Name: סינתזה של מסארימיצין, מעכב מולקולה קטנה של צמיחת חיידקים גראם חיובית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: למד את פרוטוקול הסינתזה של מסארימיצין, מעכב אוטוליזין בחיידקים, לחקר פיזיולוגיה חיידקית וניסויים בסינרגיה עם Bacillus subtilis ו-Streptococcus pneumoniae.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת מענק מספר 2009522. ניתוח NMR של מסרימיצין נתמך על ידי פרס תוכנית מכשור המחקר הגדולה של הקרן הלאומית למדע תחת מענק מספר 1919644. כל הדעות, הממצאים והמסקנות, או ההמלצות המובעות בחומר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את דעותיה של הקרן הלאומית למדע.

לריד, C. W. יש קניין רוחני הכרוך ביישומים ספציפיים של masarimycin.

Masarimycin הוא מעכב בקטריוסטטי מיקרומולרי יחיד של B. subtilis35 ו S. דלקת ריאות37 צמיחה. ב - B. subtilis, מסארימיצין הוכח כמעכב את GlcNAcase LytG35, בעוד שהמטרה המולקולרית המדויקת בדופן התא של S. pneumoniae לא זוהתה37. סינתזה של masarimycin באמצעות סינתזה אורגנית קלאסית או הליך מיקרוגל מספק את המעכב בתפוקה טובה וטוהר גבוה. יבולים נמוכים של מסרימיצין ניתן לייחס בדרך כלל לחמצון של ציקלוהקסיל קרבוקסלדה...

