מניפולציה תת-תאית של מיקרוטובול ציטוספקלטון בעובר עכבר קדם-ההשתלה החי באמצעות פוטוסטטינים
30 בנובמבר 2021
מעכבי microtubule טיפוסי, בשימוש נרחב במחקר בסיסי ויישום, יש השפעות מרחיקות לכת על תאים. לאחרונה, פוטוסטטינים הופיעו כסוג של מעכבי microtubule photowitchable, מסוגל מיידית, הפיך, מניפולציה מדויקת spatiotemporally של microtubules. פרוטוקול שלב אחר שלב זה מפרט את היישום של photostatins בעובר עכבר טרום השתלה חי 3D.
פרוטוקול זה הוא הראשון מסוגו ליישם photostatins על עובר עכבר טרום ההשתלה חי, ולשקול שימושים לשימוש בסמים הניתנים למיתוג אור במערכות פיזיולוגיות 3D אחרות. פוטוסטטינים הניתנים להחלפה באור מאפשרים מניפולציה של צמיחת מיקרוטובולה, במרחב ובזמן, ולהמיר בחזרה למצב כבוי. חשיפה לא מכוונת של פוטוסטטינים לאור כחול, לפני הניסוי, יכולה להפעיל אותם בטרם עת.
לכן אנו ממליצים לעבוד בחושך מוחלט, או בתנאי אור אדום, בכל עת בעת הכנת הדגימות שלך. בתנאים כהים קפדניים, באמצעות אור אדום בלבד לתאורה, להתחיל לעשות מלאי ופתרון עבודה ביניים של PST-1P במים אולטרה-פור. כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט.
לאחר מכן, לדלל PST-1P ב KSOM טרי כדי להשיג את הריכוז הסופי של 40 M.To להכין את שקופית החדר להדמיה חיה, להוסיף 10 L של PST-1P מטופל KSOM למרכז של באר אחת, כדי ליצור טיפה חצי כדורית. כדי למנוע מהטיפה להתאדות, כסו אותה בשמן מינרלי מספיק. לאחר מכן, לעטוף באופן רופף את צלחת התרבות מוכנה בנייר כסף, או למקם את צלחת התרבות במיכל אטום לא אטום בחממה כדי להבטיח שאין חשיפה לאור.
לאחר העברת העוברים לתוך PST-1P שטופלו KSOM טיפה, להבטיח כי העוברים מקובצים במרכז הטיפה, והתיישבו לתחתית המנה. לאחר הכנת עדשת המטרה של הטבילה, הר את שקופית התא על המיקרוסקופ, בתוך תא סביבתי. מוגדר ב 37 C ו 5%CO2, ובחשיכה מוחלטת, כדי להבטיח את כל PST-1Ps נמצאים בתצורה טרנס לא פעילה, וכי עוברים יכולים לשקוע לתחתית המנה.
השתמש לפיד אור אדום כדי למקם את העדשה האובייקטיבית במגע עם מדיום הטבילה. לאחר מכן, לאתר את הקצה של טיפת המדיום ולמקם את המטרה ישירות מעליו. באמצעות מצב סריקה חיה, ולייזר 561 ננומטר, אתר את העוברים בתוך הטיפה.
השתמש בבקרי במה ובמצב סריקה חיה כדי להגדיר את נקודות ההתחלה והסיום לרכישת ערימת z של העובר כולו. כוונן את הגדרות צריכת החשמל של הלייזר עד למקסימום של 5% בהתאם לאות שלך. והגדר את ההיסט הדיגיטלי למקסימום של 0.900, על פי האות שלך, כדי לייעל את המראה של כוכבי השביט EB3-dTomato.
מזער את רעשי הרקע. כוון את חור הסיכה ל-2 מ'. רזולוציית פיקסלים ב-512 על 512.
וזמן ההשתהות של הפיקסלים הוא 3.15 שניות. ולהגדיר את הזום ל 2x. לרכוש z-מחסנית של העובר כולו עם מרווחי סעיף 1 מ 'כדי להעריך את האזורים של צמיחת microtubule באורגניזם כולו.
לניסויי מעקב אחר כוכבי שביט EB3-dTomato, פתחו את התמונה התלת-ממדית z-stack והגדילו את הזום לשלוש פעמים. ולצייר החזר מלבני סביב האזור התת-תאי הספציפי של עניין. לאחר מכן, לרכוש את הסרט לשגות זמן של מישור z יחיד, באמצעות הפרמטרים שנקבעו, עם מרווח הזמן של 500 אלפיות השנייה.
כדי להפעיל PST-1P, לעבור לייזר 405 ננומטר, ולרכוש עוד זמן לשגות, עם לייזר להגדיר 10% כוח, חור סיכה נפתח מקסימום, רזולוציית פיקסלים של 512 על ידי 512 על 512, זמן השתהות פיקסל של 3.15 שניות, זום של שלוש פעמים, במרווח זמן של 500 ms, ולהגדיר 20 מסגרות לרכישה. מיד לאחר ההפעלה, חזור ללייזר 561 ננומטר, וחזור על הרכישה, כפי שהוכח בעבר, כדי לאשר את אובדן כוכבי השביט EB3-dTomato לאחר ההפעלה של PST-1P. עכשיו, כדי להפוך PST-1P בחזרה למצב הטרנס לא פעיל שלה, לעסוק לייזר 514 ננומטר, ולרכוש עוד זמן לשגות עם פרמטרים מוגדרים.
