Name: שימוש בכתמים אדומים של אליזרין לאיתור אובדן עצם הנגרם כימית בזחלי דגי זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: למדו כיצד לזהות רעילות בעצם בזחלי דגי זברה באמצעות צביעת אליזרין אדום. השיטה מאפשרת תיעוד קבוע של שינויים שלדיים ומאפשרת השוואה בין דגימות לחקר השפעות רעילות על עצם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81872646; 81811540034; 81573173) ופיתוח התוכנית האקדמית העדיפה של מוסדות ההשכלה הגבוהה של ג'יאנגסו (PAPD).

כל הנהלים לבעלי חיים המפורטים כאן נבדקו ואושרו על ידי המכון לטיפול בבעלי חיים של ועדת האתיקה של אוניברסיטת Soochow.
1. גידול דגים ואוסף עוברים 14
<ol><li>להאכיל דגים שלוש פעמים בכל יום; ודא שדגי הזברה נשמרים בטמפרטורה של 28.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך של 14:10 שעות.</li>
	<li>הפרידו בין הדגים הבוגרים הזכרים והנקבות על ידי לוחות בידוד במיכלי ההשרצה ביחס של 2:1 בין זכר לנקבה בערב.</li>
	<li>למחרת בבוקר יש להסיר את לוחות הבידוד בשעה 9:00 ולאסוף את העוברים כעבור שעתיים.</li>
	<li>מניחים את העוברים באינקובטור ביוכימי שנשמר בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס לפני הניסוי.</li>
</ol>2. חשיפה כימית
<ol><li>מכינים את ציר האם: שוקלים עופרת אצטט טריהידרט (5 גרם), וממיסים אותה במים אולטרה-טהורים (50 מ"ל) תוך ערבוב. אזהרה: PbAc רעיל. יש ללבוש מסכות אבק, ביגוד מגן וכפפות מתאימות. בצע את הניסוי מתחת למכסה אדים.</li>
	<li>בחר ופזר באופן אקראי עוברי דגי זברה לצלחות נקיות של 6 בארות (30 עוברים לכל באר ב-3 מ"ל של מי רבייה של דגי זברה; ראו טבלה 1 להרכבם). טפלו בעוברים באמצעות PbAc (0, 5, 10, 20 מ"ג/ליטר) בין 2 ל-120 שעות לאחר ההפריה (hpf). הערה: הריכוזים של PbAc נבחרו על פי ניסויי מציאת טווח המינון. התוצאות הראו כי LC50 של אצטט עופרת על עוברי דגי זברה היה 41.044 מ"ג/ליטר ב-120 כ"ס. לפיכך, הריכוז הגבוה ביותר נקבע למחצית מה- LC50 וסדרה של פתרונות שהוכנו על ידי דילול פי 2.</li>
	<li>להאכיל את הזחלים פעמיים ביום מ 5 ימים לאחר ההפריה (dpf). שמור על עוברי דגי הזברה ב 28.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס עם מחזור אור / חושך של 14:10 שעות.</li>
	<li>רעננו את המדיום נטול ה-Pb (מי רבייה של דגי זברה) כל 24 שעות עד 9 dpf. הערה: עם השלמת הניסויים, כל התמיסות המכילות עופרת נשפכו למיכל נוזלי ייעודי וטופלו על ידי מרכז ניהול הניסויים.</li>
</ol>3. מכתים אדומים של אליזרין
הערה: יש ללבוש מסכות אבק, ביגוד מגן וכפפות מתאימים במהלך כל תהליך ההכתמה. ההרכבים של כל הפתרונות מוצגים בטבלה 1.
<ol><li>שלבי צביעה ספציפיים הערה: תהליך הצביעה בוצע בצלחת של 24 בארות בטמפרטורת החדר. לאחר הוספת כל תמיסה, הניחו את צלחת 24 הבארות על השולחן המטלטל שנקבע במהירות נמוכה.<ol><li>הסר 10 זחלי דגי זברה באופן אקראי מכל קבוצה ב-9 dpf וקבע את הדגים ב-1 מ"ל של 2% פרפורמלדהיד/1x מלח עם חציית פוספט למשך שעתיים.</li>
