שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה של שינוי גנטי במבחנה למחקר המולקולרי של מסלול האיתות התלוי בסיליום העיקרי בתרבויות המבשרות העיקריות של תאי הגרגיר. בשל העלות, הכדאיות הנמוכה והיעילות הלקויה של שיטת הטרנספקטיה הנוכחית, אנו מציגים טכניקת אלקטרופורציה פשוטה, חסכונית ויעילה לחקירת מסלול איתות תלוי טיליום בתרבויות GCP ראשוניות. כדי להתחיל, להוסיף 0.5 מיליליטר של מדיום תרבות לתוך כל באר של צלחת התרבות 24-well המכילה תלושי כיסוי מצופים, ולשמור אותו חם ב 37 מעלות צלזיוס בחממה דו תחמוצת הפחמן.

פיפטה את המספר הנדרש של תאים לתוך צינור סטרילי 1.5 מיליליטר microcentrifuge ולהסתובב ב 200x G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השלך את supernatant ו resuspend את גלולה התא ב 200 מיקרוליטרים של Opti-MEM. חזור על הליך זה פעמיים כדי להבטיח שאין מדיום תרבות שיורית נמצא בצינור.

הגדר את הפרמטרים של אלקטרופורציה כמפורט. פיפטה תגובת electroporation בעדינות לערבב היטב, ולהשתמש קצה פיפטה P200 ארוך כדי להעביר נפח מדויק של 100 מיקרוליטר של התערובת לתוך קובט פער שני מילימטר. ברגע שהקובט נמצא בתוך תא הקובט, לחץ על כפתור האומגה של האלקטרופורטור ושים לב לערך העכבה על ידי היצמדות לנפח מדויק של 100 מיקרוליטרים.

טווח ערך העכבה צריך להיות כ 30 ו 35. לחץ על לחצן התחל כדי ליזום את הדופק. הקלט את הערכים הנוכחיים הנמדדים ב- Joules המוצגים במסגרת הקריאה.

הסר את הקובט מהתא. מיד להוסיף 100 microliters של מדיום תרבות שחומם מראש לתוך cuvette ו resuspended אותו על ידי צנרת למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים. העבר מיד את ההשעיה התאית ללוחית 24 הבאר שהוכנה בעבר.

לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס בחממה דו תחמוצת הפחמן. שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ הפלואורסצנטיות למחרת. במחקר הנוכחי, יעילות האלקטרופורציה של קבוצות שטופלו ב- DMSO ו- SAG נראתה דומה.

חיסון של סמן הסיליום הראשי Arl13b מדגים כי שיעור ההשתייכות של GCP בדיו-2 של התרבות הן ברכב והן בקבוצות שטופלו ב- SAG. שיעור ההשתייכות ממחיש את אחוז ה-Pax6 המבטאים GCPs הנושאים סיליום ראשי על פני התא ב-div-2 לאחר אלקטרופורציה. האיור מראה עלייה משמעותית בלוקליזציה EGFP מוחלקת על cilium axoneme העיקרי של Px6 ביטוי GCP תאים ב 24 שעות לאחר טיפול SAG, המציין הפעלה עמוקה של מסלול איתות קיפוד תלוי cilium העיקרי.

על מנת להשיג יעילות אלקטרופורציה גבוהה יותר, יש להבטיח טוהר גבוה של הפלסמיד המשמש, ואין מדיה תרבית שאריות נמצא בתערובת אלקטרופורציה פלסמיד. פרוטוקול זה צריך להיות ישים ישירות ומועיל לניסויים בשינוי גנטי במבחנה על תרבויות ראשוניות וסוגי תאים שקשה להעביר, כולל נוירונים ותאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם.