פלטפורמה גמישה לניטור למידה אסוציאטיבית חושית תלוית מוח הקטן
January 19th, 2022
פיתחנו פלטפורמה אחת למעקב אחר התנהגות בעלי חיים במהלך שתי משימות למידה אסוציאטיביות תלויות סיבים מטפסים. התכנון הזול מאפשר אינטגרציה עם ניסויים אופטוגנטיים או ניסויי הדמיה המכוונים לטיפוס על פעילות המוח הקטן הקשורה לסיבים תזונתיים.
פרדיגמות למידה אסוציאטיביות חושיות חשפו רבות על תפקוד המוח הקטן ועל הקשר שלו לשאר המוח, וההתנהגות שלו. באמצעות העכבר כאורגניזם מודל, אנו מציגים שיטה עם פירוט מספיק למעבדות ברחבי העולם כדי ליישם את השיטות החזקות הללו ביעילות ובזול. הפרוטוקול שלנו יאפשר לחוקרים להגדיר התנהגויות מרובות התלויות במוח הקטן.
ניתן לשנות בקלות את פונקציות הליבה של פלטפורמת המחקר שלנו כך שיתאימו לשאלת מחקר מסוימת. כדי להתחיל, חבר את כבל הממשק הטורי של המצלמה למצלמה, ואת יציאת המצלמה ב- SBC. לאחר מכן הורד את מערכת ההפעלה עבור SBC למחשב המארח, וצור קובץ בשם ssh בכרטיס microSD.
הוציאו את כרטיס ה-microSD מהמכונה המארחת. הכנס אותו לחריץ כרטיס microSD SBC, והפעל את ה- SBC. לאחר מכן, כדי להכין את ה- SBC לקבלת חיבור קווי למארח, פתח מסוף, הקלד את הפקודה ifconfig "ורשם את כתובת ה- IP של Ethernet של ה- SBC.
לאחר מכן עבור אל הכרטיסיה ממשק של הגדרת תצורת Raspberry Pi, והפעל את האפשרויות עבור מצלמה, SSH ו- VNC. ליצירת החיבור הקווי, חבר כבל Ethernet ליציאת Ethernet ב- SBC ובמחשב מארח, וחבר את הקצה השני של כבלים אלה למתג Ethernet. לאחר מכן, באמצעות לקוח מחשוב רשת וירטואלי, כגון VNC, גש לשולחן העבודה באמצעות כתובת ה- IP של SBC ואימות ברירת המחדל.
לאחר מכן, הורד את התוכנה הנדרשת ואת ספריות Python הדרושות ל- SBC. כדי לאפשר שליטה ישירה על המיקרו-בקר, הורד את סביבת הפיתוח המשולבת של המיקרו-בקר, או את תוכנת IDE. לאחר מכן פתח חלון מסוף SBC, נווט אל ספריית ההורדות והתקן את ה- IDE.
לאחר פתיחת המיקרו-בקר IDE, בחר כלים, ואחריו נהל ספריות, והתקין את ספריית המקודד של פול סטופרג'ן. לבסוף, הכנס כונן אגודל ליציאת USB ב- SBC, והזן את הפקודות להרכבת התקן האחסון החיצוני מסוג USB. לאחר חיבור ה- SBC ליציאת התכנות של המיקרו-בקר, פתח את סקיצת ההורדה עם המיקרו-בקר IDE, והעלה אותה למיקרו-בקר.
לאחר מכן, הורד והתקן את הגירסה המתאימה של Arduino IDE במחשב המארח. לאחר מכן הורד את DTSC_US. שרטוט ino למחשב המארח.
חבר את חוט ה-USB A ל-USB B למחשב המארח ולמיקרו-בקר. פתח את הסקיצה והעלה אותה למיקרו-בקר. חבר חוטים ללוח הלחם של המיקרו-בקר, נוריות LED, מקודד סיבובי, מנוע סטפר עם נהג ושסתום סולנואיד עם הנהג.
לאחר מכן חוט ערוץ אחד של ספק כוח לפיני ה- Positive-V וה- GND של נהג מנוע הסטפר. לאחר הפעלת ספק הכוח, הגדר את מתח הערוץ המחובר ל-25 וולט. לאחר מכן, תעביר את ההובלה החיובית של ספק כוח לפין המתח החזקה של שסתום הסולנואיד, והשנייה החיובית תוביל לפין מתח הספייק.