		<li>דקטו את התמיסה ושטפו את זחלי דגי הזברה ב-100 mM Tris-HCl (pH 7.5)/10 mM MgCl2 למשך 10 דקות.</li>
		<li>דקנט את התמיסה ודגירה של הזחלים בתמיסות הבאות למשך 5 דקות כל אחת לצורך פירוק: תמיסת אתנול נטול מים (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7.5)/10 mM MgCl2, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7.5), ו-25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7.5).</li>
		<li>לרוקן את התמיסה, להסיר את הפיגמנט על ידי הלבנה עם תמיסה המורכבת של 3% H 2 O2ו 0.5% KOH, ולצפות אחת ל 10 דקות עד פיגמנט מוסר לחלוטין.</li>
		<li>שטפו את זחלי דגי הזברה מספר פעמים עם 25% גליצרין/0.1% KOH למשך 10 דקות כל אחד עד שלא יהיו בועות. הערה: חשוב להימנע מבועות; אחרת, הבועות בגוף דג הזברה יופיעו כשדה ראייה שחור מתחת למיקרוסקופ, מה שישפיע על תצפיות וניתוח כמותי.</li>
		<li>הכתימו את הזחלים על ידי השרייה ב-1 מ"ל של 0.01% אליזרין למשך 50 דקות.</li>
		<li>נטרלו את התמיסה והוסיפו 1 מ"ל של 50% גליצרין/0.1% KOH למשך 10 דקות כדי לנקות את הרקע. אחסנו את הדגים ב-50% גליצרין/0.1% KOH טריים לתצפית שלאחר מכן.</li>
	</ol></li>
</ol>4. רכישת תמונה
<ol><li>מעבירים זחל אחד על מגלשת הזכוכית בכל פעם, ומשאירים את הזחל במרכז טיפת הנוזל.</li>
	<li>התבונן בזחלים תחת מיקרוסקופ סטריאו.</li>
	<li>הפעל את המצלמה, פתח את התוכנה (עיין בטבלת החומרים) ושמור על הגדרות ברירת המחדל.</li>
	<li>לחץ על AE, ובחר זמן חשיפה מתאים (60 מילישניות בניסוי זה) כדי לקבל את התמונה הטובה ביותר.</li>
	<li>צלם את כל התמונות תחת אותן הגדרות. שמור את התמונות בתבנית .tif לניתוח מאוחר יותר.</li>
</ol>5. ניתוח תמונות
הערה: ראה את הקובץ המשלים לדוגמה עם קבוצה של גרפים לדוגמה לניתוח תמונות.
<ol><li>לחץ פעמיים על סמל ImageJ ונתח את התמונות שנשמרו בשלב 4.5.<ol><li>לחץ על קובץ | פתח כדי לפתוח את התמונות שנשמרו בשלב 4.5.</li>
		<li>לחץ על תמונה | הקלד, בחר 8 סיביות.</li>
		<li>לחץ על ערוך | הפוך.</li>
		<li>לחץ על נתח | כייל, בחר OD לא מכויל בממשק הקופץ, סמן את כיול כללי בפינה השמאלית התחתונה של הממשק התחתון ולחץ על אישור.</li>
		<li>לחץ על נתח | קנה מידה מוגדר | לחץ כדי להסיר קנה מידה בממשק הקופץ, סמן את כללי למטה ולחץ על אישור.</li>
		<li>לחץ על נתח | קבעו מידות, בחרו באזור הפריט בממשק הקופץ, בדקו את ההגבלה לסף למטה (למדידת הטווח שנבחר בלבד) ולחצו על הלחצן 'אשר'.</li>
		<li>לחץ על תמונה | התאמה| סף, החלק את המחוון באמצע הממשק הנפתח כדי לבחור את הסף המתאים (שנה את הסף לכל תמונה) כך שכל היעדים לבדיקה בתמונה אחת ייבחרו, ולחץ על Set.</li>
		<li>לחץ על נתח | למדוד. רשום את התאריכים של כל קבוצה.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש ב- ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של Tukey כדי לנתח את ההבדלים, והגדר את רמת המובהקות ב - p < 0.001 (***).</li>
</ol>

