אינדוקציה של דלקת מעיים על ידי העברה מאמצת של CBir1 TCR תאי CD4 + TCR מהונדסים לעכברים חיסוניים
16 בדצמבר 2021
בפרוטוקול זה מתואר מודל קוליטיס אימוץ של תאי T ספציפיים למיקרוביוטה במעיים. תאי CD4+ T מבודדים מעכברים מהונדסים CBir1 TCR. אלה הם ספציפיים עבור מיקרוביוטה המעי immunodominant אנטיגן CBir1 flagellin, אשר מועבר לתוך המטופל Rag1-/- עכברים, המוביל דלקת מעיים.
מחלות מעי דלקתיות, או מחלת המעי הרגיז, מטילות נטל בריאותי וכלכלי ניכר על יחידים ועל החברה. מודל קוליטיס זה מועיל ללמוד את המנגנונים של IBD ולהעריך את הטיפולים עבור IBD. זה immunodominant Cbir flagellin T-cell ספציפי העברת קוליטיס מודל מספק תובנות כיצד חיידקי המעיים אנטיגן גורם תגובות תאי T כדי לגרום קוליטיס.
לאחר המתת חסד העכבר, לעשות כ סנטימטר אחד חתך הבטן השמאלית ולמשוך את העור מן רקמת שריר הבטן. לאחר מכן, לבצע חתך של כשלושה סנטימטרים ברקמת שריר הבטן. לאחר מכן, להסיר את הטחול עם מספריים סטריליים מלקחיים.
מניחים את הטחול בצלחת תרבית המכילה חמישה מיליליטר של חוצץ כביסה מקורר מראש. טוחנים את הטחול עם המשטח המחוספס של שתי מגלשות זכוכית סטריליות. העבר את ההשעיה התא לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר על ידי העברתו דרך מסננת תא 100 מיקרומטר.
שוטפים את מגלשות הזכוכית ואת צלחת התרבות עם חמישה מיליליטרים של חיץ כביסה מקורר מראש, ולהעביר את חיץ הכביסה לתוך הצינור. צנטריפוגה ההשעיה התא, להשליך את supernatant, ו resuspend התאים עם חמישה מיליליטרים של טריס אמוניום כלוריד תמוגה מראש חיץ לטחול. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
הוסף 10 מיליליטר של חוצץ כביסה מקורר מראש לצינור. לאחר מכן, צנטריפוגה השעיית התא, להשליך את supernatant, ו respend התאים עם 10 מיליליטר של חיץ בידוד מקורר מראש. כדי לספור את התאים, ערבבו 10 מיקרוליטרים כל אחד מהשעיית התא וכחול טריפאן ביסודיות, וטענו 10 מיקרוליטרים לשקופית.
לאחר מכן, הכנס את השקופית למונה התאים האוטומטי כדי להשיג את מספר התא הניתן לקיום. צנטריפוגה ההשעיה התא הנותרת ולהשליך את כל supernatant. מערבולת חלקיקים מגנטיים CD4 נגד עכבר, להוסיף ישירות 50 microliters של החלקיקים לכל 10 מיליון תאים, ולערבב עם כדורי תאים ביסודיות.
לדגור על התערובת במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבר את השעיית חלקיקי התא לתוך צינור איסוף סטרילי. הוסף 3.5 מיליליטר של חיץ בידוד מקורר מראש לתוך הצינור.
מניחים את הצינור על מגנט הפרדת התא במשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בזהירות לשאוף את supernatant עם פיפטה העברת שלושה מיליליטר. הסר את הצינור ממגנט הפרדת התאים.
לאחר מכן, resuspend התאים עם 3.5 מיליליטר של חיץ בידוד מקורר מראש ומניחים את הצינור על המגנט במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. שאפו בזהירות את הסופר-נרטיב עם פיפטה של 3 מיליליטר. לבסוף, הקדישו מחדש את התאים למיליליטר אחד של מאגר FACS מקורר מראש.
כדי להעביר את התאים לעכברי הנמען, הזן מחדש את תאי ה- TCR הטרנסגניים-נאיביים-CD4-נאיבית של Cbir1 ל-5 מיליון תאים למיליליטר ב- 1x PBS. מחממים את העכברים תחת מנורת חום ומרסנים את העכברים באמצעות מרסן עכברים. תוך ורידי להזריק 200 מיקרוליטרים של ההשעיה התא לתוך הווריד האחורי של העכברים.
לאחר המתת חסד העכבר, לעשות כ חתך עור קו אמצע גחון סנטימטר אחד. משוך את העור הרחק מרקמת שריר הבטן. לאחר מכן, לעשות חתך של שלושה סנטימטרים ברקמת שריר הבטן.
לאחר מכן, לזהות את coecum ולהסיר את המעי הגס כולו עם מספריים סטריליים מלקחיים. הרטיבו את המעי הגס עם PBS מקורר מראש בצלחת תרבות. יש לחרוט את המעי הגס לאורכו ולשטוף אותו ב-PBS מקורר מראש.
