שימוש בכתמים אדומים של אליזרין לאיתור אובדן עצם הנגרם כימית בזחלי דגי זברה
28 בדצמבר 2021
כאן, השתמשנו בכתמים אדומים של אליזרין כדי להראות שחשיפה לאצטט עופרת גורמת לשינוי במסת העצם אצל זחלי דגי זברה. ניתן להתאים שיטת צביעה זו לחקר אובדן עצם באובדן זחלי דגי זברה הנגרמים על ידי חומרים רעילים מסוכנים אחרים.
שיטה זו יכולה לסייע באיתור רעילות העצם הנגרמת על ידי כימיקלים בדגי זברה. Alizarin צביעה אדומה של רקמה קבועה יוצרת תיעוד קבוע של שינויים בשלד שיכולים להקל על השוואות של מספר דגימות. טכניקה זו עשויה לעזור לחקור אוסטאופורוזיס במודל דגי הזברה, שכן אחד המאפיינים של אוסטאופורוזיס הוא הירידה במסת העצם.
הסר 10 זחלי דגי זברה באופן אקראי מכל קבוצה תשעה ימים לאחר ההפריה, ותקן את הדגים במיליליטר אחד של 2% פרדפורם אלדהיד ו- 1X PBS למשך שעתיים. לרוקן את התמיסה ולשטוף את הזחל דג זברה באמצעות 100 מילימולר Tris HCL עם pH של 7.5 או 10 מילימולר מגנזיום כלוריד. לצורך הסרת כתמים, פזרו את התמיסה ודגרו את הזחל במשך חמש דקות בסדרה של תמיסות כמתואר בכתב היד.
לאחר הדגירה הסופית, decant את הפתרון ולהסיר את הפיגמנט על ידי הלבנה עם תמיסה המורכבת של 3% מי חמצן ו 0.5% אשלגן הידרוקסיד. שימו לב אחת ל-10 דקות עד שהפיגמנט יוסר לחלוטין. שטפו את זחל דגי הזברה מספר פעמים עם 25% גליצרין, 0.1% אשלגן הידרוקסיד למשך 10 דקות כל אחד עד שאין בועות.
כתם בזחל על ידי השרייה במיליליטר אחד של 0.01% אליזרין. הפחת את התמיסה, והוסף מיליליטר אחד של 50% גליצרין או 0.1% אשלגן הידרוקסיד כדי לנקות את הרקע. אחסנו את הדגים ב-50% גליצרין טרי או 0.1% אשלגן הידרוקסיד לתצפית הבאה.
מעבירים זחל אחד בכל פעם על מגלשת הזכוכית ומשאירים את הזחל באמצע טיפת הנוזל. התבונן בזחל תחת מיקרוסקופ סטריאו. הפעל את המצלמה.
פתח את התוכנה ושמור על הגדרות ברירת המחדל. לחץ על AE ובחר זמן חשיפה מתאים כדי לקבל את התמונה הטובה ביותר. צלם את כל התמונות תחת אותן הגדרות.
שמור את התמונות בתבנית dot tiff לניתוח מאוחר יותר. לחץ פעמיים על סמל imageJ. כדי לנתח את התמונות השמורות, לחץ על הקובץ, ואז פתח, לאחר מכן לחץ על התמונה, ולאחר מכן הקלד ובחר שמונה סיביות.
לחץ על עריכה, והפוך. לחץ על נתח ולאחר מכן כייל. בחר OD לא מכויל בממשק המוקפץ.
בדוק את הכיול הכללי בפינה השמאלית התחתונה של הממשק התחתון ולחץ על אישור. לחץ על ניתוח, הגדר קנה מידה ולאחר מכן הסר קנה מידה. בדוק גלובלי למטה, ולחץ על אישור.
לחצו על 'נתח', ואחר כך קבעו מידות. בחר את אזור הפריט בממשק המוקפץ. בדוק את המגבלה לסף למטה כדי למדוד רק את הטווח שנבחר, ולחץ על אישור.
לחץ על התמונה, התאם ואז סף, והחלק את המחוון באמצע הממשק הקופץ. כדי לבחור את הסף המתאים כך שייבחרו כל היעדים לבדיקה בתמונה אחת. ולחץ על הגדר.
לחץ על נתח, ואז מדוד, שמור את התאריכים. צביעה אדומה של אליזרין היא שיטה רגישה וספציפית למדידת שינויים במינרליזציה של העצם בזחלי דגי זברה. בתשעה ימים לאחר ההפריה, עצמות רבות של שלד הראש כגון פרספנואיד, אופרקולרי, ceratobranchial ו notochord הם מינרליזציה ולכן מוכתמים באדום.
לעומת זאת, מבנים לא גרמיים כמו אוטוליטים, נראים שחורים חומים. ניתוח דיגיטלי שבוצע כדי לכמת את השטח המוכתם הכולל, הראה ירידה משמעותית באזור המוכתם עבור 10 ו 20 מיליגרם לליטר של קבוצות טיפול אצטט עופרת. השינויים במינרליזציה של העצם הראו תלות במינון.
לאפקט צביעה ותצפית טובים יותר, חשוב להסיר את הפיגמנט המקורי של זחלי דגי הזברה, ולהסיר את הבועות לאחר ההלבנה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה משתמש בצביעת alizarin red כדי להדגים כי חשיפה ל-lead acetate גורמת לשינויים במסת העצם בזריקי דגים (zebrafish larvae). השיטה ניתנת להתאמה לבדיקת אובדן עצם הנגרם על ידי רעלים מסוכנים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- רעלנות
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- צביעה באליזרין אדום (Alizarin red) היא טכניקה המשמשת להדמיה של מבנים שלדים.