<ol><li>Compston, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+registration+of+agents+for+prevention+and+treatment+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%3A+an+update+from+the+Group+for+the+Respect+of+Ethics+and+Excellence+in+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science.</a> Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).</li>
<li>Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+preventing+bone+loss+induced+by+aromatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors.</a> Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).</li>
<li>Kataba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+environmentally+relevant+lead+levels+induces+oxidative+stress+and+neurobehavioral+alterations+in+larval+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio).</a> Aquatic Toxicology. 227, 105607(2020).</li>
<li>Morin, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+fracture+prevalence+and+in+bone+mineral+density+between+Chinese+and+White+Canadians%3A+the+Canadian+Multicentre+Osteoporosis+Study+%28CaMos%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Osteoporosis%22%5BJournal%5D)">Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos).</a> Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147(2020).</li>
<li>Lee, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lead+poisoning+magnifies+bone+detrimental+effects+in+an+ovariectomized+rat+model+of+postmenopausal+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis.</a> Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).</li>
<li>Theppeang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+bone+mineral+density+and+lead+levels+in+blood%2C+tibia%2C+and+patella+in+urban-dwelling+women%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women.</a> Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+in+a+Chinese+population+due+to+occupational+exposure+to+lead%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Industrial+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead.</a> American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).</li>
<li>Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+and+bone+mass+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exercise and bone mass in adults.</a> Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).</li>
<li>Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+structure+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Collagen structure and functional implications.</a> Micron. 32 (3), 251-260 (2001).</li>
<li>Kelly, W. L., Bryden, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+differential+stain+for+cartilage+and+bone+in+whole+mount+preparations+of+mammalian+fetuses+and+small+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates.</a> Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).</li>
<li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+high+content%2C+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+as+a+model+to+assess+chemical+toxicity+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fish as a model to assess chemical toxicity in bone.</a> Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GH%2FIGF+axis+in+arsenite-induced+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos.</a> Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820(2020).</li>
<li>Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+osteoporosis%3A+a+primary+testing+platform+for+screening+new+osteo-active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 6(2019).</li>
<li>Charles, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+quantitative+micro-computed+tomographic+analysis+in+zebrafish+to+define+gene+function+during+skeletogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis.</a> Bone. 101, 162-171 (2017).</li>
<li>Hammond, C. L., Moro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+transgenic+reporters+to+visualize+bone+and+cartilage+signaling+during+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 91(2012).</li>
<li>Bensimon-Brito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+in+vivo+staining+with+alizarin+red+S--a+valuable+approach+to+analyse+zebrafish+skeletal+mineralization+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration.</a> BMC Developmental Biology. 16, 2(2016).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

דג הזברה הוא מודל מתאים לחקר מחלות מטבוליות של העצם. בהשוואה למודלים של מכרסמים, מודלים של דגי זברה מהירים יחסית להתבססות, ומדידת חומרת המחלה קלה יותר. בזחלי דגי זברה מסוג בר, מינרליזציה של שלד הראש מתרחשת ב-5 dpf והשלד הצירי ב-7 dpf15. לפיכך, עצמות גולגולת כגון PS, OP, CB ו- NC מפותחות היטב ב 9 dpf. לאחר שהזחלים הושחתו לחלוטין והולבנו, הרקמות הרכות פונו, והתוצאה הייתה מראה שקוף של גוף הדג. ריאגנט הכתמים האדום של אליזרין נוסף כדי להכתים ולדמיין את עצמות המינרלים בדגי זברה באדום. 
<p class="jov...

