תכנון ליישום מחקר לפיתוח ותיקוף מטופלים של אבחון מתגי Toehold מבוסס נייר

הפרוטוקול שלנו מתאר את התכנון, ההרכבה והאימות של אבחון מבוסס מעגל גנים. אבחון מולקולרי מבוסס נייר זה הוא בעלות נמוכה ורגישה, להיות מסוגל לזהות ריכוזים רלוונטיים מבחינה קלינית של חומצות גרעין והוא יכול להיות מתוכנן לזהות כמעט כל רצף. זוהי טכנולוגיית פלטפורמה שיכולה להיות מתוכננת על ידי משתמשים לצרכים שלהם ויש לה פוטנציאל להביא אבחון ברמה קלינית לתוך הגדרות משאבים דנטליים מבוזרות יותר.

ניתן לתכנן חיישן מתג טוהולד ללא תאים עבור כמעט כל מטרה המבוססת על חומצות גרעין. עבודות אחרונות הדגימו אבחון ללא תאים עבור אבולה, נורווירוס, SARS-CoV-2, C.difficile וחיידקים הגורמים לטייפואידים. מי שידגימו את ההליך יהיו סברינו ג'פרסון ריברו דה סילבה, פוסט-דוקטורנט, ופורייה ביאת, דוקטורנטית מהמעבדה שלי.

כדי לתכנן את מתג ה-toehold, זהה את רצפי המטרה מהגנום של נגיף זיקה ובחר את רצפי המטרה של וירוס זיקה מתוך האמפליקונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הורד את חבילת התוכנה לעיצוב מתג toehold. פתח את MATLAB ונווט אל תיקיית תוכנת העיצוב.

הזן את רצפי היעד לקובץ ה- csv של קובץ הקלט Design הממוקם בתיקיית המשנה של הקלט. בחר את הפרמטרים שישמשו עבור פונקציית העיצוב. הפעל את פונקציית העיצוב כדי ליצור את עיצובי מתגי toehold עבור יעדי העניין.

בסיום, נווט לתיקיית final_designs ואתר את רצפי העיצוב של מתג הטוהולד העליון ואת רצפי היעד המתאימים בגיליונות אלקטרוניים בפורמט csv. ודא שרצפי הדנ"א של מתג הטוהולד הנוצרים על ידי האלגוריתם מכילים את רצפי מקדם T7 בקצה חמשת הראשוניים ורצף מקשר נוקלאוטידים שמור בשלושת הקצוות הראשוניים. השתמש ב-NCBI BLAST כדי לסנן את רצפי העיצוב של מתגי ה-toehold העליונים כנגד וירוסים נפוצים אחרים על-ידי בדיקת הומולוגיה של רצפים.

קבל רצפים עם פחות מ- 40% hemology. הכינו תמיסות של אוליגוס דנ"א סיכות ראש של מתג הטוהולד ופריימרים להגברה הפוכה בריכוז של 10 מיקרומולר במים נטולי נוקלאזה. להרכיב תגובות בצינורות PCR על קרח על פי טבלה זו.

מקמו את צינורות התגובה בתרמו-ציקלר, בהתאם לתנאי המחזור המפורטים בטבלה זו. לנתח את מוצרי PCR על ג'ל agarose. טהרו את תוצרי ה-PCR ועמקו את הדנ"א בנפח מינימלי של מים נטולי נוקלאז כדי להבטיח ריכוז גבוה מספיק.

לכמת את הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר. הכינו תמיסת מלאי החייאה על ידי המסת 25 מיליגרם של האבקה במיליליטר אחד של מים נטולי נוקלאזות. הכינו תערובת מאסטר על קרח בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי המוצג כאן.

יש לפזר את תערובת המאסטר נטולת התאים לתוך צינורות PCR. לבקרות ללא תאים ולבקרות מתג בלבד, הוסיפו מים נטולי נוקלאז לנפח של 5.94 מיקרוליטרים. ולתגובה, הוסיפו דנ"א של מתג טוהר PCR כדי לקבל ריכוז סופי של 33 ננו-מולר.

כדי לבחון את מתג ה-toehold ואת שילוב ה-RNA של המטרה, הוסיפו RNA מטרה מתועתק במבחנה לריכוז סופי של מיקרו-מולר אחד. ערבבו את כל התגובות ביסודיות על ידי פיפטינג וצנטריפוגה לזמן קצר. על צלחת שחורה עם תחתית שקופה של 384 בארות, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז לבארות המקיפות את בארות התגובה.

לאחר מכן באמצעות ניקוב ביופסיה של שני מילימטרים ופינצטה, חותכים דיסקי נייר סינון חסומים של BSA ומניחים אותם בבארות התגובה. יש לפזר 1.8 מיקרוליטרים מכל שפופרת תגובה על דיסקיות נייר הסינון בלוח 384 הבאר במשולש. כסו את הצלחת בסרט PCR שקוף והניחו אותה בקורא צלחות.