פפטידוגליקן (PG) הוא פולימר דמוי רשת התוחם את צורת ומבנה התא הן בחיידק גראם חיובי והן בחיידק גראם-שלילי 1,2. הטרופולימר זה הוא מטריצה של סוכרים אמיניים המקושרים על ידי פפטידים קצרים 3,4,5,6 עם עמוד שדרה המורכב משאריות N-אצטילגלוקוסאמין (GlcNAc) ו-N-אצטילמוראמית (MurNAc) המקושרות β(1,4) הקשורות לסירוגין (איור 1)1. מחובר ל-C-3 לקטיל מואטי של MurNAc הוא פפטיד הגבעול. חילוף החומרים של PG כולל מערכת מתואמת היטב של אנזימים ביוסינטטיים ומשפילים כדי לשלב חומר חדש בדופן התא 7,8. השפלה של PG מתבצעת על ידי אנזימים המכונים באופן קולקטיבי אוטוליזינים9 ומסווגים עוד יותר על סמך הספציפיות של הקשר שנבקע. אוטוליסינים משתתפים בתהליכים תאיים רבים, כולל גדילת תאים, חלוקת תאים, תנועתיות, התבגרות PG, כימוטקסיס, הפרשת חלבונים, יכולת גנטית, התמיינות ופתוגניות10,11. חשיפת הפונקציות הביולוגיות הספציפיות של אוטוליזינים בודדים יכולה להיות מרתיעה, בין השאר בשל יתירות תפקודית. עם זאת, מחקרים ביופיזיים אחרונים 8,12,13 ומחקרים חישוביים12 סיפקו תובנות חדשות על תפקידם בחילוף החומרים של PG. בנוסף, הדו"חות האחרונים סיפקו תובנה נוספת לגבי סינתזה14 ו-15,16,17 שלבים בתיווך ממברנה בחילוף החומרים של PG. הבנה מעמיקה של הקשר בין מסלולים מתכלים וסינתטיים של חילוף החומרים של PG עשויה להוליד מטרות אנטיביוטיות שלא נוצלו בעבר.
אמנם חלה התקדמות משמעותית במתודולוגיה לחקר הגליקוביולוגיה באאוקריוטים, אבל הגליקוביולוגיה החיידקית, ובמיוחד, חילוף החומרים של PG לא התקדם בקצב דומה. הגישות הכימיות הנוכחיות לחקר חילוף החומרים של PG כוללות אנטיביוטיקה מסומנת פלואורסצנטית18, בדיקות פלואורסצנטיות19,20, ותיווג מטבולי 21,22,23,24. גישות חדשות אלה מספקות דרכים חדשות לחקור את חילוף החומרים של דופן תאי החיידקים. בעוד שחלק מהאסטרטגיות הללו מסוגלות לתייג PG in vivo, הן יכולות להיות ספציפיות למין19, או לעבוד רק בזנים שחסרים להם אוטוליזיןמסוים 25. אסטרטגיות תיוג PG רבות מיועדות לשימוש עם דפנות תא מבודדות26 או עם מסלולי ביוסינתזה של PG משוחזרים במבחנה 20,27,28. השימוש באנטיביוטיקה עם תווית פלואורסצנטית מוגבל כיום לצעדים ביו-סינטטיים ולטרנספטידציה18.
הידע הנוכחי על אוטוליזינים חיידקיים ותפקידם בחילוף החומרים של דופן התא מגיע מניתוח ביוכימי גנטי ובמבחנה 11,29,30,31,32. בעוד שגישות אלה סיפקו שפע של מידע על סוג חשוב זה של אנזימים, פענוח תפקידם הביולוגי יכול להיות מאתגר. לדוגמה, בשל יתירות תפקודית33, מחיקה של אוטוליזין ברוב המקרים אינה גורמת לעצירת צמיחת החיידקים. זאת למרות תפקידם המרומז בצמיחת התאיםובחלוקתם 7,12. סיבוך נוסף הוא שמחיקה גנטית של אוטוליזין חיידקי יכולה להוליד מטא-פנוטיפים34. מטא-פנוטיפים נובעים מיחסי הגומלין המורכבים בין המסלול המושפע מהמחיקה הגנטית לבין מסלולים מקושרים אחרים. לדוגמה, מטא-פנוטיפ יכול להיווצר באמצעות השפעה ישירה כגון היעדר אנזים, או השפעה עקיפה כגון הפרעה של הרגולטורים.
נכון לעכשיו, ישנם רק כמה מעכבים של גליקוזידאז אוטוליזינים כגון N-אצטילגלוקוסאמינידס (GlcNAcase) ו- N-acetylmuramidases, אשר יכולים לשמש כבדיקות כימיות כדי לחקור את הפירוק של PG. כדי להתמודד עם זה, הדימיד מסארימיצין (שנקרא בעבר fgkc) זוהה ואופיין35 כמעכב בקטריוסטטי של צמיחת Bacillus subtilis המכוון ל-GlcNAcase LytG32 (איור 1). LytG הוא GlcNAcase36 בעל משחק אקסו-אקטיבי, חבר באשכול 2 במשפחת ההידרולאזים הגליקוזיליים 73 (GH73). זהו ה-GlcNAcase הפעיל העיקרי במהלך צמיחה וגטטיבית32. למיטב ידיעתנו, מסארימיצין הוא המעכב הראשון של GlcNAcase הפועל על ידי PG ומעכב את צמיחת התאים. מחקרים נוספים על מסרימיצין עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס מצאו כי מסרימיצין ככל הנראה מעכב את חילוף החומרים של דופן התא באורגניזם זה37. כאן, ההכנה של masarimycin מדווח לשימוש כבדיקה ביולוגיה כימית כדי לחקור פיזיולוגיה באורגניזמים גראם חיוביים B. subtilis, ו S. pneumoniae. דוגמאות לניתוח מורפולוגי של טיפול בריכוז מעכב תת-מינימלי עם מסרימיצין, כמו גם בדיקת סינרגיה/אנטגוניזם מוצגות. מבחני סינרגיה ואנטגוניזם באמצעות אנטיביוטיקה עם דרכי פעולה מוגדרות היטב יכולים להיות דרך שימושית לחקור קשרים בין תהליכים תאיים 38,39,40.

