוטוקסין-CRL מערכת זיהוי Nexgen-PTS Endosafe Endosafe</td> פרוטוקול <td>PTS150K</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td>מספר מקטע-3.4</td></tr><tr><td>רוטור זווית קבועה A23-6x100 רוטור Thermo</td><td>Fisher</td><td></td><td>75003006 פרוטוקול מספר מקטע-6.1.3</td></tr><tr><td>תוכנת FPLC- Unicorn 6.2</td><td>Cytiva</td><td></td><td>פרוטוקול מספר מקטע-6.1.4</td></tr><tr><td>סינתזת גנים</td><td>Genscript</td><td></td><td>שירות סינתזת גנים פרוטוקול מספר מדור-1.2</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר סיינטיפיק גליצרול (מוסמך ACS)</td> <td>פרוטוקול G33-4</td><td>מספר מדור-5.6</td></tr><tr><td>מדיום גידול-Expi293 מדיום ביטוי</td><td>תרמו פישר</td><td>A1435102</td><td>פרוטוקול מספר מדור-4.2</td></tr><tr><td>תאי HEK293</td> פרוטוקול <td>תרמו פישר</td><td>R79007</td><td>מספר מדור -4</td></tr><tr><td>גזירה גבוהה הומוגנייזר-מיקרופלואידייזר</td><td>MicroFluidics</td><td>LM10</td><td>פרוטוקול מספר מדור-6.1.3</td></tr><tr><td>HPLC - 1260 infinity II Bio-Insert HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>פרוטוקול מספר מדור-7.1</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LiCor</td><td></td><td>תוכנת ניתוח תמונה פרוטוקול מספר מדור-5.1</td></tr><tr><td>MAB2166</td><td>Sigma</td><td>MAB2166</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-5.7</td></tr><tr><td>MAB2168</td><td></td> פרוטוקול EMD <td>MAB2168</td><td>מספר מקטע-5.7</td></tr><tr><td>MAB3E10</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-47757</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-5.7</td></tr><tr><td>MAB4E10</td><td>פרוטוקול סנטה קרוז</td><td>SC-7757</td><td>מספר מקטע-5.7</td></tr><tr><td>MAB5490</td><td>פרוטוקול סיגמא</td><td>MAB5490</td><td>מספר מקטע-5.7</td></tr><tr><td>MAB5492</td><td>סיגמא</td><td>MAB5492</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-5.7</td></tr><tr><td>MAB8A4</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-47759</td><td>פרוטוקול מספר מדור-5.7</td></tr><tr><td>גלאי פיזור אור רב זוויתי</td> פרוטוקול <td>Wyatt</td><td></td><td>מספר מדור-7.1</td></tr><tr><td>NativeMark חלבון לא מוכתם תקן</td><td>Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>פרוטוקול מספר מדור-8.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>פרוטוקול מספר מדור-5.6</td></tr><tr><td>NheI</td><td>ניו אינגלנד Biolab</td><td>R0131S</td><td>גרסת Hi-Fi זמינה פרוטוקול מספר מדור-2.2</td></tr><tr><td>NuPAGE 3&ndash; 8% ג'ל טריס אצטט</td><td>פרוטוקול Invitrogen</td><td>EA0375PK2</td><td>מספר מדור-5.4</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS מאגר ריצה</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-5.4</td></tr><tr><td>PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-4.1</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>תרמו פישר</td><td>15070063</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-4.2</td></tr><tr><td>פוספט תמיסת מלח חוצצת (PBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.02</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-4.5</td></tr><tr><td>ערכת מיני-הכנה לפלסמיד</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-2.6</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>ניו אינגלנד ביולאב</td><td>R0560S</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-2.2</td></tr><tr><td>ג'ל ביס-טריס טרומי - 3-12% NativePAGE Novex Bis-Tris Gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1003BOX</td><td>פרוטוקול מספר מדור-8.4</td></tr><tr><td>פרוטאז קוקטייל מעכב</td><td>GoldBio</td><td>GB-331-1</td><td>פרוטוקול מספר מדור-5.1</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח SEC-MALS - Astra 7</td><td>Wyatt Technology</td><td></td><td>Protocol מספר מדור-7.6</td></tr><tr><td>נוגדן משני -IRdye 800 CW עז נגד עכבר IgG</td><td>LiCor</td><td>926-32210</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-5.9</td></tr><tr><td>Superose 6 עמודים XK 16/70</td><td>Cytiva</td><td>90100042</td><td>פרוטוקול מספר מדור-6.2</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td>פרוטוקול מספר מקטע-5.6</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>AAJ20605AP פרוטוקול מספר מקטע-6.1.1</td></tr><tr><td>ספקטרומטר UV - Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-8000-GL</td><td>פרוטוקול מספר מדור-2.2</td></tr><tr><td>XK26/100</td><td>Cytiva</td><td>28988951</td><td>פרוטוקול מספר מדור-6.1.1</td></tr></tbody></table>