כדי לדמיין את ההתאוששות של כוכבי שביט EB3-dTomato, חזור ללייזר 561 ננומטר וחזור על הרכישה. בעוברי בקרה לא מטופלים, לפני הארה עם לייזר 405 ננומטר, אות EB3-dTomato היה גבוה בתוך כל הציטופלסמה של התא, למעט האזור הגרעיני. תאורת פוסט, שינויים באות לא זוהו.
מה שמצביע על כך שלייזר 405 ננומטר לא גרם נזק לצילום לדינמיקת העובר או המיקרוטובולה. במהלך טיפול PST-1P של עוברים שלב 16 תאים, בתנאים כהים קפדניים, ביטוי EB3-dTomato חזק זוהה בתמונה 3D, מדגים כי PST-1P לא פעיל לא לעורר עיכוב של פילמור microtubule בתנאים כהים. לפני ההפעלה של PST-1P, הדמיית זמן לשגות של מטוס z יחיד אישר ביטוי חזק EB3-dTomato, פילמור microtubule באזור תת-תאי.
לאחר הפעלת אור 405 ננומטר, בתוך שניות, זוהתה ירידה באות השביט EB3-dTomato. והתאוששות של האות הושגה עם ביטול של PST-1P, באמצעות לייזר 514 ננומטר. מיקרו העוברים מוזרק עם EB3-dTomato, ודגר עם PST-1P, הראה פוטנציאל עוברי נורמלי, פיתוח לשלב blastocyst.
ודינמיקה מיקרוטובולית רגילה במהלך מיטוזה. המציין אי רעילות של PST-1P פעיל לעובר. בסרטים שנרכשו בזמן לשגות, EB3-dTomato תיוג הופיע כמבנים דמויי כוכב שביט, ואיפשר מעקב אחר חוטי microtubule גדלים.
בעוברים שטופלו ב- PST-1P, שנשמרו בתנאים כהים, כוכבי שביט בודדים מסוג EB3-dTomato נבעו מגשר אינטרפאזה, הפועל כמרכז ארגון מיקרוטובולה לא-צנטרוסומלית בעובר העכבר המוקדם. t-stack מציג כוכבי שביט EB3-dTomato באזור הגשר הבין-פאזי. לאחר ההפעלה של PST-1P, כוכבי שביט EB3-dTomato צומצמו בבסיס הגשר הבין-פאזי ובערימת t.
זכור כי אור לבן יכול להפעיל PST-1P בטרם עת. אז השתמש רק במקורות אור אדום לנראות. אור ירוק גם מנטרל PST-1P, אז בבקשה להימנע משימוש סמני תווית פלואורסצנטית ירוקה.
טכניקה זו שימשה drosophila, אמבה, עכברים, ומערכות הפריה חוץ גופית מרובות, כדי למקד צמיחה microtubule על מנת ללמוד נדידת תאים היווצרות רקמות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג את השימוש בפוטוסטטינים (photostatins) למניפולציה של מיקרוטובוליים בעוברי עכבר חיים בשלב טרום-השתבצות. הוא מדגיש את חשיבות תנאי התאורה במהלך הכנת הדגימות כדי למנוע הפעלה מוקדמת של הפוטוסטטינים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- מעכבי מיקרוטובוליים נמצאים בשימוש נרחב במחקר.
- פוטוסטטינים (Photostatins) הם מחלקה חדשה של מעכבי מיקרוטובולי פוטו-ניתנים למיתוג.
- הם מאפשרים בקרה מרחבית וזמנית מדויקת על הדינמיקה של מיקרוטובולים.
- יישום במערכות פיזיולוגיות תלת-ממדיות הוא גישה חדשנית.
מטרת המחקר
- להחלת פוטוסטטינים (photostatins) בעוברים חיים של עכברים בשלב טרום-השתבצות.
- לבחון מניפולציה של צמיחת מיקרוטובוליים באמצעות תרופות הניתנות להפעלה על ידי אור.
- לבסס פרוטוקולים לשימוש בפוטוסטטינים בתנאי חושך.
שיטות ששימשו במחקר
- הכנת תמיסות סטוק ותמיסות עבודה של PST-1P במים אולטרה-טהורים.
- ביצוע ניסויים בחשיכה מוחלטת או תחת אור אדום.
- יישום של פוטוסטטינים הניתנים להפעלה באמצעות אור למניפולציה של מיקרוטובוליים.
- ניטור השפעות החשיפה לאור על הפעלת הפוטוסטטין.
תוצאות עיקריות
- מניפולציה מוצלחת של דינמיקת מיקרוטובוליים בעוברים חיים.
