הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים עוברים תנועה בקנה מידה גדול. הפרוטוקול שלנו מתאר כיצד לנטר תנועה זו באמצעות צבעים פלואורסצנטיים שפותחו עבור תרבית תאים. בהשוואה לחלבונים פלואורסצנטיים, בדיקות פלואורסצנטיות הזמינות באופן מסחרי בהירות יותר ומשתרעות על פני טווח רחב יותר של הספקטרום.

הם מאפשרים קולבלינג מולטיפלקס וניתן להשתמש בהם בכל רקע גנטי. נדרש תרגול וניסוי וטעייה כדי לדעת כמה זמן לייבש עוברים, כך שהם מתפוצצים במהלך ההזרקה או מתייבשים ומפסיקים להתפתח. כדי להתחיל להכין את מחטי ההזרקה על ידי הנחת הנימים במחזיק נימים על מושך המחטים ואבטחתו באמצעות אומי כנף.

יישרו את מרכז הנימים עם גוף החימום. על פי הוראות היצרן, בחר הגדרות מתאימות על מושך המחט. באמצעות מיקרוסקופ ניתוח, בצע את בדיקת בקרת האיכות.

לחץ את המחטים לתוך המרק אופקית עם קצות המחט תלויים באוויר. מכסים את המחטים במכסה ומאחסנים עד לשימוש. באמצעות שימוש בקצות העמסת מחט המחוברים למיקרופיפט, משכו מיקרוליטר אחד של תמיסת ההזרקה לתוך הקצה מבלי ללכוד בועות אוויר.

באמצעות כפפות, החזיקו את המחט ביד אחת כשקצהה מצביע הרחק והכניסו לתוכה את קצה ההעמסה. מחלקים את הנוזל ליד קצה המחט, מסירים את הפיפטה ומחזיקים את המחט אנכית עד שהנוזל זורם לקצה. מכסים את המיכל בנייר אלומיניום מבלי לפגוע בקצות המחט כדי למנוע הלבנה של הצבעים.

באמצעות פיפטת העברה, או מיקרופיפטר, מניחים טיפה קטנה של דבק הפטן במרכז החלקת כיסוי מלבנית, ומאפשרים לה להתאדות. להסרת המקהלה באופן מכני, מכסים את צלחת העובר המיושנת כראוי בשכבה דקה של שמן הלוקרבון 27 כדי להפוך את קליפת הביצה לשקופה. צפו בצלחת מתחת למיקרוסקופ דיסקציה עם תאורת טרנס כדי לאשר את שלב העובר ולבחור את העוברים בשלבי המחשוף.

באמצעות פינצטה עדינה, הרימו עובר מהשלב הרצוי על ידי תפיסת התוספות הגביות והעבירו אותו למגלשת הזכוכית המוכנה המכוסה בנייר דבק דו-צדדי. מניחים את העובר על הקלטת וממזערים את העברת השמן. גלגלו את העובר בעדינות על פני השטח של הקלטת על ידי נדנוד עם הצד של קצה הפינצטה מבלי לדחוף אותו ישירות.

ממשיכים לגלגל את העובר עד שהכורה נדבקת לקלטת ונסדקת. לאחר שהכוריון נסדק, המשיכו לגלגל את העובר כדי להפריד אותו מהכוריון, שנשאר דבוק לקלטת. גלגלו את העובר בחזרה אל הכוריון, שהוא פחות דביק מהסרט.

לשפשף בעדינות את העובר עם הפינצטה עד שהוא מתחבר לפינצטה לצורך העברה. לאחר מכן, העבירו את העובר לתלוש הכיסוי והביאו אותו במגע עם הדבק כדי להחזיק את העובר במקומו, ולהפריד אותו מהפינצטה. התאם את כיוון העובר על תלוש הכיסוי.

