Name: ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי Metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: למדו ביטוי חיידקי וטיהור של דומיין קטליטי MMP-3 באמצעות כרומטוגרפיית זיקה. שיטה זו מייצרת חלבון פעיל ב-E. coli לפיתוח תרפיות מעכבות מטריקס מטלופרוטאינזות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לד"ר אווט רדיסקי ואלכסנדרה הוקלה במרפאת מאיו בג'קסונוויל, פלורידה, על כך שסיפקו את הפלסמיד pET-3a-pro-MMP-3cd כתבנית לשיבוט הגן Hisx6pro-MMP-3cd, ואת הערותיהם, יחד עם ד"ר פול הארטלי ממרכז הגנומיקה של נבאדה באוניברסיטת נבאדה, רינו, לרצף DNA. המחברים רוצים גם להודות לקסנדרה הרגנרדר על שעזרה עם חלק מביטוי החלבון. מ.ר.ס. רוצה להודות למענק NIH-P20 GM103650-COBRE אינטגרטיבי למדעי המוח ולפרס מענק הזרעים MICRO MICRO של UNR R&D.

<ol><li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+for+structural+biology+in+HEK+293F+suspension+cells%3A+A+novel+and+accessible+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897(2014).</li>
<li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568(2015).</li>
<li>Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+protein+purification+facilitated+by+a+small+bispecific+affinity+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370(2012).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+production+of+soluble+proteins+from+insoluble+inclusion+bodies+by+a+two-step-denaturing+and+refolding+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method.</a> PLoS One. 6 (7), 22981(2011).</li>
<li>Hu, X., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+functional+matrix+metalloproteinases+by+zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445(2010).</li>
<li>Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+matrix+metalloproteinase+inhibition+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).</li>
<li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+their+inhibitors%3A+Potential+for+the+development+of+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics.</a> Cells. 9 (5), 1313(2020).</li>
<li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li>
<li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+the+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+reveals+that+its+N-+and+C-terminal+domains+cooperate+in+matrix+metalloproteinase+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).</li>
<li>Batra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-10+%28MMP-10%29+interaction+with+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+TIMP-1+and+TIMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).</li>
<li>Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K. Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSingh%2C+KK+%22Matrix+Metalloproteases%22">Matrix Metalloproteases</a>. Galea, C. A. , Humana Press. New York, NY. 3-16 (2017).</li>
<li>Manka, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+triple-helical+collagen+cleavage+by+matrix+metalloproteinase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).</li>
<li>Gomis-Ruth, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inhibition+of+the+human+matrix+metalloproteinase+stromelysin-1+by+TIMP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1.</a> Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).</li>
<li>Shirian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converting+a+broad+matrix+metalloproteinase+family+inhibitor+into+a+specific+inhibitor+of+MMP-9+and+MMP-14%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14.</a> FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+histidine-tagged+catalytic+domain+of+MMP-13+in+one+step+using+affinity+column+and+renaturation+of+it+with+histidine+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography+%26+Related+Technologies%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag.</a> Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).</li>
<li>Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+and+general+expression+platform+for+the+production+of+secreted+proteins+from+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041(2012).</li>
<li>McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+fusion+construct+enables+high-yield+production+of+soluble%2C+active+matrix+metalloproteinase-8+%28MMP-8%29+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli.</a> Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).</li>
<li>Maity, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GST-His+purification%3A+A+two-step+affinity+purification+protocol+yielding+full-length+purified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320(2013).</li>
<li>Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+benefits+of+protein+co-expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431(2015).</li>
<li>Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HeLa+based+cell+free+expression+systems+for+expression+of+Plasmodium+rhoptry+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772(2015).</li>
<li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+magnetosome+associated+protein+MamA%CE%9441%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamAΔ41.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844(2010).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הייצור בקנה מידה גדול של MMPs מסיסים, אנושיים, רקומביננטיים נשאר משימה מאתגרת. תאי יונקים יכולים לבטא MMPs פונקציונליים בעלויות גבוהות וזמני המתנה ארוכים, ואילו E. coli מייצר במהירות כמויות גבוהות של גופי הכללת MMP שיש לטהר ולטפח מחדש 11,16. תאי R2DP מגדילים באופן משמעותי את התפוקה של גופי הכללת MMP, ומאפשרים תהליך עיבוד מחדש חסכוני ופרודוקטיבי יותר של MMP. עם זאת, E. coli חסר את המכונות הפוסט-טרנסלנציונליות הדרושות לקפל MMPs, ולמרות זנים מהונדס...