מחקרים אחרונים אישרו כי אוסטאופורוזיס עקב גלוקוקורטיקואידים, מעכבי ארומטאז וצריכת אלכוהול מופרזת נפוצה 1,2. עופרת (Pb) היא מתכת רעילה המצויה בצמחים, באדמה ובסביבות ימיות3. למרות ההשפעות השליליות של Pb על גוף האדם משכו תשומת לב רבה, ההשפעה הבלתי הפיכה שלה על העצם צריך להיחקר עוד יותר. הרעלת עופרת גורמת למגוון רחב של שינויים פתולוגיים הן בשלד המתפתח והן בשלד הבוגר, המשפיעים על פעילויות החיים הרגילות. מחקרים מצאו קשר בין חשיפה כרונית ל-Pb לבין נזק לעצם4, כולל פגיעה במבני העצם5,6, ירידה בצפיפות המינרלים בעצם ואף סיכון מוגבר לאוסטאופורוזיס7.
לרקמה שעברה מינרליזציה יש חשיבות רבה לחוזק העצם8, ותצהיר מטריצת מינרליזציה של העצם הוא מדד קריטי ליצירת עצם9. לאדום אליזרין יש זיקה גבוהה ליוני סידן, וכתמים אדומים של אליזרין הם הליך סטנדרטי להערכת היווצרות עצם10. על פי שיטה זו, רקמה מינרלית מוכתמת באדום, בעוד שכל שאר הרקמות נשארות שקופות. לאחר מכן מכמתים את האזור המוכתם על ידי ניתוח תמונה דיגיטלי11.
דג זברה הוא אורגניזם מודל חשוב הנמצא בשימוש נרחב בגילוי תרופות ובמודלים של מחלות. מחקרים גנטיים בדגי זברה ובבני אדם הראו דמיון במנגנונים הבסיסיים של מורפוגנזה של השלד ברמה המולקולרית12. יתר על כן, בדיקת תרופות או ביו-מולקולות בתפוקה גבוהה אפשרית יותר במצמדים גדולים של דגי זברה מאשר מודלים של מורין, מה שמקל על המחקר המכניסטי של מולקולות פרואוסטאוגניות או אוסטאוטוטוקסיות13. צביעה דיפרנציאלית של השלד בטוטו10 משמשת לעתים קרובות בחקר דיספלסיה של השלד אצל בעלי חוליות קטנים ועוברי יונקים. הכתמה אדומה של אליזרין בוצעה כדי לחקור את הרעילות ההתפתחותית של העצם של כימיקלים בזחלי דגי זברה. כאן, השתמשנו בעופרת כדוגמה לתיאור פרוטוקול לאיתור פגמים בעצמות הנגרמות על ידי אצטט עופרת בזחלי דגי זברה.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl (pH=7.5)</td> <td>Solarbio, בייג'ינג, סין</td><td>21</td><td>לעיכוב</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde Fix Solution</td><td>BBI, שנחאי, סין</td><td>14</td><td>תיקון רקמות</td></tr><tr><td>10x PBS buffer</td><td>BBI, שנחאי, סין</td><td>15</td><td>לתיקון</td></tr><tr><td>35% H2O2</td><td>Yonghua, ג'יאנגסו, סין</td><td>8</td><td>הסרת פיגמנט</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>AKX, ג'יאנגסו, סין</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>95% אתנול נטול מים</td><td>אנוקס, ג'יאנגסו, סין</td><td>2</td><td>מבטל</td></tr><tr><td>אליזרין אדום (טוהר 99.5%)</td> <td>סולארביו, בייג'ינג, סין</td><td>1</td><td>מכתים</td></tr><tr><td>חממה ביוכימית</td><td>Yiheng, שנחאי, סין</td><td>3</td><td>גידול עוברי דג זברה</td></tr><tr><td>בקנה מידה אלקטרוני</td><td>Sartorius, גרמניה</td><td>5</td><td>שקילת חומרי הגלם המוצקים</td></tr><tr><td>גליצרין (טוהר 99.5%)</td> <td>BBI, שנחאי, סין</td><td>7</td><td>אחסון הדגים המוכתמים</td></tr><tr><td>ImageJ (תוכנה)</td> <td>ארה"ב</td><td></td><td>9 ניתוח דיגיטלי</td></tr><tr><td>KOH (טוהר 99.9%)</td> <td>סיגמא, אמריקה</td><td>10</td><td>תמיסת הלבנה</td></tr><tr><td>עופרת אצטט טריהידרט (טוהר 99.5%)</td> <td>אלאדין, שנחאי, סין</td><td>11</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 </ תת>(טוהר 99.9%)</td> <td>אלאדין, שנחאי, סין</td><td>12</td><td>פתרון ניקוי</td></tr><tr><td>NIS-Elements F (תוכנה)</td> <td>ניקון, יפן</td><td>13</td><td>התבוננות וצילום</td></tr><tr><td>תמונות צינור</td><td>AKX, ג'יאנגסו, סין</td><td>18</td><td>הסרת עוברים וצלחות תמיסה</td></tr><tr><td>(24 בארות)</td> <td>קורנינג, אמריקה</td><td>17</td><td>מיכל להכתמת</td></tr><tr><td>צלחות עוברים (6 בארות)</td> <td>קורנינג, אמריקה</td><td>16</td><td>מיכל לגידול עוברים</td></tr> שולחן <tr><td>רועד</td><td>Beyotime, סין</td><td>19</td><td>ערבוב התמיסה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>ניקון, יפן</td><td>20</td><td>התבוננות וצילום</td></tr><tr>דג<td>זברה</td><td>מרכז ניסויים דג זברה של אוניברסיטת סוצ'ו, סוג'ואו, סין</td><td>22</td><td>חיית ניסוי</td></tr></tbody></table>

שימוש בכתמים אדומים של אליזרין לאיתור אובדן עצם הנגרם כימית בזחלי דגי זברה

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

אובדן עצם שנגרם כימית כתוצאה מחשיפה לעופרת (Pb) עלול לגרום למגוון השפעות שליליות על מערכות השלד של בני אדם ובעלי חיים. עם זאת, ההשפעות והמנגנונים הספציפיים בדגי זברה עדיין אינם ברורים. לאדום אליזרין יש זיקה גבוהה ליוני סידן והוא יכול לעזור לדמיין את העצם ולהמחיש את מסת המינרלים בשלד. במחקר זה שמנו לנו למטרה לזהות אובדן עצם הנגרם על-ידי אצטט עופרת (PbAc) בזחלים של דגי זברה על-ידי שימוש בכתמים אדומים של אליזרין. עוברי דגי זברה טופלו בסדרה של ריכוזי PbAc (0, 5, 10, 20 מ"ג/ל') בין 2 ל-120 שעות לאחר ההפריה. צביעת שלד שלם בוצעה על זחלים 9 ימים לאחר ההפריה, והשטח המוכתם הכולל כומת באמצעות תוכנת ImageJ. התוצאות הצביעו על כך שהרקמות המינרליות היו מוכתמות באדום, והאזור המוכתם ירד משמעותית בקבוצת החשיפה ל-PbAc, עם שינוי תלוי מינון במינרליזציה של העצם. מאמר זה מציג פרוטוקול צביעה לחקר שינויים בשלד בפגמים בעצמות הנגרמות על ידי PbAc. השיטה יכולה לשמש גם זחלי דגי זברה לאיתור אובדן עצם הנגרם על ידי כימיקלים אחרים.

צביעה אדומה של אליזרין היא שיטה רגישה וספציפית למדידת שינויים במינרליזציה של העצם בזחלי דגי זברה. במחקר זה ראינו כי ל-PbAc היו השפעות שליליות על זחלי דגי זברה, כולל מוות, מום, ירידה בקצב הלב וקיצור אורך הגוף. יתר על כן, אזורי השלד המינרלי של זחלי דגי זברה הוערכו כדי לבחון אובדן עצם הנגרם על ידי PbAc. ב-9 dpf (איור 1A), עצמות רבות של שלד הראש עוברות מינרליזציה ולכן מוכתמות באדום, כגון פרספנואיד (PS), אופרקל (OP), צרטובנצ'יאל (CB) ונוטוקורד (NC). לעומת זאת, אוטוליטים (OT) (מבנים לא גרמיים) נרא...

כאן, השתמשנו בכתמים אדומים של אליזרין כדי להראות שחשיפה לאצטט עופרת גורמת לשינוי במסת העצם אצל זחלי דגי זברה. ניתן להתאים שיטת צביעה זו לחקר אובדן עצם באובדן זחלי דגי זברה הנגרמים על ידי חומרים רעילים מסוכנים אחרים.

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

שיטה זו יכולה לסייע באיתור רעילות העצם הנגרמת על ידי כימיקלים בדגי זברה. Alizarin צביעה אדומה של רקמה קבועה יוצרת תיעוד קבוע של שינויים בשלד שיכולים להקל על השוואות של מספר דגימות. טכניקה זו עשויה לעזור לחקור אוסטאופורוזיס במודל דגי הזברה, שכן אחד המאפיינים של אוסטאופורוזיס הוא הירידה במסת העצם.הסר 10 זחלי דגי זברה באופן אקראי מכל קבוצה תשעה ימים לאחר ההפריה, ותקן את הדגים במיליליטר אחד של 2% פרדפורם אלדהיד ו- 1X PBS למשך שעתיים. לרוקן את התמיסה ולשטוף את הזחל דג זברה באמצעות 100 מילימולר Tris HCL עם pH של 7.5 או 10 מילימולר מגנזיום כלוריד. לצורך הסרת כתמים, פזרו את התמיסה ודגרו את הזחל במשך חמש דקות בסדרה של תמיסות כמתואר בכתב היד.לאחר הדגירה הסופית, decant את הפתרון ולהסיר את הפיגמנט על ידי הלבנה עם תמיסה המורכבת של 3% מי חמצן ו 0.5% אשלגן הידרוקסיד. שימו לב אחת ל-10 דקות עד שהפיגמנט יוסר לחלוטין. שטפו את זחל דגי הזברה מספר פעמים עם 25% גליצרין, 0.1% אשלגן הידרוקסיד למשך 10 דקות כל אחד עד שאין בועות.כתם בזחל על ידי השרייה במיליליטר אחד של 0.01% אליזרין. הפחת את התמיסה, והוסף מיליליטר אחד של 50% גליצרין או 0.1% אשלגן הידרוקסיד כדי לנקות את הרקע. אחסנו את הדגים ב-50% גליצרין טרי או 0.1% אשלגן הידרוקסיד לתצפית הבאה.מעבירים זחל אחד בכל פעם על מגלשת הזכוכית ומשאירים את הזחל באמצע טיפת הנוזל. התבונן בזחל תחת מיקרוסקופ סטריאו. הפעל את המצלמה.פתח את התוכנה ושמור על הגדרות ברירת המחדל. לחץ על AE ובחר זמן חשיפה מתאים כדי לקבל את התמונה הטובה ביותר. צלם את כל התמונות תחת אותן הגדרות.שמור את התמונות בתבנית dot tiff לניתוח מאוחר יותר. לחץ פעמיים על סמל imageJ. כדי לנתח את התמונות השמורות, לחץ על הקובץ, ואז פתח, לאחר מכן לחץ על התמונה, ולאחר מכן הקלד ובחר שמונה סיביות.לחץ על עריכה, והפוך. לחץ על נתח ולאחר מכן כייל. בחר OD לא מכויל בממשק המוקפץ.בדוק את הכיול הכללי בפינה השמאלית התחתונה של הממשק התחתון ולחץ על אישור. לחץ על ניתוח, הגדר קנה מידה ולאחר מכן הסר קנה מידה. בדוק גלובלי למטה, ולחץ על אישור.לחצו על 'נתח', ואחר כך קבעו מידות. בחר את אזור הפריט בממשק המוקפץ. בדוק את המגבלה לסף למטה כדי למדוד רק את הטווח שנבחר, ולחץ על אישור.לחץ על התמונה, התאם ואז סף, והחלק את המחוון באמצע הממשק הקופץ. כדי לבחור את הסף המתאים כך שייבחרו כל היעדים לבדיקה בתמונה אחת. ולחץ על הגדר.לחץ על נתח, ואז מדוד, שמור את התאריכים. צביעה אדומה של אליזרין היא שיטה רגישה וספציפית למדידת שינויים במינרליזציה של העצם בזחלי דגי זברה. בתשעה ימים לאחר ההפריה, עצמות רבות של שלד הראש כגון פרספנואיד, אופרקולרי, ceratobranchial ו notochord הם מינרליזציה ולכן מוכתמים באדום.לעומת זאת, מבנים לא גרמיים כמו אוטוליטים, נראים שחורים חומים. ניתוח דיגיטלי שבוצע כדי לכמת את השטח המוכתם הכולל, הראה ירידה משמעותית באזור המוכתם עבור 10 ו 20 מיליגרם לליטר של קבוצות טיפול אצטט עופרת. השינויים במינרליזציה של העצם הראו תלות במינון.לאפקט צביעה ותצפית טובים יותר, חשוב להסיר את הפיגמנט המקורי של זחלי דגי הזברה, ולהסיר את הבועות לאחר ההלבנה.

using-alizarin-red-staining-to-detect-chemically-induced-bone-loss

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרטון זה מדגים טכניקת צביעה לזיהוי מידת מינרליזציה או שקיעת סידן באוסטאובלסטים ראשוניים בתרבית באמצעות צבע אדום אליזרין.

צביעה אדומה של אליזרין: טכניקה לדמיין מינרליזציה על ידי אוסטאובלסטים בתרבית

בסרטון זה אנו מתארים שיטה לזיהוי משקעי סידן המופרשים על ידי אוסטאובלסטים באמצעות צבע אניוני, Alizarin Red S. האוסטאובלסטים המתורבתים מוכתמים תחילה ולאחר מכן מחזירים את הצבע לצורך כימות קולורימטרי של משקעי סידן או מידת מינרליזציה של אוסטאובלסט.

בדיקת מינרליזציה חוץ גופית: שיטה קולורימטרית לכימות משקעי סידן אוסטאובלסטים על תחליף שתל עצם על ידי צביעה ומיצוי של Alizarin Red S

מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא את העובר / זחלים, פיתחנו assay כמותיים לרוחב שורת משובי שניתן ליישם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. Assay מעורב רזולוציה בneuromast 1) ו 2) רמות תא שיער בודד.

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

במחקר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לביצוע ניתוח צבע כחול של אוונס (EBD) על זחלי דג הזברה.  טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לאפיון שלמות שרירי השלד ותיחום מודלים של דג זברה של ניוון שרירים, והיא שיטה רבת ערך לפיתוח טיפולים חדשים.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

דגי מעבדה קטנים הפכו למודלים פופולריים לחקר עצמות על המנגנונים העומדים בבסיס הפרעות בעצמות אנושיות ולסינון תרופות מווסתות עצם. בדוח זה, אנו מתארים פרוטוקול להערכת ההשפעה של אלנדרונאט על תאי עצם בזחלי מדקה עם נגעים אוסטאופורוטיים.

ותרופות טיפול<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של אוסטאובלסטים-osteoclast אינטראקציות במודל אוסטאופורוזיס Medaka דגים

המטרה של פרוטוקול זה היא לשנות את penetrance של פנוטיפים קטלני השלד מוטציה בדג זברה באמצעות ברירה מלאכותית. מוטציות קטלני זין לבגרות וגדלתי עצמם, לכן פרוטוקול זה מתאר שיטת מעקב ובחירה penetrance לאורך הדורות מרובים על-ידי רומא בדיקות.

הסטה דג זברה קטלני השלד Penetrance מוטציה על ידי רומא בדיקות

כאן נתאר 3 מודלים פציעה דג זברה מבוגרים, שלהם להשתמש בשילוב עם טיפול תרופות לדיכוי המערכת החיסונית. אנו מספקים הדרכה על הדמיה של התחדשות הרקמות ועל גילוי מינרליזציה עצם המצוי בו.

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

פרוטוקול זה מתאר את הקציר וההדמיה של קשקשים אלסמואידים של דגי זברה במהלך התחדשות in vivo . בנוסף, תרבות ex vivo של קשקשים אלה עד 7 ימים לאחר הקציר מוצג.

התחדשות סולם דגי זברה בתרבות הקשקשים של טוטו ואקס ויוו

פרוטוקול זה מציע שיטה לחקר דינמיקה תאית באמצעות טכניקה פשוטה של תרבית חוץ גופית . הוא מספק הזדמנות לחוקרי דגי זברה ולמחנכים לחקור תהליכים תאיים, כגון אלה הקשורים להומאוסטזיס עצם ולביולוגיה בסיסית של התא, על ידי הדמיה של גרעינים פלואורסצנטיים ותאים אפופטוטיים בתוך הקשקשים.

טכניקת תרבית חוץ גופית לחקר דינמיקה תאית בסקאלות דגי זברה

פרוטוקול זה מתאר גישת אבלציה בלייזר של שני פוטונים המתבצעת בזחלי דגי זברה, המשמשת מודל לחקר התחדשות העצם והשפעות התגובה החיסונית לאבלציה.

אבלציה בתיווך לייזר דו-פוטוני של אוסטאובלסטים בהתפתחות זחלי דגי זברה

הפרוטוקול המתואר כאן מציג הליך פשוט וקל לביצוע לצביעה וניתוח סחוסי גולגולת פנים בזחל דג זברה בן 5 ימים. בעזרתו ניתן לחקור את האנטומיה, הצורה והגודל של מבנים אלה בתנאי התפתחות שונים.

דיסקציה של רקמות הגולגולת של דג הזברה לאחר צביעה בכחול אלציאני

למדו כיצד לזהות רעילות בעצם בזחלי דגי זברה באמצעות צביעת אליזרין אדום. השיטה מאפשרת תיעוד קבוע של שינויים שלדיים ומאפשרת השוואה בין דגימות לחקר השפעות רעילות על עצם.

שימוש בכתמים אדומים של אליזרין לאיתור אובדן עצם הנגרם כימית בזחלי דגי זברה

גלה סרטונים נוספים