<table><tbody><tr><td>2-חומצה יודובנזואית</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I7675-25G</td><td>אבקה קורוזיבית, מגרה, צהובה בהירה עד כתומה-חומה</td></tr><tr><td>2-פרופנול</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>109827-4L</td><td>נוזל דליק, מגרה, חסר צבע</td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>34851-4L</td><td>דליק, מגרה, נוזל חסר צבע</td></tr><tr><td>לוחות סיליקה מגובים אלומיניום</td><td>Sorbtech</td><td>4434126</td><td>סיליקה ג'ל XG F254 על צלחות מגובות אלומיניום</td></tr><tr><td>כלורופורם-d</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>151823-50G</td><td>ממס עבור NMR</td></tr><tr><td>ספקטרומטר מסה קומפקטי</td><td>Advion-Interchim</td><td>Advion CMS</td><td>ספקטרומטר מסה קומפקטי מצויד במקור APCI ובדיקת ניתוח מוצקים אטמוספריים</td></tr><tr><td>קורנינג קוסטאר 96 היטב צלחות תחתונות שטוחות-כימיקל פישר סטרילי</td><td></td><td>07-200-90</td><td>למבחני סינרגיה / אנטגוניזם</td></tr><tr><td>החלקות כיסוי</td><td>פישר כימיקל</td><td>12-547</td><td>למיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>Cyclohexanecarboxaldehyde</td><td>CHEM-IMPEX INT'L INC.</td><td>24451</td><td>נוזל דליק, מגרה, חסר צבע עד ורוד</td></tr><tr><td>Cyclohexyl isocyanide</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>133302-5G</td><td>מגרה, נוזל חסר צבע, ריח לא נעים במיוחד</td></tr><tr><td>Cyclohexylamine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>240648-100ML</td><td>נוזל מאכל, דליק, מגרה, חסר צבע אלא אם כן מזוהם</td></tr><tr><td>אתיל אצטט</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>537446-4L</td><td>דליק, מגרה, חסר צבע </td></tr><tr><td>מחסנית סיליקה פלאש נוזלי (12 גרם)</td> <td>Advion-Interchim</td><td>PF-50SIHP-F0012</td><td>חבילת עמודי סיליקה פלאש (12 גרם) לטיהור מסרימיצין</td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F8775-25ML</td><td>חומר קיבוע למיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H8651-25G</td><td>מאגר לתמיסת קיבוע מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>הקסאן, תערובת איזומרים</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>178918-4L</td><td>מזיק לסביבה, דליק, מגרה, סכנה בריאותית, נוזל חסר צבע</td></tr><tr><td>ספקטרומטר מסה קומפקטי בעל ביצועים גבוהים</td><td>ביטוי</td><td>Advion</td><td>בדיקת ניתוח מוצקים אטמוספריים (ASAP), ואקום אפנדורף ברזולוציה</td></tr><tr><td>נמוכה</td><td></td><td></td><td>בתוספת ואקום בסיוע כוח וטמפרטורה צנטריפוגלי</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>258148-2.5L</td><td>חומצה הידרוכלורית נוזלית מאכלת, מגרה, חסרת צבע</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>320331-2.5L</td> שמן טבילה <td>חומצה חזקה</td></tr><tr><td></td><td>פישר כימי</td><td>12-365-19</td><td>למיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>יוד, גבישים סובלימיים</td><td>אלפא Aesar</td><td>41955</td><td>מזיק לסביבה, מגרה, סכנה בריאותית, גבישים אפורים כהים/סגולים</td></tr><tr><td>Mestre</td><td>Mestre MestreLab Research</td><td></td><td>תוכנה לעיבוד ספקטרום NMR</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>439193-4L</td><td>דליק, רעיל, סכנה בריאותית,</td></tr><tr><td>נוזלי חסר צבע מתילן כחול SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>M9140-25G</td><td>מיקרוסקופיה כתם להכתמת דפנות תאים</td></tr><tr><td>צלחות אגר מולר-הינטון + 5% דם כבשים</td><td>פישר כימי</td><td>B21176X</td><td>מצע גידול לסטרפטוקוקוס פנאומוניה</td></tr><tr><td>מרק מולר-הינטון</td><td>פישר כימיקל</td><td>DF0757-17-6</td><td>אמצעי גידול עבור שקופיות מיקרוסקופ סטרפטוקוקוס פנאומוניה</td></tr><tr><td></td><td>פישר כימיקל</td><td>22-310397</td><td>למיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>מעבדת סינתזה במיקרוגל</td> מכשיר <td>MILESTONE</td><td>START SYNTH</td><td>הדורש אוורור של מכסה אדים, מצויד בצינורות NMR קרוסלה סינתזה</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z562769-5EA</td><td>5 מ"מ צינורות NMR 600 מגה-הרץ</td></tr><tr><td>תהודה מגנטית גרעינית (NMR)</td><td>Bruker</td><td>Ascend 400</td><td>מגנט מוליך-על גדול (400 מגה-הרץ)</td></tr> <tr><td>אופטוכין</td><td>פישר AAB21627MC כימי</td><td></td><td>אתילהידרוקופרין הידרוכלוריד</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>Celltreat</td><td>229695</td><td>להכנת לוחות אגר לגידול חיידקים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניגודיות שדה / פאזה פרימו סטאר בהיר עם מצלמת ERc5s</td><td>Zeiss</td><td></td><td>עבור מחקרי מורפולוגיה</td></tr><tr><td>puriFlash</td><td>interchim</td><td>XS520plus</td><td>מערכת טיהור כרומטוגרפיה פלאש</td></tr><tr><td>resazurin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>R7017-1G</td><td>לבדיקות סינרגיה/אנטגוניזם</td></tr><tr><td>מאייד סיבובי</td><td>Heidolph</td><td>Hei-VAP ערך "The Collegiate"</td> <td>מאייד ממס</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S6014-500G</td><td>מגרה, לבן אבקה</td></tr><tr><td>נתרן</td><td>כלורי פישר כימיקל</td><td>S271-1</td><td>גבישי, חסר צבע</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S5886-500G</td><td>לגידול B.subtilis והכנת מדיה LB</td></tr><tr><td>נתרן גופרתי</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7985592-500G</td> כימיקל טריפטון <td>פישר לבן נטול מים, גרגירי לבן,</td></tr><tr><td></td><td></td><td>BP1421-500</td><td>לגידול של B.subtilis ו הכנת מדיה LB</td></tr><tr><td>תחנת עבודה וויטני DG250 תחנת עבודה</td><td>מיקרוביולוגיה בינלאומית</td><td>DG250</td><td>תחנת עבודה אנאירובית. תערובת גז אנאירובית בשימוש: 5% מימן, 10% פחמן דו חמצני, תמצית שמרי חנקן מאוזנת</td></tr><tr><td></td><td>פישר כימיקל</td><td>BP1422-500</td><td>לגידול B.subtilis והכנת תוכנת LB</td></tr><tr><td>Zen Lite (כחול)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>לרכישת מיקרוגרפים</td></tr></tbody></table>

