Name: מידול אותות Wnt פאראקרינים לא-קנוניים במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: למדו שיטה לחקר אותות Wnt פאראקרינים לא-קנוניים במודל תרבית תאים של תאי עצב שדר ושריר. הפרוטוקול מאפשר הערכה תפקודית ומולקולרית של מסלול Wnt/PCP ב-Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרסי NIH F30HL154324 ל- O.T. ו- K08HL121191 ו- R03HL154301 ל- S.R.K. המחברים רוצים להכיר בכך שהסכימה באיור 1 בכתב היד הזה נוצרה עם biorender.com.

<ol><li>Ho, H. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a-Ror-Dishevelled+signaling+constitutes+a+core+developmental+pathway+that+controls+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).</li>
<li>Čapek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+Frizzled7+reveals+a+permissive+role+of+noncanonical+wnt+signaling+in+mesendoderm+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration.</a> Elife. (8), 42093(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+regulates+polarized+second+heart+field+morphogenesis+to+promote+both+arterial+and+venous+pole+septation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation.</a> Development. 146 (20), 181719(2019).</li>
<li>Lutze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+WNT-signaling+controls+differentiation+of+lymphatics+and+extension+lymphangiogenesis+via+RAC+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).</li>
<li>Buttler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldevelopment+of+dermal+lymphatics+in+Wnt5a-knockout-mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice.</a> Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).</li>
<li>Betterman, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+cadherin+FAT4+orchestrates+lymphatic+endothelial+cell+polarity+in+response+to+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).</li>
<li>Descamps, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+4+regulates+arterial+network+organization+through+noncanonical+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling.</a> Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).</li>
<li>Weeraratna, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+signaling+directly+affects+cell+motility+and+invasion+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma.</a> Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).</li>
<li>Henry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+novel+Wnt+receptor+ROR2+is+increased+in+breast+cancer+and+may+regulate+both+%CE%B2-catenin+dependent+and+independent+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).</li>
<li>Anastas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+complex+of+SCRIB%2C+NOS1AP+and+VANGL1+regulates+cell+polarity+and+migration%2C+and+is+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression.</a> Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).</li>
<li>Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+WNT+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The complex world of WNT receptor signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).</li>
<li>Dong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+redundancy+of+frizzled+3+and+frizzled+6+in+planar+cell+polarity+control+of+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles.</a> Development. 145 (19), (2018).</li>
<li>Bernascone, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sfrp3+modulates+stromal-epithelial+crosstalk+during+mammary+gland+development+by+regulating+Wnt+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).</li>
<li>Hendrickx, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT16+requires+G%CE%B1+subunits+as+intracellular+partners+for+both+its+canonical+and+noncanonical+WNT+signalling+activity+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts.</a> Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).</li>
<li>Avgustinova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+Wnt7a+recruits+and+activates+fibroblasts+to+promote+tumour+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness.</a> Nature Communications. (7), 10305(2016).</li>
<li>Tseng, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAPE+suppresses+migration+and+invasion+of+prostate+cancer+cells+via+activation+of+noncanonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling.</a> Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Wnt%2FCa2%2B+signaling+in+actin+cytoskeleton+remodeling+and+cell+motility+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer.</a> PLoS One. 5 (5), 10456(2010).</li>
<li>Gibbs, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle1+mutation+causes+planar+cell+polarity+and+directional+cell+migration+defects+associated+with+cardiac+outflow+tract+anomalies+and+other+structural+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects.</a> Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).</li>
<li>Cui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+PCP+protein+required+for+ciliogenesis%2C+regulates+directional+cell+migration+and+cell+polarity+by+direct+modulation+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton.</a> PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).</li>
<li>Gombos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formin+DAAM+functions+as+molecular+effector+of+the+planar+cell+polarity+pathway+during+axonal+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).</li>
<li>Toubat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Crest+Cell-derived+Wnt5a+Regulates+Planar+Cell+Polarity+in+Cranial+Second+Heart+Field+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells.</a> Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+cohesion+by+Wnt5a+during+second+heart+field+progenitor+deployment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment.</a> Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).</li>
<li>Sinha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Wnt5a+disrupts+second+heart+field+cell+deployment+and+may+contribute+to+OFT+malformations+in+DiGeorge+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+instruction+to+output%3A+Wnt%2FPCP+signaling+in+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).</li>
<li>Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Dishevelled-Mediated+Wnt+Signaling+in+Vertebrate+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).</li>
<li>Butler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity in development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).</li>
<li>Bradshaw, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+neural+crest+cells+during+outflow+tract+septation+in+the+neural+crest-deficient+mutant+Splotch2H%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H.</a> Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).</li>
<li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sema3c+and+the+interaction+between+cardiac+neural+crest+and+second+heart+field+during+outflow+tract+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).</li>
<li>Waldo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+is+necessary+for+normal+addition+of+the+myocardium+to+the+arterial+pole+from+the+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field.</a> Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).</li>
<li>Schleiffarth, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+is+required+for+cardiac+outflow+tract+septation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice.</a> Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).</li>
<li>Nguyen, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+Manipulation+of+O9-1+Neural+Crest+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Martinotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