רוב החלבונים האוקריוטים המורכבים עוברים שינויים פוסט-טרנסליים מורכבים לאחר ההבעה, הדורשים קיפול חלבונים בסיוע גבוה וגורמים משותפים כדי להיות פונקציונליים1. ייצור כמויות גדולות של חלבון אנושי מסיס בפונדקאי חיידקי נותר אתגר משמעותי בשל עלויות גבוהות והיעדר שיטות ביטוי וטיהור חזקות, אפילו לניסויי מעבדה בקנה מידה קטן יותר2,3. MMPs, אנדופטידסים אנושיים עם משקל מולקולרי גדול, מתבטאים בדרך כלל כגופי הכללה בלתי מסיסים כאשר הם באים לידי ביטוי ב- E. coli. הפקת MMPs אנושיים מסיסים מובילה לעתים קרובות לתהליך solubilization מייגע וגוזל זמן רב4.
ל- MMPs יש תפקידים קריטיים הן בתהליכים פיזיולוגיים והן בתהליכים פתוגניים. MMPs אנושיים הם משפחה של 23 אנדופטידסים אבץ, מסווגים לפי מבנה ומצע ספציפיים, ובאים לידי ביטוי דיפרנציאלי למרות תחום קטליטי שמור מאוד 5,6. MMPs מופרשים כמו זימוגנים לא פעילים, מוסדר באמצעות הפעלה פוסט-טרנסלטית ומעכבים אנדוגני שלהם, מעכבי רקמות של metalloproteinases (TIMPs)7,8,9,10. למרות שהוכרו בתחילה על תפקידם במחזור ECM, MMPs היו מעורבים גם בפיתוח, מורפוגנזה, תיקון רקמות, ושיפוץ8. Dysregulation של MMPs נקשרה באופן בולט לסרטן יחד עם מחלות ניווניות, לב וכלי דם, פיברוטיות, בין מחלות אחרות5,7.
הפיתוח של שיטות ייצור MMP חזקות בקנה מידה גדול הוא קריטי כדי להבטיח את הצלחתם של מחקרים עתידיים של מנגנוני MMP באמצעות בדיקות ביוכימיות ומבוססות תאים. MMPs שונים התבטאו בעבר בחיידקים11, כולל MMPs מתויגים Hisx6, מבלי לשנות את פעילות ה- MMP12,13,14,15. עם זאת, שיטות אלה כוללות צעדים מייגעים וארוכים שעשויים להיות קשים לשכפול.
תאי יונקים יכולים לשמש גם כדי לבטא חלבונים אנושיים רבים ושונים תוך הבטחת השינויים הפוסט-טרנסליים הנכונים16. למרות שמערכת הביטוי של היונקים היא בחירה אידיאלית לייצר חלבונים אנושיים רקומביננטיים עם שינויים נכונים לאחר התרגום, החסרונות העיקריים של שיטה זו הם תשואות נמוכות ראשוניות, מדיה צמיחה יקרה ורגנטים, צירי זמן ארוכים כדי להגיע לקווי ביטוי יציבים, וסיכון לזיהום עם מינים אחרים כגון פטריות או חיידקים2,11 . יתר על כן, ייצור MMP בשורות תאי יונקים מניב זיהומים מחלבונים תאיים הקשורים כגון TIMPs או פיברונקטין11. שלא כמו צמיחת התאים האיטית שנצפתה בתאי יונקים, מערכת הביטוי החיידקית מציעה ייצור חלבון בקנה מידה גדול בפרק זמן קצר יחד עם מדיה פשוטה יותר ודרישות צמיחה. עם זאת, בשל היעדר חלבונים תאיים אחרים הקשורים (כלומר, TIMPs) במערכות ביטוי חיידקי, MMPs פעיל בריכוזים גבוהים יותר כפופים השפלה באמצעות autoproteolysis, וכתוצאה מכך תשואה MMP ירודה17.
מאמר זה מתאר שיטה מפורטת לביטוי חיידקי, טיהור והפעלה של Hisx6-pro-MMP-3cd רקומביננטי באמצעות E. coli כפונדקאי ביטוי בשל סבירותו, פשטותו, והצלחה בהפקת תשואות גבוהות יותר של MMPs2,3,18. מאז E. coli חסר את מכונות קיפול חלבון ועיבוד פוסט-טרנסלנטי הנדרש עבור MMPs רקומביננטי וחלבונים מורכבים אחרים, זנים רבים E. coli תוכננו כדי להתגבר על מגבלות אלה, מה שהופך את E. coli פונדקאי מתאים יותר לביטוי של MMP-3cd אנושי רקומביננטי, 19,20 . לדוגמה, זן R2DP המשמש במחקר זה משפר את הביטוי האוקריוטי על ידי אספקת פלסמיד עמיד בפני כלורמפניקול המכיל קודונים המשמשים לעתים רחוקות E. coli.
כפי שמתואר בפרוטוקול זה, לאחר הבעת יתר של גופי הכללה טהורים יחסית מווקטור pET-3a (איור 1) בתאי R2DP, חלבוני Hisx6-pro-MMP-3 קטליטי (MMP-3cd) מופקים ומנוטרלים4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 היה מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה תג זיקה. לאחר refolding ודיאליזה, pro-MMP-3cd (זימוגן) הופעל על ידי אצטט 4-aminophenylmercuric (APMA), וניתוח SDS-PAGE משמש להערכת התשואות ואת הצורך בטיהור נוסף5,21. פרוטוקול זה מתאר ביטוי, טיהור והפעלה של MMP-3cd מסיס כדוגמה. עם זאת, הוא עשוי לשמש גם כמדריך לביטוי של MMPs ופרוטאזים אנושיים אחרים עם ביטוי דומה, ומנגנוני הפעלה (איור 2). עבור חלבונים אחרים שאינם MMP-3cd, הקורא מומלץ לקבוע קומפוזיציות חיץ אופטימליות ושיטות עבור חלבון היעד שלהם לפני ניסיון פרוטוקול זה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig01.jpg"> איור 1: מפת פלסמיד של הפלסמיד pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmid. וקטור pET-3a כולל גן עמידות אמפיצילין. רצף תגים מסוג N-terminal Hisx6 משוכפל לתוך וקטור מבוסס pET-3a, כולל פרו-MMP-3cd, כדי להניב את המבנה pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd תחת שליטה של מקדם T7 בין אתרי ההגבלה BamHI ו- NdeI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig02.jpg"> איור 2: ביטוי חיידקי של פלסמיד פרו-MMP-3cd, טיהור, שכפול מחדש והפעלה. 