Name: מבחני ACT1-CUP1 קובעים את הרגישויות הספציפיות למצע של מוטנטים שחבורים בשמרים ניצנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: למדו את שיטת מבחן ACT1-CUP1 לזיהוי מוטציות המשפיעות על שחבור pre-mRNA בשמרים ניצנים. מבחן זה מספק קריאת פנוטיפ צמיחה פשוטה ורגישות גבוהה לחקר מנגנוני שחבור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה לאהרון הוסקינס ולחברי מעבדת הוסקינס באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון על השימוש בזני שמרים ובציוד בדור של איורים 3-5. תודה להרפרט קאור ושינגיאנג פו על הערותיהם התובנות על כתב היד. תודה לסטודנטים, לסגל ולסגל התומכים באוניברסיטת נורת'ווסט במהלך הכתיבה, העריכה והצילומים של מאמר זה. תודה לאיזבל מרסיגן על העזרה בצילום שיטה זו.

1. בניית זן שמרים
<ol><li>צור או קבל זן S. cerevisiae שהרקע שלו כולל leu2 ו - cup1Δ. כדי ליצור את הרקע הזה, השתמש בשיטת השמרים המבוססת היטב המשתמשת בליתיום אצטט ובדנ"אחד-גדילי 39. הערה: זני שמרים הפלואידים עשויים להכיל עותק אחד, שניים או יותר של CUP1 6,38. עיין במידע גנומי עבור זן השמרים שנבחר בעת תכנון פריימרים נוק-אאוט כדי לאגף את מיקומי הגנים CUP1.</li>
	<li>בצע טרנספורמציה של שמרים כדי לשלב את ה- QSP באמצעות שילוב גנומי או על פלסמיד. השתמש בפרוטוקול מבוסס היטב כמו אלה שתוארו במחקרים קודמים40,41,42.</li>
	<li>בצע טרנספורמציה של שמרים עם הזנים המתקבלים משלב 1.2. כדי להוסיף את פלסמיד הכתב הרצוי של ACT1-CUP1. הערה: יש לשמור על התאים על צלחות ומדיה של נשירת לאוצין (-Leu) כדי להבטיח שימור של פלסמידים מדווחים ACT1-CUP1 לאחר שינוי זה.</li>
	<li>בצע את שלבים 1.2. ו-1.3. עבור כל QSP וכל כתב ACT1-CUP1 פלסמיד להיבדק, כולל זני בקרה.</li>
</ol>2. הכנת צלחת נחושת
<ol><li>בחר טווח ריכוז נחושת המתאים לכתבים לבדיקה (ראה טבלה 1 לקטלניות של כתבים הנמצאים בשימוש תכוף). הערה: דוגמה לטווח ריכוזי נחושת מקיף היא 30 ריכוזי נחושת שונים של 0 mM, 0.025 mM, 0.05 mM, 0.075 mM, 0.1 mM, 0.15 mM, 0.2 mM, 0.25 mM, 0.3 mM, 0.35 mM, 0.4 mM, 0.45 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 מ"מ, 1.5 מ"מ, 1.6 מ"מ, 1.7 מ"מ, 1.8 מ"מ, 1.9 מ"מ, 2.0 מ"מ, 2.25 מ"מ ו-2.5 מ"מ Cu2+.</li>
	<li>צור תמיסת מלאי של 1 M CuSO4 ומסנן סטרילי באמצעות מסנן סטרילי PES (polyethersulfone) בגודל 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>לפי צלחת הנחושת הרצויה, הכינו דילול של 2 מ"ל של מלאי CuSO4 במים סטריליים. הערה: מכיוון שהצלחת עם 0 mM Cu 2+ תמיד תנותח ותוצג כהפניה, מומלץ ליצור שתי צלחות 0 mM Cu2+, אחת בהתחלה ואחת בסוף שלב הציפוי (שלב 3.4.).<ol><li>חישוב כמות המלאי עבור ריכוז הנחושת הרצוי הסופי ב-40 מ"ל מנפח הצלחת (טבלה משלימה 1).</li>
		<li>הוסף את הכמות המחושבת של מים סטריליים ומלאי 1 M CuSO4 לצינור סטרילי, 2 מ"ל.</li>
	</ol></li>
	<li>יוצקים צלחות לבדיקת ACT1-CUP1. הערה: חלופה לפרוטוקול שלהלן היא לשלב בתחילה את המדיה והאגר במיכל גדול ועליקוט לאחר אוטוקלאבינג למכלים קטנים יותר כדי להשיג ריכוזי נחושת שונים עבור כל צלחת. לא משנה באיזו שיטה ננקטת, חשוב לוודא שריכוז המדיה עקבי בין כל הלוחות למרות שלכל אחד מהם יש ריכוז נחושת שונה.<ol><li>סמן כל צלחת ריקה שיש למזוג עם ריכוז הנחושת הסופי שהיא תכיל. הכינו לפחות צלחת מרובעת אחת לכל ריכוז נחושת לבדיקה.</li>
		<li>תייג בקבוק של 100 מ"ל לכל ריכוז נחושת לבדיקה.</li>
		<li>לכל בקבוק, יש להוסיף 790 מ"ג אגר (2% עם אגר) וחטיף מוקפץ.</li>
		<li>בכוס גדולה, שלב את מצע הצמיחה -Leu כדי שכל לוחות הנחושת יישפכו. בכל צלחת שיש להכין, יש להמיס 265 מ"ג של בסיס חנקן שמרים (YNB) ו-64 מ"ג של תערובת נשירה פחות לאוצין (וכל חומר מזין אחר שעשוי להידרש כדי לשמור על פלסמיד QSP בתאים) ב-34 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה.</li>
		<li>הוסיפו 34 מ"ל של תמיסת מדיית הגידול -Leu לכל בקבוק ופקק מוכן של 100 מ"ל עם רדיד אלומיניום. סמן את נייר הכסף בריכוז הנחושת המיועד.</li>
		<li>אוטוקלאב כדי לעקר ולהמיס את האגר באמצעות מחזור הנוזל המומלץ עבור האוטוקלב.</li>
		<li>בהקדם האפשרי, יש להוסיף 4 מ"ל של 20% גלוקוז (מסונן סטרילי) לכל בקבוק.</li>
		<li>התאימו את התוויות והוסיפו את הדילולים של 2 מ"ל של CuSO4 לבקבוק המיועד. הערה: מכיוון שניתן לייצר עשרות לוחות נחושת בו זמנית, כל אחד עם ריכוז שונה, סימון כל הבקבוקים, הצינורות והצלחות בבירור עם ריכוז הנחושת המיועד ימנע בלבול במהלך מזיגת הצלחת.</li>
		<li>השתמש בצלחת ערבוב כדי לערבב במשך ~ 30 שניות ולשפוך או פיפט 35 מ"ל לתוך הצלחת המסומנת, הימנעות בועות. יש להניח להתקרר לפני אחסון או שימוש. הערה: לעתים קרובות, הצלחות מיוצרות יום אחד או יומיים לפני הבדיקה ומאוחסנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד מספר שעות לפני השימוש. הצלחות צריכות להיות בטמפרטורת החדר (RT) לפני תחילת הציפוי (שלב 3.4).</li>