מסלול האיתות הלא-קנוני Wnt/קוטביות התא המישורי (PCP) הוא מסלול איתות תאי בעל חשיבות קריטית שהיה מעורב במספר תהליכים התפתחותיים 24,25 ומחלות 24,26. במהלך ההתפתחות העוברית, איתות Wnt לא-קנוני כולל רשת נרחבת של אותות מולקולריים מתאים השולחים אותות, אשר בסופו של דבר גורמים לשינויים במורפולוגיה, בארגון אסימטרי ובנדידה כיוונית בתאים קולטי אותות11. מחקרים קודמים הראו כי מסלולי קו...

איתות Wnt לא-קנוני הוא מסלול משומר אבולוציונית המווסת את ארגון החוטים התאיים ואת ההגירה הכיוונית. מסלול זה היה מעורב בתהליכים ביולוגיים מרובים, כולל מורפוגנזה של רקמה עוברית 1,2,3, אנגיוגנזה לימפטית וכלי דם 4,5,6,7, וצמיחת סרטן וגרורות 8,9,10 . ברמה התאית, איתות Wnt לא-קנוני מתבצע באמצעות אינטראקציות פרקריניות מתואמות בין תאים השולחים אותות וקולטי אותות. אינטראקציות אלה מתרחשות לעתים קרובות בין תאים של שושלות או סוגים שונים ומערבות רשת מולקולרית מגוונת הכוללת עד 19 ליגנדות וקולטנים מרובים, קולטנים משותפים ואפקטים של התמרת אותות במורד הזרם11. מה שמסבך עוד יותר את תהליך האיתות הזה, מחקרים קודמים הראו כי שילובי ליגנד-קולטן יכולים להשתנות באופן תלוי הקשר ורקמות 12,13, וכי אותן ליגנדות מקור המניעות איתות Wnt לא-קנוני בתאים קולטי אותות יכולות להיות מיוצרות על ידי מספר סוגי תאים השולחים אותות 14,15 . בהתחשב במורכבות התאית והמולקולרית הקשורה לאיתות Wnt לא-קנוני, היכולת לחקור מנגנונים אינדיבידואליים ורלוונטיים מבחינה קלינית in vivo הייתה מוגבלת.
נעשו ניסיונות לחקור איתות Wnt לא-קנוני באמצעות טכניקות של תרביות תאים במבחנה. לדוגמה, מבחני ריפוי פצעים שבוצעו במונולרים תאיים שימשו להערכה פונקציונלית של נדידה כיוונית תאית 4,16,17,18,19. טכניקות אימונוסטינינג שימשו לביצוע ניתוחים מרחביים של ביטוי חלבונים על פני השטח כדי להעריך שינויים שאינם נגרמים על ידי Wnt במורפולוגיה תאית 7,10, ארכיטקטורה וקיטוב אסימטרי18,19,20. אף על פי שגישות אלה סיפקו כלים חשובים לאפיון פנוטיפים הקשורים ל-Wnt בתאים קולטי אותות, היעדרם של רכיבים השולחים אותות בפרוטוקולים אלה מגביל את יכולתם ליצור מודלים מדויקים של מנגנוני איתות פראקריניים שנצפו in vivo. כתוצאה מכך, עדיין קיים צורך קריטי בפיתוח מערכות חוץ גופיות המאפשרות הערכה איתנה וניתנת לשחזור של אינטראקציות איתות פראקריניות בין תאים השולחים אותות וקולטים של מסלול Wnt הלא-קנוני, במיוחד אלה של סוגי תאים שונים.
לשם כך, המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה ליצור פרוטוקול למודל אינטראקציות איתות Wnt לא-קנוניות במבחנה. פיתחנו מערכת קולקולטורה ללא מגע המשחזרת רכיבים של שליחת אותות וקבלת אותות של אינטראקציות אלה ומאפשרת שימוש בגישות מולקולריות, גנטיות או פרמקולוגיות סטנדרטיות כדי לחקור באופן עצמאי מנגנוני קולטני ליגנד ספציפיים במסלול Wnt הלא-קנוני. מנגנונים של איתות Wnt בתיווך NCC נבדקו במיובלסטים באמצעות קווי תאי מורין מבוססים. כהוכחה עקרונית, מודל זה שימש כדי לאשש ממצאים של מחקרי in vivo קודמים בעכברים המרמזים על ציר Wnt5a-ROR2 כמסלול איתות Wnt לא-קנוני רלוונטי בין NCCs 21 לבין אבות קרדיומיובלסטים SHF 3,22,23.