לאחר הפעלת ספק הכוח, הגדר את הערוץ המחובר למתח ספייק ל-12 וולט, ואת הערוץ המחובר למתח ההחזקה ל-2.5 וולט. לאחר מכן חברו מקור אוויר המווסת ללחץ של 20 פאונד לאינץ' מרובע לשסתום הסולנואיד. לאחר מכן, כדי להפוך את גלגל הריצה, חותכים גלגל של שלושה אינץ' מגלגלת קצף, וקודחים חור של רבע אינץ' במרכז הגלגל המדויק.
לאחר מכן הכנס פיר של רבע אינץ ' לתוך הגלגל, ותקן אותו במקומו באמצעות רכזות הידוק. הצמד את המקודד הסיבובי לתעלת אלומיניום בגודל 4.5 אינץ'. לאחר מכן לייצב את תעלת האלומיניום על לוח הלחם האלומיניום.
לאחר חיבור הגלגל למקודד הסיבובי, ייצבו את הצד החופשי של מוט הגלגלים עם מיסב שהוכנס למהדק קצה בזווית ישרה, המותקן על עמוד אופטי המותקן על לוח לחם. לאחר מכן, מקם את משענות הראש באמצעות עמודים אופטיים ומהדקי פוסט בזווית ישרה. לאחר מכן מקם את הגירוי המותנה LED ואת שקע שסתום הסולנואידים עבור הגירוי הבלתי מותנה של DEC סביב הגלגל המורכב.
לאחר מכן, הרכיב את מנוע הסטפר המשמש לגירוי ללא תנאי של DTSC ומצלמת Pi על עמוד אופטי. מקם את מערך האור האינפרא אדום באותו צד של מצלמת Pi, מעט מעל ופונה ישירות למקום שבו ימוקמו פני החיה. הכינו גירוי מישושי להריית מישוש מושהה על ידי הקשת קצף לקצה חתיכת אקריליק.
הרכיבו לפיר של רבע אינץ' באמצעות רכזת הידוק, ואז חברו את הגירוי המישושי לפיר המנוע של הסטפר. כדי להשתיל צלחת ראש, להרדים את העכבר, ולאחר מכן לבצע חתך עם אזמל לאורך קו האמצע של הקרקפת, מן הקצה האחורי של העיניים אל הגולגולת. פורסים את החתך פתוח, ומהדקים את שני הצדדים בהמוסטות כדי להחזיק אותה פתוחה.
באמצעות דבק ציאנואקרילט, חברו את לוחית הראש לגולגולת. לאחר מכן יש למרוח תערובת של אבקת מלט דנטלית, ממס וזרז לכל אזורי העצם החשופה. לתפור את העור סגור, מאחורי ומול צלחת הראש.
לאחר מכן להזריק משכך כאבים לאחר הניתוח, תוך מתן אפשרות לעכבר להתאושש במשך חמישה ימים לפחות. כדי להכין את העכברים למפגשי התנהגות, אפשרו להם להתרגל לפלטפורמה על ידי הרכבתם בריסון הראש. לפני הפגישה, יש לוודא כי שקע המסתם הסולנואידי מרוכז בעין המטרה, ממוקם במרחק של פחות מסנטימטר אחד משם, והגירוי המישושי מרוכז באפו של העכבר, הממוקם במרחק של כ-1.5 סנטימטרים משם.
להכנת סשן DTSC, התחל את ממשק המשתמש הגרפי ממסוף SBC. הפעל פגישת בדיקה של שלושה ניסויים, וודא שהנתונים הרשומים המודפסים במסוף מראים סטייה של יותר מ- 20, אך פחות מ- 100 שלבים. כדי להפעיל הפעלה, הרכיבו עכבר על משענת הראש והפעילו את ממשק המשתמש הגרפי ממסוף ה-SBC.
כדי לשמור הקלטות מצלמה, לחץ על לחצן זרם לפני תחילת ההפעלה. הזן מידע מזהה עבור החיה בשדה Animal ID, ולחץ על הלחצן הגדר. לאחר מכן הזן את הפרמטרים הרצויים של הניסוי, ולחץ על כפתור העלה לארדוינו".