- הדגמה של חשיבות תנאי התאורה בניסויים.
- ביסוס פרוטוקול חדש לשימוש בפוטוסטטינים (photostatins) במערכות תלת-ממדיות.
- מתן תובנות לגבי בקרה הפיכה של צמיחת מיקרוטובוליים.
מסקנות
- פוטוסטטינים (Photostatins) יעילים למניפולציה מדויקת של מיקרוטובוליים.
- עבודה בתנאי חשיכה היא קריטית להצלחת הניסוי.
- שיטה זו פותחת נתיבים חדשים לחקר הדינמיקה של מיקרוטובוליים בהקשרים ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בקרה ספציו-טמפורלית מדויקת של דינמיקת המיקרוטובולים מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית בשלבי תיקוף המטרה המוקדמים, על ידי בידוד התרומות של השלד התאי לפנוטיפים תאיים. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בסריקה פנוטיפית, בכך שהיא מאפשרת הפרעה תת-תאית הפיכה ללא ציטוטוקסיות גלובלית. יישום במערכות פיזיולוגיות בתלת-ממד, כגון עוברים, מגביר את הרלוונטיות התרגומית להפחתת סיכונים של מובילים המכוונים למסלולים של השלד התאי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מנגנונים תלויי-מיקרוטובוליים במבחנים פנוטיפיים באמצעות עיכוב הפיך ונשלט באור.
- ערך תפעולי: מספק כלי לא רעיל וניתן למיתוג פוטו-כימי (photoswitchable) לצורך תיקוף של מטרות סוב-צלולריות במודלים תלת-ממדיים חיים.
- ערך ניבוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי בידוד משתנים של השלד התאי בהקשרים ביולוגיים מורכבים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מסייע בהכנת מערכות סטנדרטיות ומבוקרות-אור להפרעה למיקרוטובוליים, לצורך סריקת תרכובות הניתנת לשחזור.
- ערך תפעולי: מאפשר מוכנות של הבדיקה באמצעות טיפול בתנאי חוש ופרמטרים מדויקים של הפעלת אור.
- יכולת הרחבה: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה במודלים תלת-ממדיים, כגון אורגנואידים ובלסטואידים, למחקרי מעורבות במטרות של השלד התאי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים מניפולציה של השלד התאי הרלוונטית למחלה בעוברים של יונקים, ובכך תומך בתוקף של המודל הפרה-קליני.
- ערך תפעולי: מבסס רציפות משלב הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני באמצעות מודולציה הפיכה ולא פולשנית של מיקרוטובוליים.
- הפחתת סיכונים: מאשר את היעדר הרעילות של photostatins פעילים בעוברים מתפתחים, ובכך מפחית עמימות מכניסטית באפיון הבטיחות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משולבת בביולוגיה של גילוי לבדיקת היפותזות של מטרות, מאפשרת פיתוח של בדיקות (assays) למטרות של שלד התא, ותומכת במחקר תרגומי באמצעות מניפולציה הפיכה של מיקרוטובולי במערכות תלת-ממדיות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לחקירה מדויקת והפיכה של דינמיקת מיקרוטובוליים בעוברים חיים.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות פרוטוקולים מוגדרים של הפעלה/כיבוי של אור ומיקוד של ROI תת-תאי.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות כמותיות באמצעות מעקב אחר שבילי EB3-dTomato למדידת דינמיקת הפולימריזציה של מיקרוטובוליים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות הדגמה של יצירת בלאסטוציסט ומיטוזה תקינה לאחר הטיפול.
- שימוש חוזר ארגוני: ממצב את הפוטוסטטינים כפלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר וניתנת להפעלה פוטו-כימית לתיקוף מטרות של השלד התאי במערכות פיזיולוגיות תלת-ממדיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות הפרעה הפיכה וספציו-טמפורלית של מיקרוטובוליים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות טיפול קפדני בתנאי תאורה ופרמטרי לייזר מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות של go/no-go על ידי הפחתת השפעות של שלד התא מחוץ למטרה (off-target) בסריקה פנוטיפית.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף של מטרות בשלד התא מותאם לסיכון, תוך שימוש במודולציה הפיכה ולא רעילה במודלים מבוססי עוברים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקאלית של תאים חיים וטיפול בתרכובות בעלות יכולת מיתוג פוטו-כימי (photoswitchable).
- נדרשות מערכות לייזר המסוגלות להפיק אורכי גל של 405 nm (הפעלה), 514 nm (ביטול הפעלה) ו-561 nm (דימות).
- נדרש סטנדרטיזציה חוצת-צוותים של פרוטוקולי חשיפה לאור כדי למנוע הפעלה מוקדמת של PST-1P.
- כולל שיקולי התאמה עבור סימון EB3-dTomato או רפורטרים שווי-ערך למעקב אחר קצות הפלוס של המיקרוטובוליים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הימנעות מאור ירוק ומסמנים פלואורסצנטיים העלולים לבטל את פעילות הפוטוסטטינים.