ייצור יעיל וניתן להרחבה של גרסאות ציד אנושיות באורך מלא בתאי יונקים באמצעות מערכת ביטוי חולפת

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

צידטין באורך מלא (FL HTT) הוא חלבון גדול (aa 1-3,144), המתבטא בכל מקום, המכיל פוליגלוטמין (polyQ) עם מסה של כ-350 kDa. בעוד שהתפקוד התאי של FL HTT אינו מובן לחלוטין, התפשטות מוטנטית של מערכת הפוליQ מעל ~36 חוזרת קשורה למחלת הנטינגטון (HD), כאשר אורך הפוליQ נמצא בקורלציה בערך עם גיל ההתפרצות. כדי להבין טוב יותר את השפעת המבנה על תפקוד המוטציה HTT (mHTT), נדרשות כמויות גדולות של החלבון. ייצור תת-מיליגרם של FL HTT בתאי יונקים הושג באמצעות ביטוי קו תאים יציבים הניתן להשראה של דוקסיציקלין. עם זאת, לייצור חלבונים מקווי תאים יציבים יש מגבלות שניתן להתגבר עליהן באמצעות שיטות טרנספקציה חולפות. 
מאמר זה מציג שיטה חזקה לייצור כמות נמוכה של מיליגרם של FL HTT וגרסאותיו מפלסמידים ממוטבים לקודון על ידי טרנספקציה חולפת באמצעות פוליאתילנימין (PEI). השיטה ניתנת להרחבה (>10 מ"ג) ומניבה באופן עקבי 1-2 מ"ג/ליטר של תרבית תאים של FL HTT מטוהר מאוד. בהתאם לדוחות קודמים, מצב הפתרון המטוהר של FL HTT נמצא כדינמי ביותר; לחלבון יש נטייה ליצור דימרים ואוליגומרים מסדר גבוה. מפתח להאטת היווצרות אוליגומרים הוא עבודה מהירה כדי לבודד את השברים המונומריים מהשברים הדימריים והאוליגומריים מסדר גבוה במהלך הכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. 
כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל עם פיזור אור רב-זוויתי (SEC-MALS) שימשה לניתוח הדימר והתוכן האוליגומרי מסדר גבוה יותר של HTT מטוהר. לא נצפתה קורלציה בין אורך הפוליQ של FL HTT (Q23, Q48 ו-Q73) לבין תכולת האוליגומרים. המבנה שנמחק מ-exon1 (aa 91-3,144) הראה נטייה דומה לאוליגומריזציה ל-FL HTT (aa 1-3,144). שיטות ייצור, טיהור ואפיון על ידי SEC/MALS-refractive index (RI), נתרן דודצילסולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE), כתם מערבי, דף מקורי ו- Blue Native PAGE מתוארים כאן.

אנו מספקים פרוטוקולים מדרגיים המכסים תכנון מבנה, טרנספקציה חולפת, וביטוי וטיהור של גרסאות של חלבון ציד אנושי באורך מלא בתאי HEK293.

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

הפרוטוקול פותח לייצור גרסאות ציד באורך מלא בקנה מידה של מיליגרם נמוך. הוא מאפשר חלבון עקבי באיכות גבוהה החיוני לחוקרי HD. מי שידגים את ההליך יהיה מייקל האריס, מדען מחקר ממעבדת קוריה.מתחילים על ידי הוספת גרם אחד של פוליאתילניימין 25 K לליטר אחד של מים נטולי אנדוטוקסין, ומערבבים היטב. התאם את ה- pH ל- 2.0 באמצעות חומצה הידרוכלורית של 100 מילימולר וערבב עד שכל הפוליאתילנימין מתמוסס. לאחר מכן התאם את ה- pH ל- 7.0 באמצעות תמיסת נתרן הידרוקסיד של 100 מילימולר והעביר את התמיסה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר.הפוך aliquots של הפתרון מסונן ולאחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. להפיץ תאי HEK293 במדיום הצמיחה בתוספת סטרפטומיצין פניצילין באינקובטור שייקר לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 90 סל"ד, 5% פחמן דו חמצני למשך 18 עד 24 שעות. יום אחד לפני ההעברה, מדללים את התאים בצפיפות של כ-1.2 x 10 לתאי הכוח השישיים למיליליטר בשני ליטרים של מדיום גדילה בבקבוק ארלנמאייר של חמישה ליטרים ודוגרים במשך 18 עד 24 שעות.בסוף הדגירה, מדוד את צפיפות התא ואת הכדאיות באמצעות מונה תאים אוטומטי בהתאם להוראות היצרן. לאחר חישוב כמות הפוליאתילנימין והפלסמיד הדרושים לטרנספקציה, לדלל פוליאתילנימין ופלסמיד בנפרד ב -100 מיליליטר של PBS ולדגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, מערבבים את הפלסמיד המדולל והפוליאתילנימין על ידי מערבולת עדינה ודוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.מוסיפים את התערובת לתרבית התאים ומערבבים על ידי מערבולת עדינה. עכשיו, לאפשר לתאים לגדול במשך 24 שעות. למחרת, מוסיפים תמיסת נתרן בוטיראט לריכוז סופי של סוכן אנטי-גושים ואנטי-מקציף של שני מילימולרים ביחס של 1:1, 000 נפח לתרבית ודוגרים על התאים באינקובטור השייקר הלח במשך 48 שעות.לאחר מדידת הכדאיות וצפיפות התא, קצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 2, 000 G במשך 30 דקות ולאחסן את גלולת התא במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני טיהור. לטיהור אנטי-FLAG באמצעות FPLC, יש לארוז 12 עד 25 מיליליטר של שרף אנטי-FLAG על עמודה ריקה בקצב זרימה של ארבעה מיליליטר לדקה באמצעות חיץ A ולהתאים את גובה הבוכנה כדי להסיר את המרווח בין קצה הבוכנה למצע השרף. לאחר מכן, להשעות את גלולת התא מופשר בחיץ ליזיס קר ולהעביר את תרחיף התא פעם אחת דרך הומוגנייזר גזירה גבוהה בלחץ של 1, 000 פאונד לאינץ 'מרובע.באמצעות צנטריפוגה המצוידת ברוטור תואם בעל זווית קבועה, להבהיר את הליזאט ב 20, 000 G למשך שעה אחת. תוכנית FPLC תחת חלון השיטה, לטעון את lysate הבהרה באמצעות משאבת הדגימה, ולשטוף את העמודה עם נפחי העמודה הרצויים של מאגר A, B, C, D ומאגר elution כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר סיום הריצה, נתח 10 מיקרוליטרים של שברי השיא באמצעות SDS-PAGE.שלב את שברי השיא עם הטוהר הרצוי ושמור כ-50 מיקרוליטרים של ה-eluates המשולבים לניתוח SDS-PAGE נוסף. התחל לאזן את עמודת ה- SEC באמצעות ה- FPLC וטען את ה- anti-FLAG eluate באמצעות superloop של 50 מיליליטר. לאחר הפעלת מאגר ה-SEC, אפשרו להפרדת ה-SEC להתרחש בן לילה בארבע מעלות צלזיוס.השווה את פרופיל האלוציה לפרופיל האלוציה הסטנדרטי של HTT כדי להבחין בין פסגות מונומר, דימר ואוליגומריים בעלי סדר גבוה יותר. מאגר את שברי ה- HTT המונומריים בהתבסס על פרופיל ה- elution של עמודת ה- SEC, ואם תרצה, אחסן בנפרד את שברי ה- HTT האוליגומריים והדימריים בעלי הסדר הגבוה יותר. רכז את חלבון ה-HTT המאוגד באמצעות רכז צנטריפוגלי במשקל 100 קילו-דלטון בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר חישוב ריכוז החלבון, aliquot פחות מ -100 מיקרוליטר של חלבון HTT מטוהר בצינור microcentrifuge בטוח קריו. הבזק להקפיא את aliquots באמצעות חנקן נוזלי ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. בצע את כל ה- SEC-MALS האנליטיים בארבע מעלות צלזיוס במערכת HPLC, יחד עם גלאי UV, גלאי פיזור אור רב-זוויתי, גלאי אינדקס שבירה דיפרנציאלי, והשתמש ב- 0.185 כתוספת מקדם השבירה עבור HTT.נקה את המשאבה ואת הגלאים במים מסוננים ברמת HPLC וחבר את עמודת UHPLC למערכת. שיווי משקל העמודה עם מים מסוננים ולאחר מכן חיץ SEC-MALS עד שכל אותות הגלאי מגיעים לנקודת ההתחלה. הזרקת שני מיקרוליטרים של תמיסת BSA בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר לדקה למשך 15 דקות להזרקה.בדוק את איכות הנתונים, בצע נורמליזציה, יישור שיא ותיקון הרחבת פס בהתבסס על פרופיל BSA, וצור תבנית עבור הרצות הדגימה הבאות של HTT. הפשיר במהירות בקבוקון של דגימת FL Q23-HTT באמבט מים בטמפרטורת החדר באמצעות מצוף. סנן את ה-HTT דרך מסנן ספין של 0.1 מיקרומטר.להזריק שניים עד ארבעה מיקרוליטרים של דגימת HTT ולרוץ במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר לדקה. נתח את הנתונים הכרומטוגרפיים ופיזור האור באמצעות התוכנה הנלווית וצור תרשים Zimm כדי לקבוע את המסה המולקולרית הממוצעת במשקל עבור כל פסגה. במחקר הנוכחי, באמצעות תהליך טור דו-שלבי, יותר מ-95% מהטוהר הושג עבור HTT והמזהם העיקרי היה מלווה Hsp70, אשר בוטל על ידי שטיפה נרחבת עם מגנזיום כלוריד ו-ATP במהלך שלב טיהור הזיקה נגד FLAG ביטוי יתר של FL HTT יכול לגרום לפיצול של החלבון, אך FL Q23-HTT המיוצר בשיטה נפתרה כפס יחיד עם המשקל המולקולרי הנכון של 350 קילו-דלטון מציין שאין פיצול.ניתוח כתמים מערביים לאחר תגובת נוגדנים עם FL Q23-HTT הראה כי החלבון בודד ללא חתכים משמעותיים הניתנים לזיהוי, מכיוון שלא נצפו רצועות נוספות הקשורות לשברים. שונות אורך הפולי-Q של FL HTT, Q23, Q48 ו-Q73 הגיבו כצפוי בכתם המערבי, והראו אות חזק יותר ויותר עבור נוגדן חד-שבטי מכוון פולי-Q MW1, בקורלציה עם הגדלת אורך Q. בין עמודות HPLC שנבדקו, עמודת ה- SEC הראתה רזולוציה מספקת בין מונומר HTT ודימר, כך שניתן היה להבחין במסות טוחנות.FL HTT מטוהר מ- SEC הראה פסים מרובים המתאימים למצבי האוליגומריזציה, אשר יכול להיות בגלל נוכחותם של מספר טלאים הידרופוביים אשר תורמים להיווצרותם של אוליגומרים בעלי סדר גבוה יותר במהלך הנדידה בתוך הג'ל. HTT מטוהר הראה שלושה פסים עיקריים על PAGE מקומי כחול עם משקל מולקולרי מוערך של 643, 927, ו 1, 070 קילודלטון המייצגים ככל הנראה את המינים המונומריים, הדימריים והטרימריים של HTT, בהתאמה. טיפול נכון בציד מטוהר חיוני כדי למנוע יצירת אוליגומרים מסדר גבוה באגרגטים מסיסים.זה הכרחי שמשתמש הקצה יעבוד במהירות כדי לחלק את הדגימה לצינורות מקוררים מראש לפני הקפאת ההבזק. ניתן לבצע בדיקות יציבות ארוכות טווח על דגימות המאוחסנות בתקופות ממושכות במינוס 80 מעלות צלזיוס. ניתוחים חוזרים של HPLC SEC-MALS יאשרו אם חל שינוי כלשהו בתוכן המונומרי של הדגימה.