לבסוף, לחץ על התחל הפעלה כדי להתחיל את ההפעלה. תוצאות אימון DEC מסשן הקלטה עם תאורה מקובלת מוצגות כאן. תנאי ההארה המקובלים הביאו לניגוד טוב בין העין לפרוות הפריוקולרית.
הביצועים של עכבר יחיד שאומן במשך שמונה מפגשים הראו עקבות התנהגותיים, ללא תגובה מותנית בעכבר הלא מאומן, ותגובות מותנות חזקות לאחר שהעכבר מאומן. סרטון ניסוי לדוגמה מראה עכבר מאומן עוצם את עינו בהצלחה בתגובה לגירוי מותנה LED, בעוד שהעכבר הלא מיומן אינו ממצמץ עד לגירוי הבלתי מותנה. התגובה המותנית גדלה בגודלה ובתדירותה באמצעות מפגשים התנהגותיים המבוצעים על פני ימים.
תנאי תאורה לא אופטימליים מגבילים מאוד את איכות הנתונים הנרכשים. כאשר הניגודיות בין העין לפרווה שמסביב נמוכה, שינויים קלים בתמונה יכולים לשנות באופן משמעותי את הצורה המוקלטת של התגובה הבלתי מותנית בהפעלה אחת, ולהפחית את יחס האות לרעש לאיתור מיקום העפעף. תוצאות אימון DTSC עבור עכבר שאומן במשך חמישה מפגשים מוצגות כאן.
סרטון ניסוי לדוגמה מראה עכבר מאומן מגבה בהצלחה את הגלגל בתגובה לגירוי מותנה ב-LED, בעוד שעכבר לא מיומן לא מצליח להזיז את הגלגל עד להפעלת הגירוי הבלתי מותנה המישושי. התדירות והמשרעת של התגובה המותנית גדלות ככל שהאימון מתקדם. בקבוצה של בעלי חיים שאומנו עם גירוי ללא תנאי שהפיק תגובות ללא תנאים באמפליטודה נמוכה, אף בעל חיים לא למד לייצר תגובות מותנות באופן עקבי לאחר ארבעה ימי אימון.
עבור התנהגות מוצלחת, הנוחות של החיה בזמן ריצה על האסדה היא קריטית. חשוב לוודא שהגלגל מסתובב בחופשיות ובאופן שווה לפני שהוא מרגיל בעלי חיים לאסדה. באמצעות פלטפורמה גמישה זו, הצלחנו לדמות ולהפריע לפעילות של נוירוני Purkinje, תאי הפלט של המוח הקטן, במהלך למידה בבעלי חיים קבועים בראש.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מציג פלטפורמה רב-תכליתית למעקב אחר התנהגות בעלי חיים במהלך משימות למידה אסוציאטיבית התלויות בסיבי טיפוס, תוך שימוש בעיצוב בעלות נמוכה המתאים לשילוב עם ניסויים אופטוגנטיים או הדמיה. המחקר מתמקד בפעילות cerebellar אצל עכברים, במטרה לשפר את ההבנה של התנהגות ותהליכי למידה הקשורים ל-cerebellum.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- מדעי העצבים
- התנהגות בעלי חיים
- תפקוד cerebellar
רקע
- מחקר זה מתבסס על פרדיגמות למידה אסוציאטיבית חושית כדי לחקור את תפקוד cerebellar.
- העכבר משמש כאורגניזם מודל לחקר אינטראקציות cerebellar עם התנהגות.
- הפלטפורמה המפותחת יכולה להקל על התנהגויות התלויות ב-cerebellum בחקירות מחקר שונות.
- העיצוב ניתן להתאמה באופן ניכר לצרכים ספציפיים של מחקר.
מטרת המחקר
- לספק שיטה מפורטת וחסכונית ליישום מעקב התנהגות cerebellar.
- לתמוך בחוקרים בביסוס משימות התלויות בסיבי טיפוס במודלים של בעלי חיים.