	</ol></li>
</ol>3. בדיקת ACT1-CUP1
<ol><li>פזרו את הזנים הרצויים על צלחות -Leu. הערה: אם אתם עובדים ממלאי קריו, יש להקפיד על כך שהתאים יקומו לתחייה מספקת מהאחסון לפני הציפוי. הליך מומלץ לכך הוא לפסוע מהמלאי הקריוגני ולאפשר לו לגדול במשך 3-5 ימים ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, פזרו דוגמית קטנה ואפשרו לה לגדול עוד 2-3 ימים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לגדל תרבויות בן לילה ב 10 מ"ל של מדיה.<ol><li>הכן את מדיית הצמיחה של Leu באמצעות אותם יחסים כמתואר בשלב 2.4.2. לכל 10 מ"ל של מדיה, יש להוסיף 66 מ"ג של בסיס חנקן שמרים (YNB) ו-16 מ"ג של תערובת נשירה פחות לאוצין ל-9 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה. יש לעבור דרך מסנן סטרילי PES בגודל 0.22 מיקרומטר.</li>
		<li>לכל זן שמרים, יש להוסיף 9 מ"ל של מדיית צמיחה -Leu ו-1 מ"ל של 20% w/v גלוקוז (מסונן סטרילי) לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.</li>
		<li>בעזרת מקל סטרילי או קצה פיפט, אספו דוגמית קטנה (~1 מ"מ עגולה) של שמרים וחסנו את המדיה.</li>
		<li>נערו את כל תרביות הלילה ב-180 סל"ד וב-30 מעלות צלזיוס. הערה: אם זמין, ניתן להשתמש בסיבובים במקום בשייקר.</li>
	</ol></li>
	<li>דלל את הזנים ל-OD600 0.5 ± 0.05 ב-10% גליצרול.<ol><li>לכל זן, יש להוסיף 100 μL של תרבית לקובטה המכילה 900 μL מים.</li>
		<li>מדוד את OD600 באמצעות ספקטרופוטומטר.</li>
		<li>חשב את הדילול הנדרש כדי להיות ב- OD600 של 0.5 בנפח סופי של 2 מ"ל.</li>
		<li>יש לדלל כל זן ל-OD600 0.5 ב-10% גליצרול (סטרילי).</li>
		<li>מדוד מחדש את OD600 כדי לוודא שצפיפות התאים נמצאת בטווח הרצוי של 0.5 ± 0.05.</li>
	</ol></li>
	<li>צלחת את הזנים על לוחות הנחושת. הערה: ניתן להשתמש במגוון שיטות כדי לצלוח את הזנים, כולל פיפטר ידני בנפחים של 5-10 μL, שימוש בפיפטטור חוזר או רב-ערוצי, או הטבעה עם משכפל פינים. שיטה אחרונה זו מתוארת להלן, אם כי רוב השלבים יהיו דומים ללא קשר לשיטה.<ol><li>הגדר מיקום עבודה סטרילי ומבער בונזן מואר.</li>
		<li>עבור משכפל 48 פינים, פיפט 200 μL של כל זן מדולל לתוך באר נפרדת של צלחת 96 באר. מלא את החללים הריקים ברשת 6 x 8 עם 200 μL של 10% גליצרול (סטרילי). הערה: דוגמה לסכמת ציפוי עבור תשעה זני שמרים נמצאת בטבלה משלימה 2.</li>
		<li>טובלים את המשכפל בצלחת רדודה של 95% (v/v) אתנול ולהבה כדי לעקר. תן לו להתקרר לפחות 2 דקות לאחר הלהבה כבה, כדי למנוע חום מזעזע את התאים.</li>
		<li>מניחים ארבע צלחות ליד המבער ומסירים את המכסים.</li>
		<li>טבלו את המשכפל בצלחת 96 הבארות והרימו אותו בתנועה מהירה אחת.</li>
		<li>מניחים בעדינות על הצלחת ומתנדנדים קלות קדימה ואחורה כדי להקל על העברה טובה.</li>
		<li>הרם בתנועה מהירה אחת והניח באותו כיוון בדיוק בלוח 96 הבאר.</li>
		<li>חזרו על הפעולה לקבלת עד שלוש צלחות נוספות. חזור על התהליך של טבילת המשכפל באתנול, בוער כדי לעקר, ומחכה להתקרר כל ארבע צלחות.</li>
		<li>לאחר שצלחת, נעים בתנועה חלקה לצד אך עדיין בתוך מטריית העיקור של הלהבה. הערה: מומלץ לבצע את דילול השמרים וציפוי ליד להבה. הצלחות יכולות בקלות להזדהם בזמן הייבוש.</li>
		<li>תנו לצלחות להתייבש לחלוטין לפני שאתם מניחים את המכסים, בדרך כלל 3-5 דקות.</li>
		<li>לדגור את הצלחות במשך 3 ימים ב 30 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
</ol>4. איסוף וניתוח נתונים
<ol><li>הסר את הלוחות מהאינקובטור ובדוק אותם חזותית.</li>
	<li>הקלט את התמונות של הלוחות באמצעות מצלמה זמינה או מערכת הדמיה דיגיטלית אחרת.</li>
	<li>שיא (או ניקוד) עבור כל זן את ריכוז הנחושת האחרון נראה לעין צמיחה. הערה: התאים מסוגלים לחבור ולהישאר בני קיימא עד לריכוז זה. לקבלת עקביות, השתמש תמיד באותה שיטה, בעין או מתמונות הצלחת, כדי להשיג את ריכוז הנחושת הישים האחרון. מושבות קטנות מאוד נראות לפעמים בעין אך לא בתמונה. ההבדל בין בדיקה חזותית ישירה או הקלטה מתמונות הוא קטן, בדרך כלל שלב בשיפוע. מכיוון שתמונות של המושבות משמשות לעתים קרובות בפרסומים, מומלץ להבקיע לפי התמונות.</li>
	<li>שלב נתונים ממבחני ACT1-CUP1 מרובים עבור אותו זן כדי להסיק מסקנות לגבי האופן שבו ה-QSP משפיע על השחבור. הערה: נתוני הפרסום נוהגים להציג תמונות של מושבות השמרים בריכוז 0 mM Cu2+ , ריכוז הנחושת האחרון בר קיימא, והריכוז שלאחר מכן שבו המושבה מתה. ניתן להציג נתונים גם כגרף עמודות עם קווי שגיאה עבור סטיית התקן בין עותקים משוכפלים. אין צורך לנרמל את הנתונים, אך ניתן לעשות זאת על ידי הגדרת הכדאיות של בקרת גורם השחבור WT ל-1 והשוואת ההשפעה של המוטציות(ות) שהוכנסו.</li>
</ol>

