מבחני ACT1-CUP1 קובעים את הרגישויות הספציפיות למצע של מוטנטים שחבורים בשמרים ניצנים

בדיקת ACT1-CUP1 יכולה לזהות אם מוטציה משפיעה על שחבור RNA קדם-שליח, ולתת אינדיקציה לאיזה שלב שחבור מושפע ביותר. מבחן ACT1-CUP1 קושר את מוטציית גורם השחבור להשפעתה על התהליך המורכב של השחבור. הוא משתמש בקריאה פשוטה של פנוטיפ גדילה ויש לו טווח רגישות רחב.

ניצול יעיל של הזמן חשוב בעת ביצוע בדיקת ACT1-CUP1. התחילו עם בדיקה של חמישה עד עשרה זנים כדי למזער סטיות גדילה הנגרמות על ידי סטרס. מי שמדגימים את התהליך יהיו אני ואיזבל מרסיגן, חוקרת לתואר ראשון מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל, להוסיף 790 מיליגרם של אגר חטיף לערבב לכל בקבוק. בכוס גדולה, הכינו את מצע הצמיחה של נשירת הלאוצין לכל לוחות הנחושת שישפוך. זה כולל 265 מיליגרם של בסיס חנקן שמרים, 64 מיליגרם של תערובת נשירה, מינוס לאוצין, ו -34 מיליליטר של מים deionized עבור כל צלחת להיות שפך.

מערבבים כדי להתמוסס לאחר מכן, הוסיפו 34 מיליליטר של תמיסת המדיה לצמיחת נשירה של לאוצין לכל בקבוק מוכן של 100 מיליליטר, וסגרו בנייר אלומיניום. לאחר מכן, אוטוקלאב כדי לעקר ולהמיס את האגר, תוך שימוש במחזור הנוזלים המומלץ עבור האוטוקלב. מיד ככל האפשר לאחר autoclaving, להוסיף ארבעה מיליליטר של 20% גלוקוז לכל בקבוק.

לאחר מכן, התאם את תווית הצינור לתווית הבקבוק כדי להוסיף את שני המיליליטרים של דילולי נחושת גופרתית כל אחד לבקבוק המיועד שלו. בעזרת צלחת ערבוב, מערבבים במשך כ -30 שניות ויוצקים או פיפטה 35 מיליליטר לתוך הצלחת המסומנת, הימנעות בועות. לכל זן שמרים, הוסיפו תשעה מיליליטר של מצע צמיחה לנשירת לאוצין, ומיליליטר אחד של 20% גלוקוז לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר.

באמצעות מקל סטרילי, או קצה פיפטה, לאסוף דוגמית קטנה של שמרים ולחסן את המדיה. לאחר מכן, נערו את כל תרבויות הלילה במהירות של 180 סל"ד ו-30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של תרבית cuvette, המכיל 900 microliters של מים לכל זן.

לאחר מכן, מדדו את הצפיפות האופטית באמצעות ספקטרופוטומטר וחשבו את הדילול הנדרש כדי להיות בצפיפות אופטית של 0.5 בנפח סופי של שני מיליליטר. לאחר מכן, דלל כל זן לצפיפות אופטית 0.5 ב-10% גליצרול ובחן מחדש את הצפיפות האופטית כדי לוודא שצפיפות התאים נמצאת בטווח הרצוי. לאחר הגדרת מיקום עבודה סטרילי, הדליקו מבער בונזן.

עבור משכפל 48 פינים, פיפטה 200 מיקרוליטר של כל זן מדולל לתוך באר נפרדת של צלחת 96 באר, ולמלא את החללים הריקים ברשת שש על שמונה עם 200 מיקרוליטר של 10% גליצרול. לאחר מכן, טבלו את המשכפל בצלחת רדודה של 95% אתנול ולהבה כדי לעקר. תן לו להתקרר לפחות שתי דקות לאחר הלהבה כבה, כדי למנוע חום מזעזע את התאים.

מניחים ארבע צלחות ליד המבער ומסירים את המכסים. טבלו את המשכפל בצלחת 96 הבארות והרימו אותו בתנועה מהירה אחת. לאחר מכן, הניחו בעדינות על הצלחת והתנדנדו קלות קדימה ואחורה כדי להקל על העברה טובה.

הרם בתנועה מהירה אחת והניח באותו כיוון בדיוק בלוח 96 הבאר. לאחר צלחת כבר מצופה, לנוע בתנועה חלקה לצד, אבל עדיין בתוך מטריית העיקור של הלהבה. תנו לצלחות להתייבש לחלוטין לפני שתניחו את המכסים, בדרך כלל שלוש עד חמש דקות.

לאחר מכן, לדגור את הצלחות במשך שלושה ימים ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הצלחות מן האינקובטור, חזותית לבדוק אותם. בדיקת הגדילה הראתה שככל שריכוז הנחושת עולה, זנים עם שחבור נמוך יותר, מראים ירידה במפגש, עד לנקודה שבה ריכוז הנחושת הופך לקטלני.

רקע השמרים כולל גן ADE2 משובש, וכתוצאה מכך המושבות הן בגוונים משתנים של אדום. והמושבות הבוגרות היו בצבע אדום עמוק. בזמן הציפוי, אם המשכפל מורם תוך כדי תנועה שמאלה או ימינה, מובא בזווית, או אם הוא מזועזע מעל הצלחת, ניתן ליצור מושבות בצורת אליפסה, או מושבות מיקרו מטיפות קטנות של תמיסת תאים.

שמרים עם כתב A3c שרדו ל-0.15 מילימולאר נחושת בעוד שתאי הכתב מסוג בר שמרו על כדאיות עד סוף טווח ריכוזי הנחושת שנבדקו. תוצאות הבדיקה הראו כי לבסיסים השונים במיקום U6 snRNA 57 יש השפעות ייחודיות על השחבור בשילוב עם מוטציה של 5 ראשוניים, או אתר ענף. בעוד U57c הוא מוטציה תוסף, הפחתת סובלנות נחושת, בשילוב עם A3c ו ענף אתר G כתבים.

לעומת זאת, U57a מגביר את הסבילות לנחושת מכיוון שהוא מקדם התקדמות לשלב השני. לאחר זיהוי הפרעה שחבור באמצעות ACT1-CUP1, המחקר יכול לעבור לשיטות כמותיות יותר, כמו הרחבת פריימר וזיהוי אינטראקציה מולקולרית משובשת באמצעות EMSAs ובדיקה אנזימטית. ACT1-CUP1 היה מבחן בסיסי, שבנה את ההבנה שלנו לגבי החוסן והסלקטיביות של שחבור השמרים.

וזה ממשיך להרחיב את ההבנה שלנו של תפקוד spliceosomal.