תנו לעוברים להתייבש במשך חמש עד 12 דקות על ידי הכנסת הכיסוי עם העוברים לתא ההתייבשות ואטימתו. הורידו את החלקת הכיסוי מהתא והניחו טיפה של שמן הלוקרבון 700, המכסה את העוברים כדי למנוע התייבשות נוספת. בחנו אותם תחת היקף הניתוח והמשיכו למיקרו-איניג'קציה אם העוברים הושחתו כראוי.

מקם את המטרה פי 4 לנתיב האור ובאמצעות ידית המיקוד במיקרוסקופ, התאים את העוברים למיקוד. הזז את העוברים אופקית למרכז שדה הראייה באמצעות פקדי הבמה. יש לשמור את העוברים בקצה שדה הראייה ולהרחיק את העורף כהכנה להנמכת המחט.

להישאר עם אותו מישור מוקד, להוריד את קצה המחט ולוודא שהוא נראה בשדה הראייה יחד עם העוברים. בדקו כי המחט מתפקדת על ידי חלוקת חלק מתמיסת ההזרקה לשמן הלוקרבון 700. אם תצליח, תופיע בועה של תמיסה בשמן ליד קצה המחט.

באמצעות בקרות הבמה, הזז את העובר לכיוון קצה המחט עד שהקצה מנקב בעדינות את העובר ונכנס לתוכו. במקביל, מתחילים את זרימת תמיסת ההזרקה עד שמופיעה נקודה שקופה חולפת באתר קצה המחט, מה שמעיד על העברת תמיסה מוצלחת לעובר. הדק את החלקת הכיסוי במיקרוסקופ הקונפוקלי באמצעות מחזיק המגלשה.

יש לנקוט משנה זהירות מכיוון שהחלקת הכיסוי שברירית. בדקו את העוברים באמצעות פונקציית האפיפלואורסצנציה במיקרוסקופ הקונפוקלי במטרה של פי 40 וודאו שהפלואורו 4 בעובר גלוי לפני שתמשיכו. עבור הדמיה חיה, במהלך השלבים הסינכיטיים, הגדר את גודל התמונה של 512 על 512 פיקסלים, ממוצע שורה של שלושה וקצב פריימים של 0.1 פריימים לשנייה.

לאחר שהוזרק צבע BODIPY 493 503, הוא הוכנס לאתר שבו הוכנס קצה המחט ואז התפזר בסמוך לאתר ההזרקה. לאחר 24 דקות, הצבע התפזר מעבר לנקודת האמצע של העובר. תנועתיות האברונים נוטרה על ידי הזרקת העובר עם BODIPY 493 503 ו- LysoTracker Red.

ניתוח הוולוצימטריה של תמונת החלקיקים גילה כי התוכן העוברי התכנס באזור המרכזי של העובר, שם הציטופלסמה זורמת אל פנים העובר. תיוג של ה-ER, באמצעות ER-Tracker Green, מספק רזולוציה חיה של המעטפת הגרעינית, ומאפשר הדמיה של שלבי מחזור התא העיקריים. לעובר הוזרק MitoView 633 בשלב הבלסטודרם והוא צולם ארבע שעות לאחר מכן.

התמונה מציגה תא נוירואקטודרמלי של עובר בהרחבת רצועת הנבט. לעובר התאים הוזרקה תערובת של BODIPY 493 503 ו-SiR Tubulin, שמראה כי טיפות השומנים נעות באופן דו-כיווני לאורך מיקרוטובולים. יש לייבש את העובר באופן חלקי כדי שניתן יהיה להזריק נוזלים.

מעט מדי ייבוש יגרום לעובר לדלוף כשהוא מוזרק, יותר מדי ייבוש יהרוג את העובר. ניתן לאפיין סרטונים של אברונים נעים באמצעות טכניקות ניתוח תמונה מגוונות. מעקב אחר חלקיקים חושף את התנהגותם של אברונים בודדים, הדמיית חלקיקים ולוסימטריה חושפת את הזרימה הגדולה.