היישום של גישות מבוססות חיפוש פתוח לזיהוי של Acinetobacter baumannii O מקושר Glycopeptides

פרוטוקול זה מייעל את הזיהוי של גליקופ% eptides חיידקי, ומאפשר לחוקרים לזהות אירועי גליקוזילציה חדשניים, כמו גם את ההבדלים בגליקנים המשמשים לגליקוזילציה בין זנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת למומחים שאינם גליקוזיליה לזהות אירועי גליקוסילציה פוטנציאליים בדגימות פרוטאום חיידקי. חיפוש פתוח הוא גישה ישימה בדרך כלל שניתן להשתמש בה לזיהוי מגוון של שינויים, לא רק גליקוזיליה, וניתן ליישם אותה על כל דגימת פרוטאום.

להכנת טיפים לחילוץ STB-RPS stop and-go, השתמש במחט קהה של 14 מד כדי לסלק שלושה דיסקי STB-RPS מקרום STB-RPS בגודל 47 מ"ר לכריכת 50 מיקרוגרם של פפטיד. עבור כמויות פפטיד גדולות יותר, להגדיל את מספר הדיסקים בהתאם. לפני השימוש בעצות השלב SDB-RPS, לשטוף את הטיפים על ידי הוספת 150 microliters של 100% acetonitrile ספינינג המאגר על ידי צנטריפוגה או בעדינות הפעלת לחץ באמצעות מזרק.

לאחר מכן, לשטוף את הטיפים עם 150 microliters של 30% מתנול המכיל 1%TFA, ולאחר מכן שיווי משקל את הטיפים עם 150 microliters של 90% isopropanol המכיל 1%TFA. לאחר שיווי משקל, לטעון את דגימות פרוטאום על טיפים שלב STB-RPS על ידי צנטריפוגה או באמצעות מזרק. לאחר מכן, לשטוף את הטיפים עם 150 microliters של 90% איזופרופנול המכיל 1%TFA ואחריו 150 microliters של 1%TFA.

כדי לחמוק מהפטידים מטיפי השלב STB-RPS, השתמש ב-150 מיקרוליטרים של 5% אמוניום הידרוקסיד ו-80% אצטוניטריל שנוספו לקצה אחד ואספו את הדגימות המחולקות בצינורות בודדים על ידי הפעלת לחץ בעדינות באמצעות מזרק. לחלופין, אם אתם בורחים באמצעות צנטריפוגה, השתמשו ב-150 מיקרוליטרים ב-5% אמוניום הידרוקסיד ב-80% אצטטוניטריל שנוסף לכל טיפי הבמה ואספו בצלחת נקייה. ייבשו את הפפטידים המנופחים על ידי צנטריפוגת ואקום ב-25 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, כדי להעשיר את דגימות הגליקופטיד, להכין כרומטוגרפיה נוזלית אינטראקציה הידרופילית zwitterionic, או ZIC-HILIC, טיפים לשלב. יש לחתוך דיסק C8 אחד מקרום C8 בגודל 470 מ"ר באמצעות מחט קהה בגודל 14 מ"מ ולארוז את הדיסק לתוך קצה P-200 כדי ליצור פריט. לאחר מכן, להוסיף כחמישה מילימטרים של חומר ZIC-HILIC resuspended ב 50% acetonitrile על פריט על ידי הפעלת לחץ בעדינות באמצעות מזרק.

לפני השימוש בעצות, השתוות את השרף עם 20 נפחי מיטה של חיץ ההמלטה ZIC-HILIC, משאירים 10 מיקרוליטרים של נפח מעל השרף כדי להבטיח כי השרף לא יתייבש. לאחר מכן, לשטוף ברצף את השרף עם 20 נפחי מיטה של חיץ הכנה ZIC-HILIC ואחריו 20 נפחי מיטה של ZIC-HILIC טעינה או חיץ לשטוף. לאחר מכן, הגדילו מחדש את הפפטידים המעוכלים והמיובשים במאגר הטעינה ZIC-HILIC לריכוז סופי של ארבעה מיקרוגרם למיקרוליטר.

מערבולת בקצרה במשך דקה אחת כדי להבטיח את הדגימות resuspended ואז לסובב אותם במשך דקה אחת ב 2000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, טען את דגימת הפפטיד המחודשת לעמודת ZIC-HILIC המותנית, ולאחר מכן שטף את העמודה שלוש פעמים עם 20 נפחי מיטה של מאגר הטעינה ZIC-HILIC על ידי הפעלת לחץ בעדינות באמצעות מזרק. לבסוף, לברוח גליקופפטידים עם 20 נפחי המיטה של חיץ ההמלטה ZIC-HILIC לתוך צינור 1.5 מיליליטר על ידי החלת בעדינות לחץ באמצעות מזרק, ולאחר מכן לייבש את המלט על ידי צנטריפוגת ואקום ב 25 מעלות צלזיוס.