- דגי זברה הם אורגניזם מודל לחקר התפתחות העצם ורעילות.
- עופרת אצטט ידועה כבעלת השפעות רעילות על מערכות ביולוגיות.
- אוסטאופורוזיס מאופיין בירידה במסת העצם, אותה ניתן לדגמן בדגי זהב.
מטרת המחקר
- להערכת ההשפעה של עופרת אצטט על מסת העצם בזריקים של דגי זבrafish.
- לביסוס שיטה לגילוי רעילות לעצם המושרית על ידי כימיקלים.
- לסבסוס השוואות של שינויים בשלד בין דגימות שונות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- צביעה באליזרין אדום (Alizarin red) של רקמת דגי זברה מקובעים.
- קיבוע של זחלי דגי זברה בפראפורמאלדהיד וב-PBS.
- שטיפת זחלים ב-Tris HCL או במגנזיום כלוריד.
- נהלי הסרת צבע כפי שפורטו במאמר.
תוצאות עיקריות
- חשיפה לעששת עופרת הובילה לשינויים ניתנים לצפייה במסת העצם.
- שיטת הצביעה סיפקה תיעוד קבוע של שינויים בשלד.
- התוצאות תומכות בשימוש בדגי zebrafish כמודל לחקר אוסטאופורוזיס.
- המתודולוגיה מאפשרת חקירה של רעלים מסוכנים אחרים.
מסקנות
- צביעה ב-Alizarin red יעילה להערכת רעילות לעצם בדגי zebrafish.
- המחקר מדגיש את הפוטנציאל של zebrafish במחקרים טוקסיקולוגיים.
- מחקרים עתידיים יכולים להרחיב את הבנת ההשפעות של רעלים שונים על בריאות העצם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת זיהוי מוקדם של אובדן עצם מושרה כימית בזריקים של דגי זברה, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בבדיקות רעילות ובתיקוף מטרות עבור מסלולים של בריאות השלד. באמצעות כימות שינויים ברקמה ממינרלית באמצעות צביעת alizarin red, היא מספקת מדד הדיר השמיש והתלוי במינון להערכת השפעות של תרכובות על מינרליזציה של העצם. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי באופטימיזציה של מולקולות מובילות ובסריקת בטיחות פרה-קלינית עבור תרכובות הפועלות על העצם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות למינרליזציה של העצם ולשלמות השלד.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות אספקת תיעוד קבוע וכמותי של שינויים בשלד על פני דגימות שונות.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי מוקדם של תרכובות בעלות השפעות תלויות-מינון על מסת העצם בשלבי הגילוי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מדידות כמותיות של השטח הצבוע המבוססות על סף (threshold), לצורך השוואה אובייקטיבית בין קבוצות הטיפול.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הכנת הדגימות והדימוי כדי להבטיח הדירות ויכולת הרחבה בפורמטים של מספר בארות (multi-well).
- מוכנות הבדיקה: מייצר פלטים דיגיטליים התואמים לניתוח ב-ImageJ, המאפשרים סריקה של תכנים גבוהים (high-content screening) של פנוטיפים של רעילות גרמית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: ממדל תגובות שלד רלוונטיות לבני אדם לרעלים, ובכך תומך בהלימה של סמנים ביולוגיים תרגומיים לאובדן עצם.
- ערך תפעולי: מגשר בין תהליכי גילוי לבין תהליכי עבודה פרה-קליניים על ידי אספקת בדיקה שמורה מבוססת חולייתנים עבור מינרליזציה של עצם.
- הפחתת סיכונים: מסייע בקבלת החלטות קידום מותאמות לסיכון על ידי זיהוי אותות של אובדן עצם לפני מחקרים ביונקים.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות המטרה דרך זיהוי תרכובות מובילות ועד להערכת בטיחות פרה-קלינית, במיוחד עבור תרכובות בעלות השפעות פוטנציאליות לא ספציפיות (off-target) על מערכות השלד.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבחינת השערות לגבי השפעות כימיות על התפתחות העצם ומסלולי מינרליזציה במודל של חולית.
- סריקה: מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות ותוצאות כמותיות לזיהוי שינויים תלויי-מינון בשטח הצבוע.
- אנליטיקה: מספקת מדידות שטח מכויילות מבוססות-סף המאפשרות השוואה סטטיסטית של מינרליזציית עצם בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול תגובות שלד שמורות לרעלים בזריקים של דגי זברה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לסריקת ספריות כימיות מגוונות לבחינת פוטנציאל לרעילות לעצמות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזויי תיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולים הקשורים לעצם.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והניתנות להרחבה באמצעות שלבי קיבוע, צביעה וכמותיות דיגיטליות סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go באמצעות אספקת אותות כמותיים מוקדמים של נטייה לאובדן מסת עצם.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי זיהוי סיכוני רעילות שלדית לפני השקעה משמעותית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בדגי zebrafish, היסטולוגיה ודימות פלואורסצנטי/קולורימטרי.
- תלוי במיקרוסקופיה סטריאוסקופית ובתוכנה לניתוח תמונות (למשל, ImageJ) לצורך כימות סטנדרטי.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי צביעה והגדרות סף בין צוותים שונים כדי להבטיח תוצאות הניתנות לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה למערכות מודל אחרות או למחלקה כימית מעבר ל-lead acetate.
- מוגבל בשל הצורך בשלבי הסרת פיגמנטים והבהרת רקע כדי להבטיח גילוי אות מדויק.
