ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית
19 בינואר 2022
ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה הוא קל יחסית לביצוע, מהיר, חסכוני, ובידיים מנוסות, כלי אמין במידה ניכרת לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית, שאמורה להיות זמינה בכל מרכז המעורב באבחון ובטיפול במחלות ריאה קשות.
ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה הוא כלי אמין לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית. טכניקה זו קלה יחסית לביצוע, מהירה, חסכונית, ובידיים מנוסות אחרות כלי אמין מאוד. וזה ישים עבור חולים מכל קבוצות הגיל.
מיקרוסקופיית וידאו חושפת גם תפקוד סילארי משני. כמו, למשל, בגלל זיהומים חיידקיים או ויראליים. אבל זה שימש בעיקר כדי לאבחן dyskinesia סילארי ראשוני.
מדענים משתמשים בשיטה זו גם כדי לדמיין תהליכים תוך-תאיים או תפקודים ביולוגיים בתאים חיים. מי שתסייע לי בהליך זה תהיה הגברת טינה פרומאה, טכנאית המעבדה שלנו.
לפני איסוף תאי האפיתל הנשימתיים, בקשו מהחולה לפוצץ את האף ביסודיות. כאשר המטופל מוכן, שמור על ראשו של המטופל קבוע ביד אחת והשתמש במברשת אינטרדנטלית בגודל 0.6 מילימטר ביד השנייה כדי להבריש את הטורבינט הנחות של הנחיריים כדי לאסוף מספיק רצועות תאי אפיתל. שחררו את רצועות התאים שנקטפו לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכיל את ה-DMEM הניזון מהתא.
לאחר סגירת המכסה של צינור microcentrifuge להחזיק את הצינור כנגד מקור האור ולנער את הצינור כדי לגלות רצועות תאים וקונגלומרטים שנקטפו. מאוחר יותר, מניחים את צינורות המיקרוצנטריפוגה כאשר המכסים סגורים כראוי בתיבת פוליסטירן. לפני סגירת הקופסה יש לוודא היטב שהצינורות קבועים בתוך הקופסה.
לאחר מכן הוסיפו חבילה קרה לקופסה תוך הימנעות מהקפאת הדגימה. לאחר הסרת צינורות המיקרו צנטריפוגה המכילים את הדגימות מתיבת הפוליסטירן, הניחו צינור אחד מתחת למכסה המנוע של יחידת החימום של המיקרוסקופ כדי לחמם עד 37 מעלות צלזיוס לניתוח מיקרוסקופ וידאו במהירות גבוהה או HSVMA. לאחר מכן, הפעל את המצלמה ואת התוכנה של יחידת הווידאו במחשב.
השתמש בפיפטה כדי לקחת דגימה קטנה ולהניח שתי טיפות של הדגימה לתוך cuvette. מכסים את הקובט במכסה לפני שמניחים אותה מתחת למיקרוסקופ. השתמשו בעדשת טבילת שמן עם הגדלה של פי 100 והניחו טיפה של שמן טבילה על פני השטח של האופטיקה.
תוך כדי התקרבות לתחתית המנה עם עדשת המיקרוסקופ, חפשו את אשכולות התאים ללא תאי דם אדומים ועם תכולת ריר נמוכה. לאחר מציאת אזור עניין מייצג, או ROI, התמקדו בקבוצה אחת של הריסונים המכות עם תנועות הריסונים הגדולות ביותר והקליטו רצף וידאו. רשמו את התאים עם ריסונים פועמים בצד וממלמעלה.
הניתוח הייצוגי מראה תנועות ריסונים רגילות הנראות בצד וממלמעלה. הדגימה של דיסקינזיה סילארית ראשונית, או חולה PCD, עם מוטציה בגן DNAH11 הדגימה את התבנית הקלאסית הנוקשה המינימלית הנעה של פעימה סילארית. כאשר מסתכלים מהצד ומעל.
בחולה PCD אחר עם אותה מוטציה נצפתה תבנית היפרקינטית שונה אך לא יעילה של הריסונים המכות. דפוס פעימה סילארי פתולוגי ותדירות פעימה סילארית נראו גם אצל חולה הסובל מזיהומים חוזרים ונשנים בדרכי הנשימה העליונות. אם הליך ההברשה מתבצע בקפדנות ניתוח HSVMA לא יכול להתבצע כמו תאי אפיתל ciliated היו מכוסים בציפוי של תאי דם אדומים.
השלב החשוב ביותר בהליך הוא לקבל מספיק תאים נשימתיים מן הצחצוח ולשמור על חומר זה נשמר היטב עבור ניתוח וידאו. החומר הנותר יכול לשמש לביצוע מיקרוסקופיית אלקטרונים או מיקרוסקופיה אימונופלורסקית כדי לזהות פגמים מבניים אפשריים בריסונים או כדי לחשוף פגמים וסינתזה של חלבונים סילאריים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
ניתוח במיקרוסקופיה של וידאו במהירות גבוהה הוא כלי אמין וכלכלי לאבחון דיסקינזיה שרישית ראשונית. הוא קל לביצוע וניתן להחלה על כל קבוצות הגיל, מה שהופך אותו לחיוני עבור מרכזים המטפלים במחלות ריאה חמורות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- רפואת נשימה
- טכניקות אבחון
רקע
- דיסקינזיה שרישית ראשונית (Primary ciliary dyskinesia) היא מצב המשפיע על תפקוד השרישים.
- מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה יכולה לחשוף תפקוד שרישי ראשוני ושני.