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>Antifade מדיום הרכבה עם DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td>מאוחסן ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-2323</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; </td></tr><tr><td>C C2C12 קו תאים מיובלסטי עכברי</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית תאים, 75 ס"מ2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>מערכת שקופיות תאים, 4 בארות</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני (DMEM), גלוקוז גבוה (4.5 גרם/ליטר), L-גלוטמין (2 מ"מ)</td><td>קורנינג</td><td>10-017-CV</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; </td></tr><tr><td>C צינורות צנטריפוגה חרוטיים של פלקון, 15 מ"ל</td> תמיכה חדירה <td>של פישר סיינטיפיק</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>פלקון לצלחת 24 בארות עם 0.4 ומיקרו; M קרום PET שקוף</td><td>Corning</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3381E</td><td>מאוחסן ב-50 מ"ל ב-20 מעלות; </td></tr><tr><td>תמיסת ג'לטין C, 0.1%</td> <td>ATCC</td><td>PCS-999-027</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>קצות פיפטה בוגרים וסטריליים, 10 ומיקרו; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3810</td><td></td></tr><tr><td>גורם מעכב לוקמיה (LIF), 106 יחידה/מ"ל</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין 200 מ"מ (100x)</td> <td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות (MEM NEAA) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>מדיום חיוני מינימלי (MEM)</td> <td>קורנינג</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>מיטומיצין C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית אוטומטיים נון-סטיק, 24 x 55 מ"מ</td><td>Springside Scientific</td><td>HRTCG2455</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 קו תאי פסגה עצבית</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I, 1x</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde פתרון ב-PBS, 4%</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>מאוחסן ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL פניצילין ו-10,000 &mu; גרם/מ"ל סטרפטומיצין)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>W3470H</td><td>מאוחסן ב-10 מ"ל ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; C, יש להרחיק מאור</td></tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט-בופר (PBS), 1x, ללא סידן ומגנזיום, pH 7.4</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים אנושי רקומביננטי - בסיסי (rhFGF-basic)</td> <td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>חלבון רקומביננטי לאדם/עכבר Wnt5a</td><td>R& D Systems</td><td>645-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט, 100 מ"מ</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי מרובעת עם רשת</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>1219C98</td><td></td></tr><tr><td>STO תאי הזנה פיברובלסטים של עכברים</td><td>ATCC</td><td>CRL-1503</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריטון X-100</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>X100-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA, 0.25%</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>W3513C</td><td>מאוחסן ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>Zeiss Apotome.2 מיקרוסקופ פלואורסנטי</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss הפוך Axio Vert.A1 מיקרוסקופ אור</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen lite 2012 תוכנת מיקרוסקופיה</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>הדמיה</td></tr></tbody></table>