סינתזה של מסארימיצין, מעכב מולקולה קטנה של צמיחת חיידקים גראם חיובית

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

פפטידוגליקן (PG) בדופן התא של החיידקים הוא מבנה מקרומולקולרי ייחודי המקנה צורה, והגנה מפני הסביבה. מרכיב מרכזי בהבנת הצמיחה והחלוקה של התאים הוא הידע על האופן שבו פירוק PG משפיע על הביוסינתזה ועל הרכבת דופן התא. לאחרונה דווח על תיוג מטבולי של PG באמצעות הכנסת סוכרים מותאמים או חומצות אמינו. בעוד שחקירה כימית של צעדים ביו-סינטטיים עם מעכבי מולקולות קטנות אפשרית, כלים לביולוגיה כימית לחקר השפלת PG על ידי אוטוליזינים אינם מפותחים מספיק. אוטוליזינים חיידקיים הם סוג רחב של אנזימים המעורבים בפירוק מתואם היטב של PG. כאן מוצג פרוטוקול מפורט להכנת גשושית מולקולה קטנה, masarimycin, שהיא מעכבת של N-אצטיל-גלוקוסאמינידאז LytG ב-Bacillus subtilis, ומטבוליזם של דופן התא בסטרפטוקוקוס דלקת ריאות. הכנת המעכב באמצעות סינתזה אורגנית בסיוע מיקרוגל וקלאסית מסופקת. תחולתו ככלי לחקר פיזיולוגיה גראם-חיובית במבחנים ביולוגיים מוצגת.

Masarimycin הוא מעכב בקטריוסטטי של מולקולה קטנה של B. subtilis ו- S. pneumoniae והוכח כמעכב את GlcNAcase LytG הפועל כאקסו ב- B. subtilis35,37 ומכוון את דופן התא ב- S. pneumoniae37. ניתן להכין את Masarimycin ביעילות על ידי סינתזה אורגנית קלאסית או בסיוע מיקרוגל עם תשואות בטווח של 55%-70%. לסינתזה בסיוע מיקרוגל יש יתרון של הפחתה משמעותית בזמן לסינתזה של התרכובת. סינתזה בסיוע מיקרוגל מקצרת את הסינתזה מ-5-6 ...