- לאפשר שינויים בפונקציות הליבה של הפלטפורמה בהתבסס על שאלות מחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפלטפורמה משלבת מחשב לוח יחיד (SBC) ומצלמה למעקב חזותי.
- משתמשים בעכברים כמודל ביולוגי ראשי לחקר פעילות cerebellar והתנהגות.
- לא הוזכרו זרימות עבודה של multiomics בתמליל.
- שלבים קריטיים כוללים הגדרת ה-SBC, התקנת תוכנה נחוצה וחיבור רכיבים שונים לניסויי התנהגות.
- מתוארים הכנות ספציפיות למשבצי התנהגות ומתודולוגיה לניטור משבצים.
תוצאות עיקריות
- הפלטפורמה מאפשרת מעקב ושילוב יעילים של התנהגות התלויה בסיבי טיפוס.
- שלבים מתודולוגיים ספציפיים מאפשרים לכידת נתונים אמינה במהלך משבצי התנהגות.
- מעודד הבנה של מנגנונים ותגובות cerebellar בהקשרים של למידה אסוציאטיבית.
- ניתנות להתאמה של הפלטפורמה מודגשת כיתרון משמעותי ליישומי מחקר מגוונים.
מסקנות
- מחקר זה מדגים גישה מעשית לחקר תפקודים cerebellar והתנהגויות למידה הקשורות באופן חסכוני.
- גמישות מציעה לחוקרים את הגמישות הדרושה כדי להתאים ניסויים לשאלותיהם הספציפיות.
- ממצאים תורמים להבנה מעמיקה יותר של מנגנונים נוירוניים הקשורים ללמידה והתנהגות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
A low-cost, adaptable behavioral platform enables scalable, high-throughput assessment of cerebellum-dependent sensory associative learning in head-fixed mice. By supporting parallel training of multiple animals and integration with optogenetic or imaging readouts, the system enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for CNS drug discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cerebellar circuit function in sensory associative learning paradigms to validate targets involved in motor learning and coordination.
- Operational Value: Supports standardized, reproducible behavioral readouts across multiple animals, reducing variability in early target hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., conditioned response amplitude, frequency) suitable for assay development and compound screening in cerebellar pathways.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through automated wheel tracking and camera-based behavior capture, enabling reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for probing cerebellar-dependent learning deficits, supporting translational biomarker alignment in motor coordination disorders.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation by allowing longitudinal tracking of learning progression across sessions.
Pipeline & Workflow Integration
The platform integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, supporting hypothesis testing and pathway clarification in cerebellar circuits.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating the contribution of climbing fiber inputs to Purkinje cells during associative learning.
- Screening: Delivers quantitative behavioral outputs (wheel deflection, eyelid closure) that enable comparison across experimental conditions and genetic or pharmacological manipulations.
- Analytics: Provides time-series data on conditioned response development, facilitating statistical analysis of learning curves and effect sizes.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by modeling cerebellum-dependent behaviors relevant to human motor learning and timing disorders.
- Enterprise Reuse: Designed for multi-animal training on a single host computer, promoting platform reuse across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cerebellar circuit function.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through low-cost, modular design and automated data logging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of target engagement in learning-related pathways, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS targets through reliable, high-throughput behavioral phenotyping.
Implementation Considerations
- Requires expertise in behavioral neuroscience, basic electronics, and software setup (SBC, micro-controller, Python/Arduino IDE).
- Depends on instrumentation including a single-board computer, camera, rotary encoder, stepper motor, solenoid valve, and optical posts for head fixation.
- Necessitates cross-team standardization of assembly procedures, calibration protocols (e.g., wheel deflection thresholds, lighting conditions), and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations across mouse strains, ages, and head-plate implantation techniques to ensure consistent behavioral performance.
- Includes practical limitations such as sensitivity to suboptimal lighting, which can degrade signal-to-noise ratio in eyelid tracking, and the need for habituation to reduce stress-induced variability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Setting Up the Single-Board Computer (SBC)
3:13
Wiring Stimulus Hardware and Assembling Stage
6:40
Preparing and Running the Behavior Experiments
8:48
Results: Delay Eyeblink Conditioning (DEC) and Delayed Tactile Startle Conditioning (DTSC) Trials
10:56
Conclusion