efficient-scalable-production-full-length-human-huntingtin-variants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בעידן שאחרי האדם הגנומיקה, הזמינות של חלבונים רקומביננטיים של תצורות המקומיים הוא חיוני למחקר מבנית, תפקודית טיפולית ופיתוח. כאן אנו מתארים מבחן רחב היקף של ביטוי חלבונים מערכת עובריים אנושיים לתאי כליה 293T, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מגוון של חלבונים רקומביננטיים.

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

דרך מהירה ופשוטה ליצירת שורות תאים אנושיות עם מושרה וביטוי יתר הפיך cDNA או shRNA בתיווך עקום למטה של ​​הגן של עניין. שיטה זו מאפשרת לחוקרי שורות תאים ואמינים ביותר reproducibly מניפולציות שקשה לשנות בשיטות transfection חולפות או אסטרטגיות קונבנציונליות מציאה / נוקאאוט.

דור של שורות תאים אנושיות יציבות עם טטרציקלין-מושרה (ט ב) shRNA או ביטוי cDNA

ביטוי חלבונים רקומביננטיים על ידי מערכות יונקים הופך לשיטה אטרקטיבית לייצור קומפלקסים של חלבונים לביולוגיה מבנית. כאן אנו מציגים מערכת ביטוי פשוטה אך יעילה ביותר המשתמשת בתאי יונקים שגדלו בתרחיף לטיהור קומפלקסים של חלבונים למחקרים מבניים.

ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

אנו מתארים כאן מערכת ביטוי גרנזים חסכונית המשתמשת בתאי HEK293T המייצרת תפוקות גבוהות של פרוטאז טהור, מסוכרר לחלוטין ופעיל אנזימטית.

תשואה גבוהה ומערכת ביטוי עלות-יעילה של Granzymes האדם בתאי יונקים

זהו פרוטוקול מהיר וחסכוני לייצור חלבוני יונקים מופרשים ומסוכררים וטיהור חד-שלבי לאחר מכן עם תפוקות מספיקות של חלבון הומוגני לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומחקרים ביופיזיקליים אחרים.

ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

ייצור בקנה מידה מעבדתי של חלבונים אוקריוטיים עם שינוי מתאים לאחר התרגום מייצג מחסום משמעותי. להלן פרוטוקול חזק עם התבססות מהירה ותפנית לביטוי חלבון באמצעות מערכת ביטוי יונקים. מערכת זו תומכת בחומצות אמינו סלקטיביות, תיוג סלקטיבי של חלבונים ומודולטורים של מולקולות קטנות של הרכב הגליקן.

ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

תעלות יוני לימוד באמצעות מערכת להביע heterologously הפכו טכניקת ליבה במחקר ביו. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה יעילה זמן כדי להשיג ביטוי ערוץ יון תחת פיקוח הדוק על ידי ביצוע transfection חולף בשליטת האמרגן מושרה.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת ועמיד לייצור כמויות מיליגרם של מונומרים מקורי, ללא תג, הסיבים של exon1 של החלבון Huntingtin (Httex1) המבוסס על הפיוז'ן ארעית של צירוף קשורים אוביקוויטין קטן (סומו).

דור של Huntingtin Exon1 טבעית, לא מתויגות מונומר, הסיבים משתמש באסטרטגיה פיוז'ן סומו

לפלח epigenome DNA עריכה מייצג גישה טיפולית רב-עוצמה. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, טיהור, הריכוז של ה-all-in-one וקטורים lentiviral מסתירים את transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A עבור יישומים לעריכת epigenome בתא גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC)-נגזר נוירונים.

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

רקומביננטי BDNF המכיל רצף Avi (Bdnפאבאני) מופק בתאים HEK293 באופן חסכוני ומטוהר על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. לאחר מכן BDNFavi באופן ישיר מונו-biotinylated עם בירה אנזים בשפופרת. Bdn, ו מונו-biotinylbdni שמירה על הפעילות הביולוגית שלהם בהשוואה BDNF זמין מסחרית.

פרוטוקול משופר כדי לטהר ו מונו ישירות-Biotinylate BDNF בתוך צינור ללימודי סחר בתאי הסלולר בנוירונים

כאן מוצג פרוטוקול ייצור AAV מבוסס תאי HEK293 מתלה, וכתוצאה מכך זמן ועבודה מופחתים הדרושים לייצור וקטורי באמצעות רכיבים הזמינים למטרות מחקר מספקים מסחריים.

ייצור אצוות וקטוריות משויכות אדנו בעלות תפוקה גבוהה באמצעות תאי תרחיף HEK293

למד פרוטוקול יעיל לייצור גרסאות ציד אנושיות באורך מלא בתאי HEK293. השיטה מבטיחה טוהר של מעל 95% ומספקת חלבון איכותי גבוהה לחקר מחלת הנטינגטון.

ייצור יעיל וניתן להרחבה של גרסאות ציד אנושיות באורך מלא בתאי יונקים באמצעות מערכת ביטוי חולפת

גלה סרטונים נוספים