מוצג פרוטוקול מפורט להכנת הבקטריוסטטי דיאמיד מסארימיצין, בדיקה של מולקולה קטנה המעכבת את צמיחתם של Bacillus subtilis ודלקת ריאות סטרפטוקוקוס על ידי התמקדות בהתדרדרות דופן התא. היישום שלה כבדיקה כימית מודגם במבחני סינרגיה/אנטגוניזם ובמחקרים מורפולוגיים עם B. subtilis ו-S. pneumoniae.

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

מסארימיצין הוא אחד המעכבים הבודדים של אוטוליזין חיידקי שעוצר את צמיחת תאי החיידקים. ניתן להשתמש בו כדי לחקור את ההבדלים בין אי-פעילות כימית וגנטית של אוטוליזינים, ומספק גישה אורתוגונלית לגנטיקה לחקר הפיזיולוגיה של החיידקים. סינתזה של מסרימיצין עשויה להיראות מרתיעה.עקוב מקרוב אחר השלבים המוצגים. כאשר יש ספק אם שלב תגובה עבד, אשר על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה ואת השינויים בערכי RF. כדי להתחיל, להכין תמיסה טוחנת 0.1 של ציקלוהקסילאמין, ציקלוהקסיל קרבוקסלדהיד, חומצה אורתו-יודובנזואית, וציקלוהקסיל איזוציאניד במתנול.לאחר מכן, הוסיפו מוט ערבוב מגנטי, ערבבו חמישה מיליליטרים של ציקלוהקסילאמין וחמישה מיליליטרים של ציקלוהקסיל קרבוקסלדהיד בבקבוקון עגול עם תחתית עגולה והניחו את הבקבוקון באמבט חול על מערבל כיריים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס. עקוב אחר הטמפרטורה באמצעות מדחום הממוקם כסנטימטר אחד מתחת לפני החול. לאחר 30 דקות, מוסיפים חמישה מיליליטרים של ציקלוהקסיל איזוציאניד לתמיסה ומערבבים במשך 20 דקות נוספות ב-50 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, מוסיפים חמישה מיליליטרים של חומצה אורתו-יודובנזואית לתערובת התגובה וממשיכים לערבב ב-55 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש שעות. לאחר שלוש שעות של ערבוב, עקוב אחר התקדמות התגובה מעת לעת על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה, או TLC, במרווחים של כשעה. שקול את התגובה הושלמה כאשר רק נקודה אחת עם גורם שמירה השווה ל- 0.3 נראית על לוח ה- TLC.הסר את הממס במאייד סיבובי בלחץ מופחת. לאחר שכל המתנול מתאדה, ממיסים את המוצר הגולמי המיובש ב-30 מיליליטרים של אתיל אצטט ומעבירים אותו למשפך מפריד. יש לחלץ אתיל אצטט ברצף עם חומצה הידרוכלורית טוחנת אחת, מים, תמיסת נתרן ביקרבונט רוויה, מים שוב ותמיסת נתרן כלורי רוויה, תוך השלכת השכבות הימיות בכל מיצוי.לאחר מכן, הסר את שכבת האתיל אצטט מהמשפך המפריד ואסוף אותה בבקבוקון ארלנמאייר. מוסיפים מרית מלאה בנתרן גופרתי נטול מים נטול מים כדי להסיר את שאריות המים מאתיל אצטט. סנן את תמיסת האתיל אצטט המיובשת דרך נייר סינון מספר אחת כדי להסיר את הנתרן גופרתי.לאחר מכן, לשטוף את נייר המסנן עם כמות קטנה של אתיל אצטט. תמיסת האתיל אצטט המסוננת התאיידה ליובש על מאייד סיבובי בלחץ מופחת כדי לקבל מסרימיצין כשמן לאחר הסרת כל האתיל אצטט. ממיסים את שמן המסרימיצין במילילטר אחד עד שני מיליליטרים של תמיסת הקסאן 9:1 לאיזופרופנול ומערבבים על צלחת ערבוב מגנטית עד שהתרכובת כולה מומסת.כדי לטהר את המסרימיצין המומס, בצע כרומטוגרפיית פלאש עם עמודת הבזק סיליקה של 12 גרם, בפאזה רגילה. שיווי משקל את עמודת הפלאש עם 10 נפחי עמודה של פאזה ניידת כאשר המכשירים מוגדרים בקצב זרימה של 15 מיליליטר לדקה. לאחר השלמת שיווי המשקל, ציירו את המסרימיצין המומס באמצעות מזרק של חמישה מיליליטר.