מידול אותות wnt פאראקרינים לא-קנוניים במבחנה

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

איתות Wnt לא-קנוני מווסת את ארגון חוטי האקטין התוך-תאיים ואת הנדידה המקוטבת של תאי אב במהלך העובר. תהליך זה דורש אינטראקציות פרקריניות מורכבות ומתואמות בין תאים השולחים אותות וקולטי אותות. בהתחשב בכך שאינטראקציות אלה יכולות להתרחש בין סוגים שונים של תאים משושלות שונות, הערכת in vivo של פגמים ספציפיים לתאים יכולה להיות מאתגרת. המחקר הנוכחי מתאר שיטה בעלת יכולת שחזור גבוהה להערכת איתות Wnt פרקריני לא-קנוני במבחנה. פרוטוקול זה תוכנן עם היכולת (1) לבצע הערכות פונקציונליות ומולקולריות של איתות Wnt לא-קנוני בין כל שני סוגי תאים בעלי עניין; (2) לנתח את התפקיד של מולקולות שולחות אותות לעומת מולקולות קולטות אותות במסלול האיתות הלא-קנוני של Wnt; ו-(3) לבצע ניסויי הצלה פנוטיפיים בגישות מולקולריות או פרמקולוגיות סטנדרטיות.
פרוטוקול זה שימש להערכת איתות Wnt לא-קנוני בתיווך תאי עצב (NCC) במיובלסטים. נוכחותם של NCCs קשורה למספר מוגבר של פילופודיה ציטופלסמית חיובית לפלואידין ולמליפודיה במיובלסטים ונדידת מיובלסטים משופרת בבדיקת ריפוי פצעים. ציר Wnt5a-ROR2 זוהה כמסלול איתות Wnt לא-קנוני חיוני בין NCC לבין אבות קרדיומיובלסטים בשדה הלב השני (SHF). לסיכום, זהו פרוטוקול נוח מאוד לחקר מנגנוני איתות Wnt פרקריניים לא-קנוניים במבחנה.

ההשפעות של NCCs על יכולת הנדידה של מיובלסטים של מורין בדיקה זו יושמה לראשונה כדי להעריך את ההשפעה של NCCs על יכולת הנדידה של מיובלסטים. איור 1 מתאר את המודל הסכמטי של הבדיקה. כדי לבחון השפעה זו, בוצעו בדיקות שריטה עם מיובלסטים שגודלו בבידוד (ללא תוספות NCC) בהשוואה לאלה שגודלו בנוכחות תוספות. כבקרה חיובית, 500 ננוגרם/מ"ל של Wnt5a רקומביננטי (rWnt5a) נוספו לבארות תא עם תוספות NCC. ריכוז זה של rWnt5a נקבע על-ידי ניתוח מינון-תגובה שבוצע בתאי C2C12 (איור משלים S1).</s...

המחקר הנוכחי מתווה שיטה הניתנת לשחזור ומתיחה גבוהה לחקר אירועי איתות Wnt פרקריניים לא-קנוניים במבחנה. פרוטוקול זה יושם כדי להעריך את ההשפעה של איתות Wnt5a של פרקרין בתאי הצמרת העצבית של מורין ובמיובלסטים.