למחבר אין מה לחשוף.

ACT1-CUP1 הוא מבחן גדילה, ויש לנקוט בזהירות כדי להבטיח שניתן לייחס הבדלי גדילה שנצפו רק לפגמים בשחבור. יש לטפל בכל הזנים באופן דומה לפני הציפוי, כולל אורך וסוג דומים של תנאי גידול ואחסון. אם משתמשים בזנים רגישים לטמפרטורה, יש לבצע בדיקות ACT1-CUP1 רק בתנאים שבהם זנים אלה גדלים באופן דומה לסוג בר. באופן דומה, עבור רכיב QSP, מומלץ שיהיו רקעים זהים של שמרים ורמות ביטוי זהות של גנים QSP כדי לא להעיב על הפרשנות של התוצאות. כאשר בוחנים את מספר ה- QSPs והכתבים לשימוש, לא מומלץ לבדוק יותר מ -30 זנים בכל פעם בשיטת משכפל הפינים. ע...

השחבור הוא מכונה ביולוגית גדולה המזרזת הסרה של אינטרונים, אזורים שאינם מקודדים ב-RNA שליח מבשר (pre-mRNA)1,2. אפיון ההשפעה של מוטציה נקודתית אחת ב-1 מתוך כמעט 100 חלבונים ו-5 רנ"א שאינם מקודדים הוא לעתים קרובות דו-משמעי כאשר חוקרים את החלבון או הרנ"א בבידוד. את השינוי בתפקוד הרכיב המוטנטי ניתן להעריך בצורה הטובה ביותר in vivo בהקשר של השחבור המלא והמתפקד.
בדיקת צמיחת הנחושת המתוארת כאן היא מדד מהיר של יעילות שחבור ב- Saccharomyces cerevisiae או שמרים ניצנים. בדיקה זו, שפותחה על ידי C.F. Lesser ו- C. Guthrie ופורסמה בשנת 1993, משלבת את קלות העבודה עם אורגניזם מודל פשוט ואת הקריאה הפשוטה של כדאיות התא3. הכדאיות מתואמת עם מידת היכולת של השחבורים בתאים אלה לזהות ולפצל את תעתיק הכתב.
בדיקת גידול נחושת זו נקראת בדרך כלל בדיקת ACT1-CUP1. השם ACT1-CUP1 מקורו בשני הגנים שהתמזגו ליצירת כתב של יעילות שחבור. ACT1 הוא גן האקטין של שמרים, אשר בא לידי ביטוי גבוה ויש לו אינטרוןשחבור יעיל 4,5. Cup1p הוא צ'לטור נחושת המסנן נחושת בתא כדי למנוע הפרעה לתפקודים תאיים סדירים 6,7,8. כתב ACT1-CUP1 מכיל את הגנים האלה ברצף כך ש-CUP1 נמצא במסגרת הקריאה הנכונה רק אם מתרחשת שחבור קדם-mRNA של האינטרון של ACT1 (איור 1). חלבון הפיוז'ן המתקבל מכיל את 21 חומצות האמינו הראשונות של אקטין ואת חלבון Cup1p באורך מלא, מה שמגדיל את כדאיות השמרים בסביבה עשירה בנחושת3. לפיכך, עלייה בכמות השחבור של הכתב גורמת לריכוז גבוה יותר של Cup1p ולהתנגדות נחושת גבוהה יותר (איור 1). בהשוואה לגנים מדווחים אחרים, CUP1 משפיע על כדאיות התאים גם ברמות נמוכות, יש לו טווח רגישות רחב, וניתן להשתמש בו כדי לבחור ישירות עבור שחבור מוטציות 3,6,7. בנוסף, CUP1 אינו חיוני לצמיחת שמרים סטנדרטית, ולכן הומאוסטזיס תאי אינו מושפע במהלך ההתקנה לבדיקה זו. ACT1-CUP1, המשלים את מבחני המחיקה או הצמיחה בטמפרטורה, מספק מידע על ההשפעות על שחבור בתנאי גידול שמרים אופטימליים אחרים.
השחבור מזהה את המצע שלו באמצעות שלושה רצפים אינטרוניים, כלומר אתר שחבור 5' (5' SS), אתר הסתעפות (BS) ואתר שחבור 3' (3' SS). באתרים אלה נוצרו מספר רב של כתבי ACT1-CUP1 המכילים רצפים שאינם בקונצנזוס. מבחר מהכתבים הנפוצים ביותר של ACT1-CUP1 מוצג באיור 1 ובטבלה 1. מכיוון שהשחבור מקיים אינטראקציה עם כל אתר שחבור באופן ייחודי בנקודות שונות במחזור השחבור, ניתן לבחון את חוסנו של השחבור בשלבים שונים על סמך איזה כתב שאינו קונצנזוס משמש. כתבים שאינם בקונצנזוס נקראים על שם העמדה שעברה מוטציה בתוך האינטרון והבסיס שאליו הוא עבר מוטציה. לדוגמה, A3c הוא כתב עם מוטציה ב-5' SS, במיוחד מיקום 3 מהקונצנזוס אדנוזין לציטוזין. כתב זה יקיים אינטראקציה חזקה עם מוטציות spliceosome המשפיעות על בחירת 5' SS ושימוש. במחקר הראשוני שלהם, לסר וגות'רי קבעו אילו מוטציות SS 5' מעכבות שחבור3. מאוחר יותר באותה שנה, כתבים שאינם בקונצנזוס בכל שלושת אתרי השחבור פורסמו על ידי ברג'ס וגות'רי במסך מדכא של מוטציות ב-ATPase Prp16p9. בהשוואה בין קונצנזוס לכתבים שאינם בקונצנזוס, מבחן ACT1-CUP1 היה מפתח חשוב להבנת החוסן והסלקטיביות של שחבור השמרים ולהסקת התפקוד של שחבורים אחרים של אאוקריוטים.