- טכניקה זו שימושית במיוחד לאבחון בעיות נשימה הקשורות להפרעה בתפקוד השרישים.
- חשוב שקליניקאים יוכלו לגשת לכלי אבחון מהימנים.
מטרת המחקר
- להערכת היעילות של מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה באבחון של primary ciliary dyskinesia.
- לבחינת השמישות של טכניקה זו בקבוצות גיל שונות של מטופלים.
- להדגשת החשיבות של כלי אבחוני זה במסגרות קליניות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח במיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה.
- הערכה של תנועת השמא cilia ותפקודן.
- השוואת תוצאות בין דמוגרפיות שונות של מטופלים.
- הערכה של תפקוד שמרים משני ביחס לזיהומים.
תוצאות עיקריות
- מיקרוסקופיה וידאו במהירות גבוהה יעילה לאבחון של דיסקינזיה שרישית ראשונית.
- הטכניקה היא אמינה כאשר היא מבוצעת על ידי אנשי מקצוע מנוסים.
- היא מספקת תובנות לגבי תפקוד שרישי משני.
- ניתן ליישם אותה על חולים בכל הגילאים, מה שמגביר את התועלת שלה בפרקטיקה קלינית.
מסקנות
- מיקרוסקופיה בווידאו במהירות גבוהה צריכה להוות כלי אבחנתי סטנדרטי ברפואת נשימה.
- קלות השימוש והמהימנות שלה הופכות אותה למתאימה לאבחון בקו ראשון.
- זמינות נרחבת יכולה לשפר את התוצאות עבור חולים עם מחלות ריאה חמורות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה (HSVMA) מספק שיטה מהירה וחסכונית לאבחנה ראשונית של דיסקינזיה שרישית ראשונית (PCD), הפרעה גנטית נדירה המשפיעה על פינוי הריריות השרישיות. על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של דפוסי תנועת השרישים בתאי אפיתל נשימתיים חיים, HSVMA תומכת בזיהוי מוקדם ומפחיתה את ההסתמכות על טכניקות הדורשות משאבים רבים יותר, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת. יכולת זו משפרת את קצב האבחון במרכזי פולמונולוגיה ומרכזים למחלות נדירות, ומסייעת בהתערבות בזמן ובצמצום סיבוכים ריאתיים ארוכי טווח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר הערכה תפקודית של ניידות השערות (ciliary motility) בתאים המופקים מחולים, ובכך תומך בתיקוף מטרות במחקר של ציליופתיות (ciliopathy).
- ערך תפעולי: מספק מדד ש可חזר להערכת התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות על תפקוד השערות.
- ערך ניבוי: מבחין בין פגמים מבניים לתפקודיים, ובכך משפר את הביטחון בהשערות מנגנוניות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים על תדירות הדפיקה של השערות (ciliary beat frequency) ועל צורת הגל לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: תומך בפיתוח של פרוטוקולים סטנדרטיים לדימות תאים חיים במודלים של מחלות דרכי הנשימה.
- שכביליות: מאפשר ניתוח בעל תוכן גבוה (high-content analysis) של דינמיקה של שערות במגוון דגימות חולים או גרסאות גנטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאים in vitro לפנוטיפים קליניים על ידי הקשר בין תוצרי HSVMA לחומרת המחלה.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מזהה הצלה תפקודית במודלים פרה-קליניים באמצעות השחזרת דפוס פעימה סיליארי תקין.
- הלימה של סממנים ביולוגיים: מספק מדדים תפקודיים המשלימים סממנים ביולוגיים מבניים או מולקולריים ב-PCD.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
HSVMA משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, ומספק סבב בדיקה תפקודי לפיתוח טיפולים המכוונים לשרישונים.
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת בבדיקת היפותזות לגבי גנים המעורבים בהרכבת השערות (cilia) ובתנועתן, כגון DNAH11.
- סריקה: מספקת קריאות כמותיות בזמן אמת המתאימות לסריקת תרכובות במודלים של ציליופתיה (ciliopathy).
- אנליזה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של פרמטרי תנועת השערות בין תנאים שונים, ובכך תומכת בקבלת החלטות מבוססות נתונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פנוטיפים תאיים לתוצאות קליניות, ומסייעת במעבר משלב הפרה-קליני לשלב הקליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת תפקוד השערות במגוון מודלים של מחלות דרכי הנשימה.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי אספקת ויזואליזציה ישירה של דינמיקה של ריסונים בהקשרים תאיים טבעיים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות פרוטוקולים מוגדרים של דגימה, שימור והדמיה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך/עצירה (go/no-go) בתיקוף מטרות על ידי אישור רלוונטיות פונקציונלית של ממצאים גנטיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות למחלות ריסונים (ciliopathy) מותאם סיכון, בהתבסס על ראיות להצלה פונקציונלית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באיסוף תאים, בתפעול מיקרוסקופ ובניתוח וידאו לצורך פרשנות מדויקת.
- תלוי במערכות מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה עם אופטיקת טבילה בשמן ובקרת סביבה.
- מחייב נהלים סטנדרטיים לטיפול בדגימות למניעת זיהום או התדרדרות.
- התאמה למערכות מודל שונות עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי התרבית ושל פרמטרי ההדמיה.
- מוגבל על ידי הצורך בדגימות אפיתליאליות חיות שאינן מזוהמות; נוכחות של כדוריות דם אדומות או ריר עלולה להפריע לניתוח.