מידול אותות Wnt פאראקרינים לא-קנוניים במבחנה

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

פרוטוקול זה מתווה שיטה בעלת יכולת שחזור גבוהה להערכה פונקציונלית ומולקולרית של אותות Wnt לא קנוניים בכל אוכלוסיית תאים מעניינת. הערכות פונקציונליות ומולקולריות מבוצעות באותה אוכלוסיית תאים וניתן ליישם אותן כדי לחקור כל רכיב של מסלול Wnt/PCP. כדי להתחיל, להשעות את התא C2C12 בעבר גלולה ב 10 מיליליטר של C2C12 בינוני.כדי לדלל את התאים ביחס של 1:20, להוסיף 0.5 מיליליטר של תרחיף התא בצינור 15 מיליליטר המכיל 9.5 מיליליטר של מדיום C2C12 טרי ולערבב בעדינות עם פיפטה סרולוגית באמצעות פיפטה P1000, להוסיף מיליליטר אחד של תרחיף התא המדולל לכל באר חדשה של ארבעה תאים ולהניח אותו באינקובטור. עבור ציפוי O9-1 מוסיף תאים, השהה את גלולת התא O9-1 ב 10 מיליליטר של מדיום הצמיחה O9-1. ובדומה לדילול תאי C2C12, יש לדלל את תאי O9-1 ביחס של 1:20.לאחר מכן, הנח תוסף חדיר יחיד בתוך כל באר של ארבעה תאים חדשים מלאים במיליליטר אחד של מדיום צמיחה O9-1. הוסיפו 300 מיקרוליטרים של תרחיף תאי O9-1 המדולל לכל תוספת וודאו שהתוסף שקוע לחלוטין. ואז לדגור את הבאר ב 37 מעלות צלזיוס.כדי לבצע נוק-דאון של siRNA בתאי O9-1, יש לדלל את ה-siRNA ואת מגיב הטרנספקציה במדיום הסרום המופחת בהתאם להמלצות היצרן בריכוזים הרצויים. מערבבים בעדינות את ה-siRNA המדולל ואת מגיב הטרנספקציה ומדגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך שבע דקות. לאחר 18 עד 24 שעות של ציפוי תאים, הוסיפו את קומפלקסי השומנים של siRNA לתוספות התאים O9-1 ודגרו במשך כ-34 עד 48 שעות.כאשר התאים מגיעים למפגש של 70 עד 80%, הסר את המדיום מתא C2C12 היטב ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS. לאחר הסרת PBS, התחל לגרד את התאים על ידי העברת קצה פיפטה P10 סטרילי בחוזקה בכיוון אחד כדי להשתרע על כל האורך או הרוחב של מונולייר התא. לאחר שהתאים נשרטים, הוסף במהירות מיליליטר אחד של PBS.לאחר מכן, הפעל את המחשב ואת המיקרוסקופ. הנח את שקופית התא על הבמה וסובב את חוגת המטרה להגדלה של 5X. פתח את תוכנת ההדמיה.לחץ על כרטיסיית המצלמה ולאחר מכן לחץ על לחצן Live כדי להציג באופן חזותי את התאים בכרטיסיה AxioCam IC. ודא שמסנן האור נמשך כל הדרך החוצה כדי לאפשר לאור לעבור למצלמה ולמסך המחשב, הזז או סובב ידנית את שקופית התא כדי למקם את אזור הפצע במרכז התמונה החיה בכרטיסיית AxioCam IC. כדי לצלם תמונות, לחץ על הצמד כדי לפתוח כרטיסייה חדשה לצד הכרטיסיה AxioCam IC המכילה את התמונה.כדי לשמור תמונת סטילס זו, לחץ על הקובץ, בחר שמירה בשם, בחר שולחן עבודה בסרגל בצד שמאל כדי לשמור את הקובץ בשולחן העבודה, הזן את שם הקובץ בתיבה שם הקובץ ושמור את הדמות בתבנית קובץ czi. כדי לשמור את התמונה כ- tiff, לחץ על קובץ, בחר שמירה בשם, הזן את שם הקובץ בתיבה שם הקובץ. לחץ על הלחצן שמור כסוג ובחר tiff מהתפריט הנפתח.מקם מחדש באופן ידני את שקופית החדר כדי לצלם שתיים עד שלוש תמונות נוספות בנקודות אחרות של הפצע באותה באר. לאחר ההדמיה, הסר את ה- PBS מכל באר והוסף מיליליטר אחד של מדיום C2C12. הרכיבו את מערכת התרבית המשותפת של הבאר על ידי מיקום ידני של התוספות המכילות את תאי O9-1 בכל באר של החדר.