מכיוון שכתבי ACT1-CUP1 שאינם בקונצנזוס חושים את השחבור להפרעה נוספת, ניתן לאפיין את ההשפעה של מוטציה של גורם שחבור יחיד באמצעות הכתבים שהיא משפיעה עליהם באופן חיובי או שלילי. זה יושם על שחבור שאלות מחקר במגוון דרכים. ראשית, בדיקת ACT1-CUP1 יכולה לשמש כבדיקה גנטית למוטציות בגורמי שחבור. לדוגמה, Prp8p, חלבון השחבור הגדול ביותר, משמש כפלטפורמה שעליה ליבת הרנ"א של השחבור מזרזת את תגובת השחבור. זה הסיק, בין השאר, באמצעות האופן שבו מוטנטים של Prp8p שיפרו או הפחיתו את השחבור של כתבי ACT1-CUP1 שונים 10,11,12,13,14,15,16,17. רכיבי חלבון אחרים של השחבור נחקרו גם הם באמצעות ACT1-CUP1, כולל Hsh155p, Cwc2p, Cef1p ו-Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. הסף האנרגטי של Prp16p וארבעה ATPases אחרים המעורבים במעבר spliceosomal נחקרו גם הם באמצעות בדיקה זו 9,26,27,28,29,30. הרנ"א הגרעיניים הקטנים (snRNAs) נחקרו בהרחבה תוך שימוש ב-ACT1-CUP1 כדי לזהות את רצפי הקדם-mRNA שהם מתאמים ואת השינויים במבנה המשני שה-snRNAs עוברים במהלך שחבור 3,31,32,33,34,35,36,37.
בדיקת ACT1-CUP1 דורשת זן שמרים שבו כל העותקים של הגן CUP1 הודבקו. מכיוון של-CUP1 יכול להיות מספר עותק גבוה 6,38, הכנה של מאמץ נוק-אאוט מלא יכולה לדרוש סיבובים מרובים או סינון נרחב. כתוצאה מכך, זני שמרים cup1Δ חולקו לעתים קרובות בין המעבדות, וכך גם הכתבים.
אם מוטציות בפקטור שחבור נבדקות מעותק פלסמיד, יש לדפוק את הגן מסוג בר עבור גורם זה. בנוסף, רקע השמרים אמור לאפשר בחירה של לפחות שני פלסמידים, אחד המכיל כתב ACT1-CUP1, באופן היסטורי על פלסמיד לבחירת חומרים מזינים של לאוצין, ואחד המכיל מוטציה או הפרעה במנגנון השחבור שייחקרו (איור 2). בדרך כלל, בבדיקה אחת, זני שמרים מרובים, שכל אחד מהם נושא את השאילתה splicing perturbation (QSP) וכתב אחר, יבדקו את השפעת השאילתה על השחבור.
המשתנים הבלתי תלויים במבחן ACT1-CUP1 מאפשרים לחוקר להעריך את חומרת ה-QSP. משתנים בלתי תלויים אלה הם ריכוז הנחושת ובחירתם של כתבים רבים שאינם בקונצנזוס. ראשית, כאשר זני השמרים גדלים על לוחות המכילים מגוון ריכוזי נחושת (איור 2), הגדרת הבדיקה כוללת בחירת השיפוע של הריכוזים שבהם נעשה שימוש. מחקרים יכולים להשתמש בשיפוע ריכוז נחושת קורס כדי לקבל קריאה ראשונית של הכדאיות ולאחר מכן לחזור על הבדיקה עם שיפוע עדין יותר כדי לזהות הבדלים עדינים בכדאיות. המשתנה השני הוא המגוון הרחב של כתבי ACT1-CUP1 שניתן לבדוק (איור 1 וטבלה 1). אם ה-QSP משפיע באופן שונה על כדאיות השמרים בנוכחות כתב שאינו קונצנזוס לעומת סוג פראי, ניתן להסיק מסקנה שה-QSP משפיע על שלב בשחבור או על אזור של השחבור החשוב במהלך הזיהוי או העיבוד של אותו אזור של האינטרון.
ארגז הכלים של השמרים הוא נרחב, ובדיקת ACT1-CUP1 היא חלק בלתי נפרד ממחקר השחבור. בדיקת ACT1-CUP1 מבוצעת לעתים קרובות לצד ניתוח גנטי, מבני ו/או ביוכימי מעמיק יותר על ההשפעה של QSP. מכיוון שלמחקרים מפורטים יותר אלה יש בדרך כלל הליך ארוך יותר ו/או תג מחיר גבוה יותר, גישה שכיחה היא סינון מוטנטים מעניינים עם ACT1-CUP1 תחילה.
מסופק כאן פרוטוקול בדיקה ACT1-CUP1, כולל הכנת לוחות נחושת. בדיקה זו מספקת לחוקרים תשובה ראשונית להשפעת QSP על שחבור ואילו אזורים פנימיים מושפעים ביותר מההפרעה.

<table><tbody><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים 1.5 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-129</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים 2 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-138</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה סטריליים 50 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-201-332</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>מיקרופלייט תחתון עגול 96 באר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-760</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>190 הוכחת אתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-032-600</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>מערכת סינון 500 מ"ל (0.22 ומיקרו; מ)</td> <td>מוצרים מדעיים של CellTreat</td><td>229707</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>אגר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1423-500</td><td>כל אגר בדרגה מולקולרית יעבוד.</td></tr><tr><td>אוטוקלאב</td><td>Tuttnauer</td><td>3870EA</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>מבער בונסן</td><td>Humboldt</td><td>PN6200.1</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>מד צפיפות תאים</td><td>VWR</td><td>490005-906</td><td>או מכשיר ספקטרלי אחר שיכול למדוד ספיגה ב-595 ננומטר.</td></tr><tr><td>נחושת גופרתית Pentahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>LC134051</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>מערכת הדמיה דיגיטלית</td><td>Cytiva</td><td>29399481</td><td>ImageQuant 4000 (משמשת לאיור 3),&nbsp; Amersham ImageQuant 800, או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>תערובת נשירה (-Leu)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>D9525</td><td>השתמש בתערובת הנשירה המתאימה לניסוי שלך. יתכן שתשתמש בסמן תזונתי של שמרים גם להפרעת השאילתה שלך. במקרה כזה, תערובת הנשירה צריכה להיות עבור אותו סמן ו-Leu</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1682836</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>תוכנת כימות פס ג'ל</td><td>Cytiva</td><td>29-0006-05</td><td>ImageQuant TL v8.1 (משמש לאיור 5A) או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>מצלמת כף יד</td><td>Nikon</td><td>D3500</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>ליד מכשיר הדמיית ג'ל אינפרא אדום</td><td>Cytiva</td><td>29238583</td><td>Amersham Typhoon NIR (משמש לאיור 5a) או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>מהדק בדרגת מעבדה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-769-7Q</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>מעמד ומהדק בדרגת מעבדה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-000-101</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>מוטות ערבוב מגנטיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-513-51</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>משכפל סיכות</td><td>VP Scientific</td><td>VP 407AH</td><td></td></tr><tr><td>קובטות חד פעמיות חצי מיקרו</td><td>VWR</td><td>97000-590</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>שייקר</td><td>JEIO Tech</td><td>IST-3075</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>ביו-גל</td><td>80-3000-45</td><td>או כל ספקטופופוטומטר שיכול למדוד את הספיגה ב-600 ננומטר.</td></tr><tr><td>לוחות מרובעים</td><td>VWR</td><td>102091-156</td><td>ניתן להשתמש גם בלוחות עגולים, אם כי הם מאתגרים יותר אם משתמשים במשכפל פינים.</td></tr><tr><td>צלחת ערבוב</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11-520-16S</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr><tr><td>בסיס חנקן שמרים</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>Y2025</td><td>או פריט דומה מיצרן אחר.</td></tr></tbody></table>

מבחני act1-cup1 קובעים את הרגישויות הספציפיות למצע של מוטנטים שחבורים בשמרים ניצנים

ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast

מוטציות שהוכנסו בספליקוזום או במצע שלו תרמו באופן משמעותי להבנתנו את המורכבות של תפקוד השחבור. בין אם הן קשורות למחלה או נבחרו באופן פונקציונלי, רבות מהמוטציות הללו נחקרו באמצעות מבחני גדילה באורגניזם המודל Saccharomyces cerevisiae (שמרים). בדיקת צמיחת הנחושת הספציפית לשחבור, או בדיקת ACT1-CUP1, מספקת ניתוח מקיף של מוטציה ברמה הפנוטיפית. בדיקת ACT1-CUP1 משתמשת בעיתונאים המעניקים עמידות לנחושת כאשר הם מחוברים כהלכה. לפיכך, בנוכחות נחושת, שינויים בכדאיות השמרים מתואמים לשינויים בייצור mRNA באמצעות שחבור. בניסוי טיפוסי, שחבור השמרים מאותגר עם כתבי שחבור שונים שאינם בקונצנזוס ומוטציה של גורם שחבור מעניין כדי לזהות כל השפעה סינרגטית או אנטיתטית על השחבור. כאן ניתן תיאור מלא של הכנת לוחות נחושת, ציפוי של תאי שמרים והערכת נתונים. מתואר מבחר של ניסויים משלימים, המדגישים את הרבגוניות של כתבי ACT1-CUP1. בדיקת ACT1-CUP1 היא כלי שימושי בארגז הכלים של השחבור הודות לקריאה ישירה של אפקטים מוטציוניים והאפשרויות ההשוואתיות מהמשך השימוש בשטח.

מבחני צמיחה, כמו ACT1-CUP1, דורשים הערכה חזותית והשוואתית של מושבות מרובות. כאן, כל זן גדל לרוויה בן לילה, מדוללל-OD 600 של 0.5, ומצופה על 20 לוחות המכילים טווח של ריכוזי נחושת מ-0 mM עד 1.1 mM CuSO4 (איור 3). טווח זה קטן יותר מזה המופיע בפרוטוקול מכיוון שהוא מאפשר הערכה מלאה של ההשפעה של כתבי QSPs ו- ACT1-CUP1 המשמשים ומתוארים להלן. הלוחות צולמו וקיבלו ניקוד (איור 3 וטבלה משלימה 3).
עבור הניסוי ...

בדיקת ACT1-CUP1, בדיקת גידול נחושת, מספקת קריאה מהירה של שחבור RNA שליח מבשר (pre-mRNA) וההשפעה שיש לגורמי שחבור מוטנטיים על תפקוד השחבור השחבור. מחקר זה מספק פרוטוקול ומדגיש את ההתאמה האישית האפשרית כדי להתמודד עם שאלת השחבור המעניינת.

מבחני ACT1-CUP1 קובעים את הרגישויות הספציפיות למצע של מוטנטים שחבורים בשמרים ניצנים

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. ...