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd פלסמיד הפך לתאי BL21(DE3) או R2DP. 1.2: ביטוי חלבון פרו-MMP-3cd הושרה באמצעות IPTG. 1.3: תמוגה כימית ו sonication משמשים כדי לחלץ Hisx6-pro-MMP-3cd חלבונים כי הם בעיקר מסיסים ונמצאים בגופי ההכללה. אוריאה שימשה כדי denature ו solubilize חלבון מגופי הכללה. 2.1. חלבון Hisx6-pro-MMP-3cd מטוהר באמצעות טיהור כרומטוגרפיה של זיקה. 3. Hisx6-pro-MMP-3cd המנוטרל נפרש לאט במהלך דיאליזה באמצעות הסרה הדרגתית של אוריאה מהחוצץ. 4. לבסוף, חלבון MMP-3cd משוחזר הופעל באמצעות APMA על ידי הסרת תחום N-מסוף פרו פפטיד. APMA מוסר מאוחר יותר מהפתרון באמצעות התפלה. המספרים תואמים למקטעי פרוטוקול המתארים שלבים אלה. קיצורים: MMP-3cd = מטריקס metalloproteinase-3 תחום קטליטי; APMA = אצטט 4-אמינופניל-מרקורי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 ומיקרו; מסנן סטרילי m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLGP033RS</td><td>משמש להסרת כמה מזהמים מתמצית החלבון לפני הטיהור, ומניעת סתימת עמוד Ni-NTA צלוחיות</td></tr><tr><td>1 ליטר Erlenmeyer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S76106F</td><td>בקבוקי</td></tr><tr><td>זכוכית 1 ליטר</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td>n/a</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרופוגה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-002</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>n/a</td></tr><tr><td>18 גרם, 1 אינץ' מחט משופעת</td><td>אמזון</td><td>B07S7VBHM2</td><td>בשימוש בשילוב עם קלטת הדיאליזה</td></tr><tr><td>2 מ"ל עמוד התפלה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89890</td><td>מסיר APMA לאחר הפעלה</td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)חומצה אתנסולפונית (MES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAA1610422</td> n<td>/a</td></tr><tr><td>250 מ"ל כריות בקבוקים חרוטיות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-538-53A</td><td>ייצוב בקבוקים חרוטיים במהלך צנטריפוגה בנפח גדול</td></tr><tr><td>250 מ"ל בקבוקים חרוטיים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-538-53</td><td>n/a</td></tr><tr><td>400 מ"ל תא מעורבב</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UFSC40001</td><td>מרכז מחדש נפח גדול בהרבה מיחידת המסנן הצנטריפוגלי. תאי Rosetta2(DE3)pLysS מייצרים כמויות גבוהות של חלבון שעשויים לחרוג ממגבלת 15 מ"ל של יחידת המסנן הצנטריפוגלי</td></tr><tr><td>4-aminophenylmercuric acetate (APMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9563-5G</td><td>מפעיל MMP-3 על ידי פיצול מזרק הפרופפטיד</td></tr><tr><td>5 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0829167</td><td>משמש בשילוב עם קלטת הדיאליזה</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>משמש לאחסון בשלבי טיהור רבים</td></tr><tr><td>צינור ריכוז מחדש של 50 מ"ל</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>UFC901024D</td><td>משמש לריכוז מחדש של דגימות חלבון לאחר דיאליזה או הסרת מזהמים</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td>מרכיב חיץ הממצק את מדיית LB חיטוי בעת קירור</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>אנטיביוטיקה בשימוש עם וקטור pET3a; בשימוש ב-100 ומיקרו; גרם/מ"ל במדיה LB</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td>אנזים הגבלה לשימוש עם וקטור pET3a</td></tr><tr><td>סידן כלורי (CaCl2)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>600-30-23</td><td>יון הסידן מייצב את מבנה MMP</td></tr><tr><td>מפזרי תאים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-189-7544</td><td>ניתן להשתמש בו כדי להפיץ תאים על פני צלחת פטרי לאחר טרנספורמציה</td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>22-055-125GM</td><td>אנטיביוטיקה בשימוש עם וקטור pET3a; בשימוש ב-34 ומיקרו; גרם/מ"ל במדיה LB</td></tr><tr><td>מאגר דיאליזה 1</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ CaCl2, 1 ומיקרו; M ZnCl2, 4 M אוריאה.</td></tr><tr><td>מאגר דיאליזה 2</td><td>n/a</td><td>n/a 20</td><td>מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ CaCl2, 1 ומיקרו; M ZnCl2, 2 M אוריאה.</td></tr><tr><td>מאגר דיאליזה 3</td><td>n/a</td><td>n/a 20</td><td>מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ CaCl2 , 1 ומיקרו; M ZnCl2.</td></tr><tr><td>מהדקי דיאליזה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>68011</td><td>בשימוש בשילוב עם צינורות דיאליזה מעור נחש</td></tr><tr><td>צינורות דיאליזה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88243</td><td>שיטת דיאליזה אלטרנטיבית המחזיקה נפחי דגימה גדולים בהרבה, אך עם סיכון גבוה יותר לאובדן דגימה</td></tr><tr><td>מאגר עיכול</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>מאגר המשמש לעיכול וקטור pET3a</td></tr><tr><td>קוביות חד פעמיות</td><td>Thermo Fisher מדעי</td><td>21-200-257</td><td>משמש למדידת תרבית חיידקים OD במהלך צמיחה וביטוי</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D107125G</td><td>מסייע בדנטורציה של חלבון על ידי הפחתת כל קשרי דיסולפיד</td></tr><tr><td>תערובת הרכבת DNA</td><td>NEB</td><td>E2621S</td><td>משמש לקשירת מוצר ה-PCR Hisx6-pro-MMP-3cd וקטור pET3a מעוכל</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>אנדונוקלאז לפירוק מזהמי DNA שליליים שעלולים להשפיע מאוחר יותר על טיהור החלבון</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A995-4</td><td>n/a</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J15694-AE</td><td>משמש בדנטורציה. מונע חמצון והיווצרות לאחר מכן של קשרי דיסולפיד</td></tr><tr><td>ערכת התאוששות ג'ל</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>מבודד ומטהר DNA מג'ל אגרוז</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>G33-500</td><td>משמש להכנת מלאי גליצרול, המוקפאים בטמפרטורה של -80 מעלות; </td></tr><tr><td>C עמודת זרימת כבידה</td><td>BioRad</td><td>7321010</td><td>משמש לטיהור Ni-NTA של חלבונים מתויגים רקומביננטית</td></tr><tr><td>תאים בעלי יעילות טרנספורמציה גבוהה</td><td>NEB</td><td>C2987</td><td>תאים בעלי יעילות טרנספורמציה גבוהה עם סיכוי גדול יותר להצלחה לשיבוט ה-N-terminal His-tag למבנה pET3a-pro-MMP-3cd</td></tr><tr><td>HT Elution Buffer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 50 מ"מ NaCl, 6 מ"מ אוריאה, 250 מ"מ אימידזול. התאם את ה-pH ל-7.4</td></tr><tr><td>HT מאגר שיווי משקל</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 50 מ"מ NaCl, 6 מ' אוריאה. התאם את ה-pH ל-7.4</td></tr><tr><td>HT Regeneration Buffer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM MES, 0.1 M NaCl. התאם את ה-pH ל-5.0</td></tr><tr><td>HT Wash Buffer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 50 מ"מ NaCl, 6 מ"מ אוריאה, 25 מ"מ אימידזול. התאם את ה-pH ל-7.4</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A144C-212</td><td>משמש למאגרי pH</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAA1022122</td><td>מחקה את קבוצת הצד של ההיסטידין. משמש להפרדת חלבונים לא קושרים באופן ספציפי מחלבון המטרה המתויג</td></tr><tr><td>שלו Inclusion Body Buffer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. התאם את ה-pH ל-8.0</td></tr><tr><td>Isopropyl-&szlig;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERR0392</td><td>מגיב המשרה ביטוי גן מטרה ב-pET3a. הכינו 0.5 מ"ל 1 מ ', סננו, עקרו ואחסנו ב -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>LB Amp CamR מדיה</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>למזיגה לבקבוק סטרירי של 1 ליטר או בקבוק 1 ליטר. עבור 1 ליטר, הוסף 25 גרם מרק LB. עיקור על ידי חיטוי. לאחר שהתקרר מתחת ל-50 מעלות; C, הוסף אמפיצילין ל-100 ומיקרו; גרם/מ"ל וכלורמפניקול עד 34 ומיקרו; g/mL</td></tr><tr><td>LB Amp CamR צלחות</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>למזיגה לצלחות פטרי סטריליות. יוצקים עד שמכסה צלחת הפטרי מכוסה לחלוטין. 1 ליטר מדיה מניב 40-60 לוחות. עבור 1 ליטר: 25 גרם מרק LB, 16 גרם אגר. עיקור על ידי חיטוי. לאחר שהתקרר מתחת ל-50 מעלות; C, הוסף אמפיצילין ל-100 ומיקרו; גרם/מ"ל וכלורמפניקול עד 34 ומיקרו; g/mL</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>מעורבב מראש עם טריפטון, תמצית שמרים ונתרן כלורי</td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td>n</td><td>/a n/a</td><td>50 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 1 מ"מ EDTA, 100 מ"מ NaCl, 0.133 גרם/מ"ל ליזוזים, 0.49% v/v Triton X-100. התאם את ה-pH ל-8.0</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>MP Biomedicals</td><td>195303</td><td>משמש במיצוי חלבון. אנזים המבצע ליזה של דפנות תא חיידקים</td></tr><tr><td>ערכת Miniprep</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>אם מצליח, מחלץ את מבנה pET3a-pro-MMP-3cd משנאים</td></tr><tr><td>NdeI</td><td>NEB</td><td>R0111S</td><td>אנזים הגבלה לשימוש עם וקטור pET3a</td></tr><tr><td>שרף Ni-NTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI88221</td><td>משמש לקשירת חלבונים רקומביננטיים המתויגים שלו. ניתן להחליף אינטראקציה חזקה זו עם ריכוזים גבוהים יותר של</td></tr><tr>חומר<td>ניקוי פעילי שטח אימידזול Nonionic</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI28316</td><td>Storage למניעת צבירת MMP. ממזער אינטראקציות בין שאריות הידרופוביות על פני השטח של MMP ומולקולות מים, מבלי לשבש את הפעילות הקטליטית.</td></tr><tr><td>PCR mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>מגיב PCR להכנסת תג N מסוף לתוך pET3a-pro-MMP-3cd</td></tr><tr><td>וקטור pET פלסמיד</td><td>Addgene</td><td>n/a</td><td>וקטור pET3a מציע עמידות לאמפיצילין, ביטוי השראת של גן מטרה וריצוף עם פריימרים T7</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>משמש לציפוי טרנספורמטורים על תאי LB agar media</td></tr><tr><td>R2DP Novagen</td><td></td><td>714033</td><td>נגזרות BL21 עם ביטוי משופר של חלבונים אוקריוטיים. מכיל tRNAs של קודונים שנמצאו נדירים</td></tr><tr><td>במצע גידול</td> e. coli SOC <td>NEB</td><td>B9020S</td><td>מצע גידול לא סלקטיבי לצמיחה מהירה במהלך הטרנספורמציה</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>משמש במאגרים ומסייע ביציבות החלבון</td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>PI89905 חומר ניקוי המשמש למיצוי חלבון. מאגר מסיסות דפנות התא של Lyses</td></tr><tr><td></td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 50 מ"מ NaCl, 10 מ"מ DTT, 6 מ' אוריאה. התאם את ה-pH ל-8.0</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>מאגר נפוץ המשמש בטווח ה-pH הפיזיולוגי. </td></tr><tr><td>חומר ניקוי Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M1122980101</td> רגיש <td>לטמפרטורה המשמש לליזיס תאים</td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>AAJ75826A7</td><td>חומר כאוטרופי ראשון לשיבוש מבנה משני של חלבון</td></tr><tr><td>אבץ כלורי (ZnCl2)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>AAA162810E</td><td>מייצב את מבנה MMP. יון האבץ נמצא באתר הקטליטי של MMP-3</td></tr></tbody></table>

ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

מטריצה metalloproteinases (MMPs) שייכים למשפחה של פרוטאזים מצינזין עם תפקידים מרכזיים מטריצה חוץ תאית (ECM) השפלה ושיפוץ, כמו גם אינטראקציות עם מספר גורמי גדילה וציטוקינים. ביטוי יתר של MMPs ספציפיים אחראי במספר מחלות כגון סרטן, מחלות ניווניות ומחלות לב וכלי דם. MMPs היו מרכז תשומת הלב לאחרונה כמטרות לפתח טיפולית שיכולה לטפל במחלות בקורלציה MMP overexpression.
כדי ללמוד את מנגנון ה- MMP בפתרון, נדרשות שיטות ביטוי וטיהור חלבונים רקומביננטיות מקלות וחזקות יותר לייצור MMPs פעילים ומסיסים יותר. עם זאת, התחום הקטליטי של רוב MMPs לא יכול לבוא לידי ביטוי Escherichia coli (E. coli) בצורה מסיסת בשל חוסר מכונות פוסט-טרנסלטיות, בעוד מערכות ביטוי יונקים הם בדרך כלל יקרים ויש להם תשואות נמוכות יותר. גופי הכללת MMP חייבים לעבור את התהליך המייגע והמייגע של טיהור נרחב ושיפוץ מחדש, מה שמפחית באופן משמעותי את התשואה של MMPs בקונפורמציה מקומית. מאמר זה מציג פרוטוקול באמצעות Rosetta2(DE3)pLysS (להלן R2DP) תאים כדי לייצר מטריצה metalloproteinase-3 תחום קטליטי (MMP-3cd), המכיל N-מסוף His-tag ואחריו pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) לשימוש בטיהור זיקה. תאי R2DP משפרים את הביטוי של חלבונים אאוקריוטים באמצעות פלסמיד עמיד בפני כלורמפניקול המכיל קודונים נדירים בדרך כלל במערכות ביטוי חיידקיות. בהשוואה לקו התא המסורתי המועדף על ביטוי חלבון רקומביננטי, BL21(DE3), טיהור באמצעות זן חדש זה שיפר את התשואה של Hisx6-pro-MMP-3cd מטוהר. לאחר ההפעלה וההתפלה, התחום המקצועי נבקע יחד עם ה- N-terminal His-tag, ומספק MMP-3cd פעיל לשימוש מיידי באינספור יישומי הפריה חוץ גופית . שיטה זו אינה דורשת ציוד יקר או חלבוני היתוך מורכבים ומתארת ייצור מהיר של MMPs אנושיים רקומביננטיים בחיידקים.

בעת הפעלת דגימות על SDS-PAGE, כי החלבון מתבטא בצורה של גופי הכללה מסיסים, שברי lysed ו sonicated צריך להכיל מעט מאוד תמצית Hisx6-pro-MMP-3cd, כמו החלבון עדיין לא היה resolubilized ב אוריאה. איור 3 משווה את שברי הארכת הטיהור של His-tag של Hisx6-pro-MMP-3cd מתאי BL21(DE3) ותאי R2DP. שברי Elution אוגדו בנפרד עבור תאי BL21(DE3) ו- R2DP לפני הדיאליזה. שברים מכל שלב הופעלו לאחר שהחלבונים הותזו (איור 4). כל דגימות ה-Hisx6-pro-MMP-3cd מציגות רצועה במהירות של כ-30 kDa, ו...

טיהור התג שלו, דיאליזה, והפעלה מועסקים כדי להגדיל את התשואות של מסיס, מטריצה פעילה metalloproteinase-3 ביטוי חלבון תחום קטליטי בחיידקים. שברי חלבון מנותחים באמצעות ג'ל SDS-PAGE.

ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי Metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

פרוטוקול מפורט זה מתאר שיטה יעילה וחסכונית מאוד של ביטוי חיידקי עבור תחום קטליטי MMP-3 רקומביננטי ב- E.Coli, אשר ניתן ליישם על מטרות טיפוליות MMP אחרות. E.coli חסר מערכת קיפול חלבון מורכבת ועיבוד לאחר התרגום. שיטה זו משתמשת בזן התא R2DP כדי לשפר את ביטוי החלבון האוקריוטי ב- E.coli.ייצור יתר של MMPs ספציפי מוביל למספר מחלות כמו סרטן, מחלות לב וכלי דם, ומחלות ניווניות. MMPs מסיסים פעילים נדרשים לפיתוח של טיפולים מעכבי MMP. לחסן מושבה מבודדת אחת של pET התג שלו פרו MMP-3 קטליטי תחום טרנספורמטי טרנספורמטי מ צלחת עמידה אמפיצילין כלורמפניקול LB בחמישה מיליליטרים של LB אמפיצילין אמפיצילין כלורמפניקול עמיד מדיה ב 37 מעלות צלזיוס.שמור aliquots מכל תרבות ולהכין 40% מניות גליצרול. לחסן בקבוקון ליטר אחד המכיל 500 מיליליטר של LB אמפיצילין כלורמפניקול עמיד בינוני לצפיפות אופטית של 0.05 עד 0.1 ב 600 ננומטר עם תרבות הלילה. למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר בכמה נקודות זמן, בדרך כלל במשך שלוש עד ארבע שעות עד שהוא נופל בין 0.4 ל 0.6.לגרום לתרבויות עם מניית IPTG טוחנת אחת לריכוז סופי של מילימטר אחד. דגירה בשייקר 37 מעלות במשך שלוש עד ארבע שעות נוספות. צנטריפוגה התאים בבקבוקים חרוטיים 250 מיליליטר ב 13, 000 G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, חוזר עד התרביות הם גלולה לחלוטין.הוסף שלושה מיליליטרים של מאגר תמוגה לגרם של גלולה ו resuspend את הכדור על ידי מערבולת או pipetting. הוסף 1.25 מיליליטר של 10% משקל לפי נפח נתרן deoxycholate לליטר אחד של תרבות. הוסף 10 מיקרוליטרים של DNase I לליטר אחד של תרבות.יש לנער בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ב-150 סל"ד. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 13, 000 G וארבע מעלות צלזיוס. זרוק את הסופר-טבעי.Resuspend את הכדור ב 100 מיליליטר לכל ליטר תרבות של חיץ גוף הכללה על ידי צנרת למעלה ולמטה. שמור את הדגימות על קרח במהלך sonication כדי למנוע התחממות יתר. Sonicate כל מדגם במשך שישה מחזורים של 15 שניות, פלט של חמש ו 50% דופק.צנטריפוגה הדגימות במשך 10 דקות ב 13, 000 G וארבע מעלות צלזיוס. תבדוק את הכדור. אם הכדור הוא קומפקטי, להשליך את supernatant.תנצל מחדש כל גלולה מתרבות של ליטר אחד וחמישה מיליליטר של חיץ סולבילגיזציה. דגירה במשך 30 דקות לפחות על קרח כדי לאפשר לחלבונים להתייבש. צנטריפוגה התאים במשך 10 דקות ב 13, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס.אם הכדור נוצר לאחר צנטריפוגה, לשפוך את supernatant לתוך צינור חרוט נפרד 50 מיליליטר. resuspend את הכדור בעוד חמישה מיליליטרים של חיץ solubilization לליטר אחד של תרבות על ידי צנרת למעלה ולמטה. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 13, 000 G וארבע מעלות צלזיוס.הבא, למשוך את supernatants. להשליך את הכדור או לאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עבור sonication נוסף. ריק מול מאגר שטיפה HT ולתעד את A280 של שבר הכביסה הראשון.חזור על הפעולה עם שברים אחרים עד ש- A280 מתקרב לקו הבסיס. מיד לברוח חלבונים מתויגים שלו על ידי הוספת חמישה מיליליטרים של חוצץ HT elution. לאסוף את הזרימה דרך ב 0.5 עד שברי מיליליטר אחד בצינורות microfuge שכותרתו HT elution.מדוד את A280 של שבר ההמלטה. אם A280 גדול מ- 0.3 מיליגרם למיליליטר, דלל את השבר באמצעות מאגר שיווי משקל HT. הטביעו את שברי ה-MMP המנופחים בצינורות דיאליזה בליטר אחד של מאגר דיאליזה אחד וערבבו את הצינורות ותכולתם על מערבוב מגנטי במשך שמונה שעות לפחות בארבע מעלות צלזיוס.מעבירים לליטר אחד של מאגר דיאליזה 2 ומערבבים את הצינורות ותכולתם על מערבוב מגנטי במשך שמונה שעות לפחות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מעבירים לליטר אחד של מאגר דיאליזה שלוש ומערבבים את הצינורות ותכולתם על מערבבה מגנטית במשך לא פחות משמונה שעות בארבע מעלות צלזיוס. העבר את הדגימה לגורם מכיל מתאים ותייג אותם כ- MMP שעבר חיוג.תבדוק את הצינור כדי למצוא משקעים. לכל מיליליטר aliquot של מיליגרם אחד למיליליטר MMP, להוסיף 50 microliters של APMA 20 מילימולרי כדי להגיע לריכוז APMA הסופי של מילימולר אחד. אם נוצר משקעים, צנטריפוגה במהירות המרבית במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.אחסן את supernatant בצינור microfuge 1.5 מיליליטר שכותרתו MMP פעיל. השלך את המשקעים לתוך מיכל מסומן עבור פסולת APMA. SDS-PAGE הופעל כדי להשוות את שברי ההמלטה של טיהור התג שלו של התחום הקטליטי Pro MMP-3 של התג שלו מתאי BL21 DE3 בתאי R2DP.שמונת שברי ההמלטה הראשונים של התחום הקטליטי MMP המתויג שלו ותאי BL21 DE3 הראו חלבון קטן יותר מאלה שבתחום הקטליטי MMP המתויג בתאי R2DP. השברים המושרים, המרוכזים, המרוכזים, המופעלים והמותפלים של תאי תקליטור MMP3 ו- R2DP מוצגים. עם ההפעלה, המשקל המולקולרי של רצועת התקליטורים MMP-3 המופעלת הוא כ -20 קילודלטון, בניגוד לזימוגן המתויג שלו שנשאר בסביבות 30 קילודלטון.כאשר צנטריפוגת תאים lysates, כדורי לא יכול להיות קומפקטי. כאשר זה קורה, sonicate יותר צנטריפוגה ארוכה יותר. בעת שחזור החלבון, משקעים עלולים להתרחש.להמיס אותו במאגר solubilization ולחזור על התהליך. ההליך המתואר כאן מספק שיטה מפורטת לביטוי מסיס של MMPs אנושיים פעילים שניתן להשתמש בהם בסופו של דבר כדי להבין את המנגנון המולקולרי של פעילות אנזימטית MMP. שיטות חלופיות לטיהור חלבונים כגון FPLC יכולות להתבצע לחלבוני MMP מטוהרים.

bacterial-expression-purification-human-matrix-metalloproteinase-3

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אמא הוא חלבון ייחודי הקשור Magnetosome אשר הוצגה להיות מעורב ההפעלה magnetosome. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול טיהור של אמא המחיקה מוטציה (MamAΔ41)...

טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41

הרומן יעילים שני שלבים זיקה כרומטוגרפיה פרוטוקול פותחה מתואר בפירוט. השיטה מבוססת על תג טיהור קטן עם שתי זיקות מובנה ישים למגוון רחב של חלבונים יעד עם מאפיינים שונים.

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

מקור: בקר, ב. ואחרים. בדיקת דיווח פשוטה מבוססת פלואורסצנציה לזיהוי רכיבים תאיים הנדרשים להעברת שרשרת רעל ריצין A (RTA) בשמרים. J. Vis. Exp. (2017).הסרטון הזה מדגים את טיהור חלבון רקומביננטי עם תגית פוליהיסטידין באמצעות כרומטוגרפיית אפיניטי מבוססת ניקל. הוא מפרט שלבים מרכזיים, כולל פירוק חיידקים באמצעות סוניקציה, הבהרה וסינון של הליזאט, וקשירה סלקטיבית והשחרור של החלבון המטרה באמצעות אימידזול.

 טכניקת כרומטוגרפיית זיקה לטיהור חלבון חיידקי רקומביננטי

סרטון זה מדגים טכניקה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים מתרבית תרבית המתקבלת מתרבית תאים המייצרת נוגדנים. התהליך כולל שימוש במטריצה של חרוזי אגרוז מוצלבים עם חלבון A מצומד, אשר משתק את הנוגדנים בסופרנאטנט שעל החרוזים, ומאפשר הפרדה יעילה ממזהמים. על ידי החלת חיץ אלוציה עם pH נמוך, האינטראקציה בין חלבון לנוגדן A מתרופפת, מה שמקל על איסוף שברים המכילים נוגדנים.

טכניקת כרומטוגרפיית זיקה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים

פרוטוקול זה מתאר הליך להעשרת חלבוני ECM מרקמות או גידולים ודה-גליקוזילציה ועיכול התכשירים המועשרים ב-ECM לפפטידים כדי לנתח את הרכב החלבון שלהם על ידי ספקטרומטריית מסה.

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

זהו פרוטוקול מהיר וחסכוני לייצור חלבוני יונקים מופרשים ומסוכררים וטיהור חד-שלבי לאחר מכן עם תפוקות מספיקות של חלבון הומוגני לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומחקרים ביופיזיקליים אחרים.

ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

כאן, אנו מציגים שיטה להביע ולטהר S100A12 (calgranulin C). אנו מתארים פרוטוקול למדידת פעילות אנטי מיקרוביאלית שלו נגד הפתוגן האנושי H. pylori .

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

הטיהור של תעלות יונים היא לעתים קרובות מאתגרת, אבל ברגע מושגת, זה יכול העלול לאפשר במבחנה חקירות פונקציות ומבנים של הערוצים. כאן, אנו מתארים את נהלי stepwise הביטוי ואת טיהור bestrophin בתרבית של חלבונים, משפחה של Ca2 +-הפעלת ערוצי Cl– .

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

כאן נציג של פרוטוקול benchtop ותשמרו זיקה מתכת כרומטוגרפיה לטיהור ודה למפת עוקבות polyhistidine מתויג, ברזל heme שאינו מחייב dioxygenase מתאים המעבדה הוראה לתואר ראשון.

Benchtop. מרותק למיטה כרומטוגרפיית זיקה מתכת, שיחזור ותייגת וזמינותו של Polyhistidine Metalloenzyme עבור המעבדה לתואר ראשון

. הנה, פרוטוקול מוצג לבצע, culturing בתאי poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized עם fluorogenic מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (MMP)-פפטיד מתכלה. MMP הסלולר ופעילות מטבולית נמדדים ישירות מן התרבויות הידרוג שימוש בקורא microplate סטנדרטיים.

מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד

פרוטוקול זה מפרט את ההליכים לייצור רקומביננטי של ההולואנזים מיוזין-7a האנושי באמצעות מערכת MultiBac Baculovirus ולחקר תנועתיותו באמצעות בדיקת גלישה מותאמת אישית של חוטי להט במבחנה.

טיהור מבוסס מערכת MultiBac ואפיון ביופיזי של מיוזין-7a אנושי

למדו ביטוי חיידקי וטיהור של דומיין קטליטי MMP-3 באמצעות כרומטוגרפיית זיקה. שיטה זו מייצרת חלבון פעיל ב-E. coli לפיתוח תרפיות מעכבות מטריקס מטלופרוטאינזות.

ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי Metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה

גלה סרטונים נוספים