לניתוח LC-MS, הגדילו מחדש את הדגימות ב-Buffer A*לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר, ולאחר מכן טענו את הדגימות על HPLC-UPLC המחובר לטרשת נפוצה כדי לאפשר הפרדה וזיהוי של גליקופפטידים. נטר את איסוף נתוני MS המתקבל, והבטח שהנתונים נאספים עם הפרמטרים הרצויים. כדי לנתח את הדגימות המועשרות בפרוטיאום ובגליקופפטיד, פתח את FragPipe ולחץ על הכרטיסיה זרימת עבודה.

מהתפריט הנפתח זרימת עבודה, בחר באפשרות פתח חיפוש ולחץ על הוסף קבצים כדי לייבא את קבצי הנתונים לחיפוש לתוך FragPipe. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסיה מסד נתונים ואחריו הורד כדי להפעיל את מנהל ההורדות להורדת מסדי נתונים של פרוטאום מ- UniProt באמצעות מספר גישה של UniProt. בתוך מנהל ההורדות, לחץ על האפשרות הוסף פתיונות ומזהמים כדי לשלב חלבונים דמה ומזהמים במסד נתונים זה.

לאחר מכן, לחץ על הכרטיסיה MSFragger ולאחר מכן בתוך התיבה התאמת שיא, הגדל את עמידות המסה של מבשר מ- 500 dalton המוגדר כברירת מחדל ל- 2, 000 dalton כדי לזהות שינויים גדולים. לחץ על הכרטיסיה הפעלה כדי להגדיר את מיקום היציאות של FragPipe ולאחר מכן לחץ על לחצן הפעל כדי להתחיל בחיפוש. עם גליקופטידים בעלי ביטחון גבוה שהוקצו, זהה יונים הקשורים לגליקנים שנצפו בדרך כלל כדי לשפר את הזיהוי של גליקופפטידים.

לאחר מכן, לחץ על הכרטיסיה MSFragger והוסף את מסות הדלתא הנחושות של הגליקנים שנצפו למקטעים שינויים משתנים והיסט מסה עם מסות בודדות המופרדות באמצעות קו נטוי. לאחר מכן, הוסף את גושי השברים הקשורים לגליקן של הגליקנים האלה למקטע Glyco / Labile Mods של MSFragger. לבסוף, העלה את כל נתוני הטרשת הנפוצה הקשורים למחקרים פרוטאומיים למאגרים פרוטאומיים מרכזיים, כגון מאגרי PRIDE או MassIVE.

חיפוש פתוח של זן Acinetobacter baumannii AB307-0294 גילה שתי מסות דלתא דומיננטיות המקבילות 648.25 ו 692.28 דלטון. קפסולת ACICU ידועה להיות מורכב של יחידת K tetrasaccharide המתאים למסה חזויה של 843.31 דלתון. מבנה קפסולה זה עולה בקנה אחד עם מסת הדלתא הנצפית ביותר בתוך ACICU.

ניתוח חיפוש פתוח של הזן D1279779 גילה את נוכחותם של מסות דלתא מרובות בקנה אחד עם 203.08, 794.31, ו 1588.62 דלתונים. באמצעות ביאור ספקטרלי פפטיד אינטראקטיבי, גליקופפטידים שזוהו על פני שלושה זני A.baumannii הוערכו חושף יונים פוטנציאליים הקשורים גליקן. חיפושים ממוקדי גליקן הובילו לעלייה ניכרת במספר הכולל של התאמות ספקטרליות של גליקופפטיד/פפטיד שזוהו בכל שלושת זני A.baumannii, המקבילים לעלייה של 37% ב- ACICU, עלייה של 117% ב- AB307-0294, ועלייה של 363% ב- D1279779.

עבור אירועי טרשת נפוצה בודדים, הכללת מידע ספציפי לגליקן מגדילה בדרך כלל את Hyperscore שנצפה, אם כי עלייה זו תלויה מאוד גליקן. בעת ביצוע העשרת ZIC-HILIC, ודא כי השרף תמיד נשאר רטוב, כמו אובדן של ממס עלול לסכן את הבידוד של גליקופפטידים. נתונים על הבדלים בגליקוזילציה יכולים לשמש כדי ליידע מחקרים mutagenesis או לזהות שיעורי גנים אחראים על biosynthesis גליקן.

באמצעות חיפוש מסד נתונים פתוח, התחלנו לאפיין מגוון גליקן על פני סוגים חיידקיים. זה הראה כי גליקוסילציה חיידקית היא גם נפוצה יותר וגם הרבה יותר מגוונת ממה שחשבנו פעם.