חבר את המזרק ישירות לראש עמודת הפלאש המשוזנת והזריק את התמיסה לעמודה. חבר מחדש את העמודה הטעונה למערכת כרומטוגרפיית ההבזק והתחל את ההבראה המקדמית. Elute masarimycin מהעמודה באמצעות אלוטיון הדרגתי לריכוז פאזה נייד סופי של 10:90 הקסאן לאיזופרופנול על פני 12 נפחי עמודה.עקוב אחר התרוממות של מסארימיצין באמצעות ספיגה ב 230 ו 254 ננומטר. עבור מחקר המורפולוגיה, לגדל bacillus subtilis 11774 על לוחות אגר LB ב 37 מעלות צלזיוס. בכל הניסויים הבאים, השתמשו בתאי מעבר שני שגדלו בחמישה מיליליטרים של ציר LB עד שהצפיפות האופטית של 600 ננומטר תגיע ל-1.לאחר מכן, באמצעות פיפטה, מוסיפים מסארימיצין לצינורות התרבית המסומנים בריכוז סופי של 3.8 מיקרומולים. עבור צינורות תרבית המסומנים בשליטה, הוסף נפח שווה ערך של DMSO. מניחים את הדגימות באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות עם רעידות ב-150 סל"ד.לאחר 90 דקות, מקבעים כימית את התרביות בתערובת של 1:10 של מדיית תרביות ותיקון חיץ בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת, השתמשו בפיפטה כדי למרוח 10 עד 20 מיקרוליטרים של הדגימות הקבועות כימית על מגלשות מיקרוסקופ זכוכית ולאפשר להן להתייבש באוויר. לאחר מכן, תקן בחום את דגימות האוויר המיובשות על ידי חימום מגלשות הזכוכית באמצעות מבער Bunsen.לאחר תיקון חום, הכתימו את הדגימות ב-100 מיקרוליטרים של 0.1% מתילן כחול. לאחר דגירה של 10 דקות עם הכתם, שטפו את הצבע העודף במים מזוקקים. לאחר מכן, מחממים בעדינות את המגלשות המוכתמות ל-60 מעלות צלזיוס בתנור למשך 15 עד 20 דקות כדי להביא את התאים למישור מוקד משותף.אטמו את הדגימות המוכתמות על ידי הנחת כיסוי מיקרוסקופ החלקה על התאים המוכתמים. לאחר מכן, אטמו את הקצוות באמצעות מלט החלקה במיקרוסקופ. הניחו את שקופית המיקרוסקופ האטומה על במת המיקרוסקופ והביאו את התמונה לפוקוס בהגדלה של פי 100 באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.הניחו טיפה של שמן טבילה על שקופית המיקרוסקופ והביאו את שדה הראייה למיקוד באמצעות הגדלה של 1000X. רכשו מיקרוגרפים באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ ולתוכנה הנלווית אליו. השג תמונות באמצעות הגדרות האיזון הלבן האוטומטי ומפתח הצמצם של התוכנה.כרומטוגרפיית פלאש מאפשרת טיהור מהיר של מסארימיצין עם טוהר גבוה. הערכה של סינרגיה או אנטגוניזם עם מעכב ATPase אופטוצ'ין ב- S.pneumoniae מוצגת כאן. הריכוז הנמוך ביותר של התרכובת לעיכוב צמיחת חיידקים, המסומן על ידי הצבע הכחול, נחשב לערך הריכוז המעכב המינימלי בנוכחות תרופה משותפת.לעומת זאת, בארות עם צבע ורוד מצביעות על צמיחת חיידקים. מבחנים פנוטיפיים שהשתמשו במסארימיצין בריכוזים מעכבים מינימליים של פי 0.75 הדגימו פנוטיפ דמוי נקניק עבור B.subtilis ופנוטיפ מגושם עבור S.pneumoniae. שימו לב לטמפרטורה של התגובה.ודא שהתגובה הושלמה על ידי ניטור באמצעות TLC. ניתן להשתמש בשיטה זו בשילוב עם אנטיביוטיקה עם תווית פלואורסצנטית כדי לחקור שינויים בדופן התא על ידי מיקרוסקופיה.

synthesis-masarimycin-small-molecule-inhibitor-gram-positive

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

ביוסינתזה Heterologous של אריתרומיצין...