מדוד את הספיגה ב 570 ננומטר ב 37 מעלות צלזיוס כל דקה במשך 130 דקות. הכינו תמיסת מלאי של 25 מיקרומולרים של כל ערכות הפריימרים הקדמיים והאחוריים במים נטולי נוקלאזות. הגדר תגובת חמישה מיקרוליטרים באמצעות תערובת האב המוצגת כאן.

מערבבים על ידי פיפטינג עד שהנוזל הלבן מתקלקל ואז מוציאים לצינורות PCR. הוסיפו את הפריימרים קדימה ואחורה לצינורות המתאימים, ולאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של מים נטולי נוקלאז או שני פיקומולרים של RNA טריגר מטרה. מערבבים על ידי צנרת עדינה ומסובבים לזמן קצר את הצינורות.

הגדר את פרוטוקול הדגירה על תרמוציקלר כפי שמוצג כאן. לאחר 12 דקות, הסר את הצינורות והוסף 1.25 מיקרוליטר של תערובת האנזימים לכל צינור, ולאחר מכן ערבוב וצנטריפוגה. החזירו את הצינורות לתרמוציקלר לאחר דילוג על שלב ההחזקה של 41 מעלות צלזיוס כדי להתחיל את הדגירה של שעה אחת.

לאחר מכן, כדי להעריך את ביצועי הפריימר, הרכיבו את תגובות מתגי ה-toehold נטולות התאים המבוססות על נייר ונתחו את הנתונים. לניתוח רגישות, זהה זוגות פריימרים מועמדים והכן דילולים סדרתיים של רנ"א מטרה במים נטולי נוקלאזה. חזרו על ה-NASBA והתגובות נטולות התאים עם ערכות הפריימרים שנבחרו במשולשים ביולוגיים.

באמצעות מיקרוליטר אחד של רנ"א חולה שחולץ, בצע את ההגברה של NASBA ותגובות מבוססות נייר ללא תאים כפי שמוצג בסעיף 5. לאחר התגובות, הכינו את לוחית התגובה בעלת 384 הבארות והפעילו את הבדיקה בקורא צלחות נייד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הרכיבו את רכיבי RT-qPCR והוסיפו את הריאגנטים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר בהתאם לטבלה זו.

מערבבים את התגובה על ידי פיפטינג. יש לחלק 6.5 מיקרוליטרים לכל באר של צלחת PCR של 96 בארות או 384 בארות, ולאחר מכן 3.5 מיקרוליטרים של כל תבנית RNA במשולש. הניחו סרט PCR מעל החלק העליון של הצלחת.

צנטריפוגה צלחת 384-באר ב 600 פעמים G במשך שתי דקות. הניחו את הצלחת במכונת RT-qPCR והפעילו את תנאי המחזור כפי שמוצג כאן. בעקבות התכנון החישובי, שלושה מתגי טוהולד נבנו ונותחו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.

להקה סביב 3, 000 זוגות בסיסים הצביעה על תגובה מוצלחת. מתגי ה-toehold הוערכו כנגד ה-RNA המופעל במבחנה בהתאמה. בעוד שכל שלושת החיישנים הציגו עלייה בספיגה, לחיישן 27B היה קצב ההדלקה המהיר ביותר, ואילו למתגים 33B ו-47B היה יחס הפעלה/כיבוי נמוך יותר המעיד על פעילות רקע וספציפיות מופחתת.

שינוי הקיפול של הספיגה ב-570 ננומטר הראה שלמתג 27B יש את הביצועים הטובים ביותר עם יחס אות הפעלה/כיבוי. יתר על כן, בשילוב עם NASBA, הוא יכול לזהות RNA בריכוזים נמוכים כמו 124 מולקולות למיקרוליטר המצביע על רגישות גבוהה. דגימות של חולי נגיף זיקה מברזיל נבדקו כדי להעריך את דיוק האבחון הקליני של החיישנים באמצעות קורא צלחות נייד.

שינוי צבע מצהוב לסגול זיהה דגימה חיובית. התגובה הצבעונית עבור כל תגובה מבוססת נייר התוותה לאורך זמן על ידי התוכנה המשולבת בקורא הצלחות הנייד PLUM. הדגימות שעברו את הסף נחשבו חיוביות.

הביצועים הקליניים של החיישן נקבעו בהשוואה ל- RT-qPCR. הדגימות נחשבו חיוביות כאשר ערך סף המחזור היה שווה או קטן מ-38. חשוב לוודא שהתוצאות ממסכי מתגי ה-toehold ורגישות הפריימר של NASBA ניתנות לשחזור וממוטבות לפני שמתקדמים בניסויים בחולים.

בהתחשב בפשטותה וביכולת ההסתגלות שלה, פלטפורמת האבחון המתוארת כאן סללה את הדרך לפיתוח כלי טיפול נקודתיים חדשים שיכולים להביא תועלת למערכת הבריאות, במיוחד עבור מדינות בעלות הכנסה נמוכה.