בדיקת ACT1-CUP1 יכולה לזהות אם מוטציה משפיעה על שחבור RNA קדם-שליח, ולתת אינדיקציה לאיזה שלב שחבור מושפע ביותר. מבחן ACT1-CUP1 קושר את מוטציית גורם השחבור להשפעתה על התהליך המורכב של השחבור. הוא משתמש בקריאה פשוטה של פנוטיפ גדילה ויש לו טווח רגישות רחב.ניצול יעיל של הזמן חשוב בעת ביצוע בדיקת ACT1-CUP1. התחילו עם בדיקה של חמישה עד עשרה זנים כדי למזער סטיות גדילה הנגרמות על ידי סטרס. מי שמדגימים את התהליך יהיו אני ואיזבל מרסיגן, חוקרת לתואר ראשון מהמעבדה שלי.כדי להתחיל, להוסיף 790 מיליגרם של אגר חטיף לערבב לכל בקבוק. בכוס גדולה, הכינו את מצע הצמיחה של נשירת הלאוצין לכל לוחות הנחושת שישפוך. זה כולל 265 מיליגרם של בסיס חנקן שמרים, 64 מיליגרם של תערובת נשירה, מינוס לאוצין, ו -34 מיליליטר של מים deionized עבור כל צלחת להיות שפך.מערבבים כדי להתמוסס לאחר מכן, הוסיפו 34 מיליליטר של תמיסת המדיה לצמיחת נשירה של לאוצין לכל בקבוק מוכן של 100 מיליליטר, וסגרו בנייר אלומיניום. לאחר מכן, אוטוקלאב כדי לעקר ולהמיס את האגר, תוך שימוש במחזור הנוזלים המומלץ עבור האוטוקלב. מיד ככל האפשר לאחר autoclaving, להוסיף ארבעה מיליליטר של 20% גלוקוז לכל בקבוק.לאחר מכן, התאם את תווית הצינור לתווית הבקבוק כדי להוסיף את שני המיליליטרים של דילולי נחושת גופרתית כל אחד לבקבוק המיועד שלו. בעזרת צלחת ערבוב, מערבבים במשך כ -30 שניות ויוצקים או פיפטה 35 מיליליטר לתוך הצלחת המסומנת, הימנעות בועות. לכל זן שמרים, הוסיפו תשעה מיליליטר של מצע צמיחה לנשירת לאוצין, ומיליליטר אחד של 20% גלוקוז לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר.באמצעות מקל סטרילי, או קצה פיפטה, לאסוף דוגמית קטנה של שמרים ולחסן את המדיה. לאחר מכן, נערו את כל תרבויות הלילה במהירות של 180 סל"ד ו-30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של תרבית cuvette, המכיל 900 microliters של מים לכל זן.לאחר מכן, מדדו את הצפיפות האופטית באמצעות ספקטרופוטומטר וחשבו את הדילול הנדרש כדי להיות בצפיפות אופטית של 0.5 בנפח סופי של שני מיליליטר. לאחר מכן, דלל כל זן לצפיפות אופטית 0.5 ב-10% גליצרול ובחן מחדש את הצפיפות האופטית כדי לוודא שצפיפות התאים נמצאת בטווח הרצוי. לאחר הגדרת מיקום עבודה סטרילי, הדליקו מבער בונזן.עבור משכפל 48 פינים, פיפטה 200 מיקרוליטר של כל זן מדולל לתוך באר נפרדת של צלחת 96 באר, ולמלא את החללים הריקים ברשת שש על שמונה עם 200 מיקרוליטר של 10% גליצרול. לאחר מכן, טבלו את המשכפל בצלחת רדודה של 95% אתנול ולהבה כדי לעקר. תן לו להתקרר לפחות שתי דקות לאחר הלהבה כבה, כדי למנוע חום מזעזע את התאים.מניחים ארבע צלחות ליד המבער ומסירים את המכסים. טבלו את המשכפל בצלחת 96 הבארות והרימו אותו בתנועה מהירה אחת. לאחר מכן, הניחו בעדינות על הצלחת והתנדנדו קלות קדימה ואחורה כדי להקל על העברה טובה.הרם בתנועה מהירה אחת והניח באותו כיוון בדיוק בלוח 96 הבאר. לאחר צלחת כבר מצופה, לנוע בתנועה חלקה לצד, אבל עדיין בתוך מטריית העיקור של הלהבה. תנו לצלחות להתייבש לחלוטין לפני שתניחו את המכסים, בדרך כלל שלוש עד חמש דקות.לאחר מכן, לדגור את הצלחות במשך שלושה ימים ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הצלחות מן האינקובטור, חזותית לבדוק אותם. בדיקת הגדילה הראתה שככל שריכוז הנחושת עולה, זנים עם שחבור נמוך יותר, מראים ירידה במפגש, עד לנקודה שבה ריכוז הנחושת הופך לקטלני.רקע השמרים כולל גן ADE2 משובש, וכתוצאה מכך המושבות הן בגוונים משתנים של אדום. והמושבות הבוגרות היו בצבע אדום עמוק. בזמן הציפוי, אם המשכפל מורם תוך כדי תנועה שמאלה או ימינה, מובא בזווית, או אם הוא מזועזע מעל הצלחת, ניתן ליצור מושבות בצורת אליפסה, או מושבות מיקרו מטיפות קטנות של תמיסת תאים.שמרים עם כתב A3c שרדו ל-0.15 מילימולאר נחושת בעוד שתאי הכתב מסוג בר שמרו על כדאיות עד סוף טווח ריכוזי הנחושת שנבדקו. תוצאות הבדיקה הראו כי לבסיסים השונים במיקום U6 snRNA 57 יש השפעות ייחודיות על השחבור בשילוב עם מוטציה של 5 ראשוניים, או אתר ענף. בעוד U57c הוא מוטציה תוסף, הפחתת סובלנות נחושת, בשילוב עם A3c ו ענף אתר G כתבים.לעומת זאת, U57a מגביר את הסבילות לנחושת מכיוון שהוא מקדם התקדמות לשלב השני. לאחר זיהוי הפרעה שחבור באמצעות ACT1-CUP1, המחקר יכול לעבור לשיטות כמותיות יותר, כמו הרחבת פריימר וזיהוי אינטראקציה מולקולרית משובשת באמצעות EMSAs ובדיקה אנזימטית. ACT1-CUP1 היה מבחן בסיסי, שבנה את ההבנה שלנו לגבי החוסן והסלקטיביות של שחבור השמרים.וזה ממשיך להרחיב את ההבנה שלנו של תפקוד spliceosomal.

act1-cup1-assays-determine-substrate-specific-sensitivities

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

חבילה של מבחני colorimetric מתוארת לחלבון במהירות הבחנה, רנ"א, דנ"א, וסוכרים מחדש ducing בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות.

מבחני colorimetric מהירים לאופן איכותי להבחין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular

כאן אנו מציגים שיטה חסכונית להגדרת אינטראקציות כימיות-גנטיות בשמרים ניצנים. הגישה בנויה על טכניקות בסיסיות בביולוגיה מולקולרית של שמרים ומתאימה היטב לחקירה מכניסטית של אוספים קטנים עד בינוניים של כימיקלים וסביבות מדיה אחרות.

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

מאמר זה מתאר בדיקה מבוססת גידול שמרים לקביעת הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים. הוא גם מדגים שיטה למיצוי מהיר של חלבוני שמרים, המתאימה לכתמים מערביים כדי לאשר ביוכימית את דרישות הפירוק. ניתן להתאים טכניקות אלה לניטור פירוק של מגוון חלבונים.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

כאן אנו מתארים פרוטוקול שנועד לבחון את ההשפעה של שחבור סוטה על עמידות לתרופות בגידולים מוצקים דם ממאירות. למטרה זו, נתחנו את פרופילי transcriptomic דגמים הוריים ועמידים במבחנה באמצעות RNA-seq והקמתי שיטה המבוססת qRT-PCR כדי לאמת גני מועמדים.

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלי סרטן

Ribonucleotides הם בין נוקלאוטידים קאנונית הנפוץ ביותר שולבו הגנום במהלך שכפול ה-DNA הגרעיני האיקריוטים. אם לא כראוי הוסר, ribonucleotides עלול לגרום נזק לדנ א מוטגנזה מכוונת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ניסיוניות אשר משמשים כדי להעריך את השפע של השתלבות ribonucleotide הדנ א ואת השפעותיו מוטגניות.

לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

הציגו כאן הם ארבעה פרוטוקולים כדי לבנות ולנצל שמרים סכביסים כתבת הכתב כדי לחקור את הפוטנציאל האנושי P53 transactivation הפעלה, השפעות של מוטציות הקשורות לסרטן השונים שלה, שיתוף הביע אינטראקציה חלבונים, ו ההשפעות של מולקולות קטנות ספציפיות.

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

אנו מציגים את פרוטוקול מסך משתיק קול פשוט בהתכה שמרים. שיטה זו היא יעילה ללא מוטגן, סלקטיבי מוטציות מתרחשות לעיתים קרובות באתר גנומית יחיד.  הפרוטוקול מתאים לבידוד מדכאי על פגמים צמיחה בתרבות נוזלי שנגרמות על ידי מוטציה או תרופה.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), צנטריפוגה הדרגתית גליצריול בנוכחות crosslinker, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי שיתוף שנקשרים באופן חולף לקומפלקס spliceosome.

ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes

פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית minigene כדי לפקח על ההשפעה של מוטציות באתר 5-splice באתר על חיבור ומפתח מדכא U1 snRNA להצלת עיכוב חיבור המושרה מוטציה. הכתב והמדכא U1 snRNA מבנים באים לידי ביטוי בתאי HeLa, ו splicing מנותח על ידי הרחבת פריימר או RT-PCR.

בדיקה סלולרית מבוססת כתב לניטור יעילות חיבור

למדו את שיטת מבחן ACT1-CUP1 לזיהוי מוטציות המשפיעות על שחבור pre-mRNA בשמרים ניצנים. מבחן זה מספק קריאת פנוטיפ צמיחה פשוטה ורגישות גבוהה לחקר מנגנוני שחבור.

מבחני ACT1-CUP1 קובעים את הרגישויות הספציפיות למצע של מוטנטים שחבורים בשמרים ניצנים

גלה סרטונים נוספים