דחפו בעדינות את התוספות כלפי מטה לתוך הבאר, כך שתחתית התוסף ממוקמת בדיוק מעל תאי C2C12 שמתחת. החזירו את מבני הבאר לאינקובטור ואפשרו לתאים לנדוד במשך תשע עד 12 שעות בסך הכל. כדי לקבוע את זמן הנדידה האופטימלי, בדקו את התאים שש שעות לאחר יצירת הפצע, ולאחר מכן כל שעתיים-שלוש.סיים את הניסוי כאשר התאים בתנאי בקרה מכסים לחלוטין את הפצע. התחל את סיום בדיקת ההעברה והכנס היטב את פירוק המערכת על-ידי הסרת תוספות התאים O9-1 לאחר תשע עד 12 שעות מתקופת ההעברה. שאפו בזהירות את מדיום C2C12.הוסף 0.5 מיליליטר של PBS לבארות התא וצלם תמונות סופיות של תאים לאחר נדידה. שאפו בזהירות את כל PBS מעורבב עם בינוני והסירו את תאי הפלסטיק מבארות התא באמצעות הוראות הערכה. השארת השקופית שמתחתיה המכילה את תאי C2C12.עבור מכתמי חיסון, מיד לדגור את השקופית עם 4% paraform aldehyde במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר paraformaldehyde ולשטוף את השקופית עם 0.1% Triton X-100 המכיל PBST במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 15 דקות, יש לשפוך את ה-PBST ולשטוף את המגלשה פעמיים עם PBS במשך 10 דקות כל אחד.לאחר מכן צור גבול הידרופובי עם עט הידרופובי סביב המגלשה כדי למנוע שפיכת תמיסות מהשקופית ומניעת הפרעה לתאי ההדבקה. לאחר מכן, הוסיפו כ-0.5 מיליליטר של תמיסת חסימה של 1% BSA לשקופית בגבול ההידרופובי ודגרו את המגלשה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בתא שקופיות לח. בתום הדגירה, הסירו את התמיסה החוסמת והוסיפו את נוגדן הפלואידין לשקופית זו בתוך הגבול ההידרופובי, ודגרו בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.למחרת, מקם את השקופית במחזיק שקופיות המוגן מפני חשיפה לאור. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. הוסף מדיום הרכבה המכיל DAPI, הרכב את השקופיות עם תלושי כיסוי זכוכית ולכוד את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי.במחקר הנוכחי, תוספת של Wnt5a רקומביננטי לבארות תרבות משותפת האיצה את נדידת מיובלסט עם התאוששות מלאה של אזורים מסוימים בתשע שעות. המיובלסטים הנודדים בכל שלושת התנאים הציגו מורפולוגיה תאית נודדת תקינה, כולל פילופודיה ולמליפודיה בנויות היטב ובולטות וקיטוב אסימטרי של היטלים ציטוסקטליים של אקטין. נבדקה ההשפעה הפראקרנית של Wnt5a שמקורה ב-NCC על נדידת מיובלסט.טיפול ב-50 ננומולר siRNA נגד Wnt5a הפחית את ביטוי הגנים Wnt5a ב-64% בהשוואה לבקרה שלילית. נדידת פיצוצי C2C12 מייל עם הפחתה משמעותית בעקבות נוק-דאון Wnt5a ב-NCCs ותוספת של רקומביננטי אקסוגני Wnt5a הצילו את הגירעון הנודד הזה ואת הפגם המורפולוגי במיובלסטים אלה. על מנת להבין טוב יותר את מנגנוני התא הקולטים במודל הפראקריני, קולטן ROR2 הופל וביטוי הגנים הופחת ב-54% Knockdown של ROR2 במיובלסטים מפחית את יכולת הנדידה שלהם למרות נוכחותם של NCCs.רקומביננטי אקסוגני Wnt5a לא הצליח להציל את נדידת מיובלסט לאחר הפלת ROR2 המצביעה על כך שהתרוקנות ROR2 משבשת את יכולתם של מיובלסטים לקלוט אותות Wnt5a. תאי תרבית לצפיפות נאותה עם קצה P10 רק לאחר הרכבה ופירוק מערכת תרבית משותפת בזהירות מבלי לשבש את התא הבסיסי. טכניקה זו שימשה כהוכחת היתכנות כדי לחקור ציר איתות מולקולרי ספציפי בתוך מסלול Wnt/PCP המורכב עם רלוונטיות לביולוגיה של תאי פסגה עצביים ושדה לב שני.