היגיון, שלבים ניסיוניים, והפוטנציאל של יוסינתזה מוצרים הטבעי Heterologous מציע אריתרומיצין האנטיביוטי הקומפלקס הופק באמצעות<em&gt; א coli</em

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט של (א) זיהוי של מוצר טבעי עם פעילות אנטיביוטית, (B) הטיהור של המתחם, (ג) את הדגם הראשון של ביוסינתזה שלה, (ד) הגנום רצף / -mining ואת ( E) אימות של אשכול גני biosynthetic.

ממוצר טבעי כדי המצרר שלו biosynthetic ג'ין: הפגנה שימוש Polyketomycin מ Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

פרוטוקול הכרייה ההמוני-מונחה הגנום מבוסס ומתואר כאן. הוא מבוסס על מידע רצף הגנום ו-LC-MS/MS ניתוח ומטרתו להקל על זיהוי של מולקולות מחיידקים מורכבים ותמציות צמחים.

המסה ספקטרומטר מודרמטריה מונחה הגנום ככלי לחשוף מוצרים טבעיים הרומן

כאן אנו מתארים בדיקה ביולוגית באמצעות 3-(4′,5′-דימתילתיאזול-2′-yl)-2,5- דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT) כדי לבחון אוקסימים ספירוציקליים שסונתזו בעבר.

סינתזה הטרוציקלית ספירוציקלית פונקציונלית ובדיקת ציטוטוקסיות

תרכובות Thiophenesulfonamide הן מעכבים חזקים וספציפיים של ויסתי חישת Vibrio quorum LuxR/HapR החוסמים את פעילותם in vivo, ובכך מונעים שעתוק גנים לאלימות, תנועתיות וביופילמים. פרוטוקול זה מפרט כיצד תרכובות אלה מסונתזות, מעוצבות בסיליקו, ונבדקות in vivo לפעילות נגד LuxR/HapR.

סינתזה ובדיקה של מעכבי חישת מניין Vibrio

שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי

מחקר זה פיתח בדיקה לסינון בתפוקה גבוהה נגד Mycobacterium abscessus עם זן כפול של כתב שנוצר לאחרונה, תוך שימוש בפלואורסצנטיות ולומינסנציה כדי להעריך את כדאיות החיידקים במהירות. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי לחוקרים השואפים לסנן תרופות חדשות נגד חיידק עמיד לתרופות.

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיית סקר פלואורומטרית המותאמת לזיהוי מעכבי מוצר טבעי/מולקולות קטנות של סינתזת חלבונים. הפרקטיות שלו הופכת אותה למתאימה הן להוראה לתואר ראשון בטכניקות גילוי תרופות והן ליישום בקמפיינים של כימיה רפואית.

פרוטוקול מבוסס פלואורסצנציה לסינון ראשוני של מעכבי סינתזת חלבונים ממקורות טבעיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור והערכת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית והציטוטוקסיות של הפפטיד הקטיוני Mel4 ושל הפפטיד המדמה RK758. על ידי שילוב סינתזה כימית, ביטוי רקומביננטי ובדיקות פונקציונליות סטנדרטיות, הוא מספק תהליך עבודה יעיל לייצור ובדיקה של פפטידים וחיקוי מולקולות קטנות.

ייצור ובדיקות של פפטידים אנטימיקרוביאליים והחיקויים שלהם

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מועמדים פוטנציאליים לתרופות נגד שחפת באמצעות סקר פנוטיפי, הכולל סינתזה כימית של תרכובת 4-אמינוקווינולין, קביעת ריכוז המעכב המינימלי שלה נגד מיקובקטריום טוברקולוזיס, והערכת הציטוטוקסיות שלה בקווי תאים יונקים.

זיהוי מועמדים פוטנציאליים לאנטי-שחפת: מדריך שלב אחר שלב לסינתזה, קביעת MIC והערכת ציטוטוקסיות בתאי יונקים

למד את פרוטוקול הסינתזה של מסארימיצין, מעכב אוטוליזין בחיידקים, לחקר פיזיולוגיה חיידקית וניסויים בסינרגיה עם Bacillus subtilis ו-Streptococcus pneumoniae.

סינתזה של מסארימיצין, מעכב מולקולה קטנה של צמיחת חיידקים גראם חיובית

גלה סרטונים נוספים