modeling-paracrine-noncanonical-wnt-signaling-in-vitro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרטון זה מתאר בדיקת ריפוי פצעים ללא מגע בתרבית משותפת כדי להעריך את יכולת הנדידה של מיובלסטים מורינים. זה עוזר להבין רכיבים של שליחת אותות וקבלת אותות של אינטראקציות איתות Wnt פרקריניות לא קנוניות במבחנה.

בדיקת פצעים כדי להעריך את יכולת הנדידה של מיובלסטים מורינים בתרבות משותפת

בדיקת היווצרות מושבת אגר רכה היא שיטה המשמשת לאישור צמיחה בלתי תלויה בעיגון תאי במבחנה. מטרת פרוטוקול זה היא להמחיש שיטה מחמירה לאיתור הפוטנציאל הגידולי של תאים שעברו טרנספורמציה וההשפעות מדכאות הגידול של חלבונים על תאים שעברו טרנספורמציה.

Assay גיבוש רך אגר המושבה

מאמר וידאו זה מציג את השימוש בגרעיני השורש הגבי (DRG)/מודל תאי סרטן באדנוקרצינומה של צינור הלבלב.

במבחנת דוגמנות של פלישה העצבית סרטנית: מודל גנגליון השורש הגבה

שימוש עכברי כתב מצמידים את ההר שלם וסעיף מכתים, מיקרוסקופיה מבחני vivo מקל על הניתוח של המנגנונים העומדים בבסיס הדפוסים הנורמלים של דרך הנשימה. כאן אנו מתארים כיצד טכניקות אלה תרמו ניתוח איתות Wnt במהלך התפתחות קנה נשימה.

לימוד Wnt איתות במהלך דפוסים של איירווייס ניצוח

מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) מאפשר לסרטן להפוך לפולשני. כדי לחקור EMT, מתואר מודל מבחנה מבוסס תאי גזע עצביים (NSC) נטול סרום ואנזימים. מערכת סטנדרטית זו מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של נדידת תאים, ביטוי גנים וחלבונים. המודל מתאים לגילוי תרופות.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

במאמר זה וידאו מפרט פשוטה במתודולוגיה vivo, שניתן להשתמש בהם כדי בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות מורכבות ורשתות רגולטוריות בעוברים חסרי חוליות רבים.

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו<em&gt; ב Vivo</em&gt; מודלים התפתחותי לימוד Cell ל-תא קומפלקס אינטראקציות רשת איתות

בדיקה זו משתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגופי עובר בתרבית בג'ל קולגן תלת-ממדי כדי לנתח את התהליכים הביולוגיים השולטים באנגיוגנזה נובטת במבחנה. הטכניקה יכולה להיות מיושמת לבדיקת תרופות, מידול מחלות, ולחקר גנים ספציפיים בהקשר של מחיקות קטלניות עוברית.

במבחנה בדיקת הנבטה תלת מימדית של אנגיוגנזה באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר לצורך מידול מחלות כלי דם ובדיקות סמים

מאמר זה מתאר מתודולוגיה in vivo ו-in vitro לאפיון אבות התיישבות תימית על ידי ניתוח הקינטיקה של הדור, הפנוטיפ והמספרים של צאצאי תאי ה-T שלהם.

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

כתב היד כאן מספקת מערכת פשוטה של שיטות לניתוח ההפרשה ודיפוזיה של ligands מתויג fluorescently ב Xenopus. זה מספק הקשר לבדיקת היכולת של חלבונים אחרים לשנות הפצת יגנד ומאפשר ניסויים שעשויות לתת תובנה מנגנוני ויסות הדרגתיים מורפוגן.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

איתות חריץ הוא צורה של תקשורת סלולרית המסתמכת על מגע ישיר בין תאים. כדי לגרום כראוי לאיתות Notch במבחנה, יש להציג ליגנדים של Notch לתאים במצב משותק. פרוטוקול זה מתאר שיטות לגירוי חוץ גופי של איתות Notch במבשרי אוסטאוקלסטים של עכברים.

גירוי של מערכת איתות Notch עכבר osteoclast המבשר

למדו שיטה לחקר אותות Wnt פאראקרינים לא-קנוניים במודל תרבית תאים של תאי עצב שדר ושריר. הפרוטוקול מאפשר הערכה תפקודית ומולקולרית של מסלול Wnt/PCP ב-Danio rerio.

מידול אותות Wnt פאראקרינים לא-קנוניים במבחנה

גלה סרטונים נוספים