חותכים 1/3 של המעי הגס אורך. מניחים את רצועת המעי הגס במגבת נייר כשהצד הלומנלי פונה כלפי מעלה. בצע גלגול שוויצרי באמצעות קיסם.
מניחים את המעי הגס השוויצרי לתוך קלטת, ולשים את הקלטת ב 10% פורמלין חוצץ במשך 24 שעות. מייבשים ומטביעים את המעי הגס בפרפין עם מעבד אוטומטי. לאחר מכן, לחתוך מקטעי רקמת חמישה מיקרומטר על מיקרוטום.
הר את הרקמה על שקופיות ולבצע הכתמת המטוקסילין ואאוזין. עכברי נוקאאוט סמרטוט החלו לרדת במשקל כשלושה שבועות לאחר העברת התא, ומשקלם הגיע סביב 80 עד 85% ממשקלם המקורי שישה שבועות לאחר העברת התא. עכברי נמען הראו אורך המעי הגס הקצר שישה שבועות לאחר העברת התא.
עכברי הנמען הדגימו יותר חדירת תאים במעיים למינה פרופריה ארבעה שבועות לאחר העברת התאים. הם הראו אובדן תאי גביע והיפרפלזיה של תאי אפיתל במעיים חמישה שבועות לאחר העברת התאים, כמו גם שחיקת הרירית וחדירת תאים דלקתיים בתת-הקוקוסה של המעי הגס שישה שבועות לאחר העברת התאים. הציונים ההיסטופתולוגיים עלו משמעותית מארבעה לשישה שבועות.
בו זמנית, לא הייתה דלקת בעכברים נוקאאוט Rag מקבל PBS לבד. באמצעות הליך זה, רמות ציטוקינים המעי הגס יכול להיקבע על ידי ELISA ו qPCR.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר מודל של קוליטיס המבוסס על העברה אדופטיבית של תאי T ספציפיים לאנטיגן של מיקרוביוטת המעי. תאי CD4 + מעכברי TCR טרנסגניים מסוג CBir1 מועברים לעכברי Rag1 -/-, דבר המשרה דלקת במעיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- גסטרואנטרולוגיה
רקע
- מחלות מעי דלקתיות (IBD) מציבות אתגרים בריאותיים משמעותיים.
- מודל זה מסייע בהבנת המנגנונים של IBD.
- הוא מעריך טיפולים פוטנציאליים עבור IBD.
- הוא מספק תובנות לגבי תגובות של תאי T לחיידקי המעי.
מטרת המחקר
- פיתוח מודל למחקר של IBD.
- בחינת תגובות של תאי T לאנטיגנים של מיקרוביוטת המעי.
- הערכת התערבויות טיפוליות עבור IBD.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- בידוד של תאי CD4 + T מעכברים טרנסגניים.
- העברה אדופטיבית של תאי T לעכברים מקבלים.
- השראה של דלקת במעיים.
- הליכים כירורגיים לצורך אנליזה של רקמות.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של קוליטיס בעכברי רקיפיינט.
- אפיון של תגובות תאי T לאנטיגנים של מיקרוביוטה.
- תובנות לגבי תפקידם של חיידקי המעי ב-IBD.
- פוטנציאל להערכת אסטרטגיות טיפוליות.
מסקנות
- המודל מספק פלטפורמה למחקר של IBD.
- הוא משפר את ההבנה של תגובות חיסוניות לאנטיגנים של המעי.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש במודל זה להערכת טיפולים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל זה להעברת תאי T ספציפיים לאנטיגן מאפשר בחינה מכניסטית של תגובות חיסוניות המונעות על ידי מיקרוביוטת המעי במחלות מעי דלקתיות, ובכך תומך בתיקוף של מטרות טיפוליות ובצמצום סיכונים בשלבים הפרה-קליניים. על ידי שחזור של פנוטיפים של תאי T ושל התקדמות היסטופתולוגית הרלוונטיים לבני אדם, הוא מספק מערכת ניבוי להערכת תרופות אימונומודולטוריות. המודל תומך בתהליכי גילוי מוקדמים המתמקדים בהבהרת מסלולים וביצירת ביטחון במטרות הטיפוליות בפתוגנזה של IBD.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של CBir1 flagellin כאנטיגן רלוונטי טיפולית של מיקרוביוטת המעי בפתוגנזה של IBD.
- ערך תפעולי: מספק מערכת מוגדרת ספציפית-לאנטיגן לבידוד ותיקוף של מנגנונים המתווכים על ידי תאי T בדלקת מעיים.
- ערך אסטרטגי: תומך בביטחון ביעד על ידי קישור אנטיגנים מיקרוביאליים ספציפיים לתגובות פתוגניות של תאי T ב-in vivo.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תוצאות היסטופתולוגיות ותאיות כמותיות להערכת השפעות של תרכובות על דלקת במעי הגס.
- ערך תפעולי: מבסס פנוטיפ של קוליטיס הניתן לשחזור, עם ירידה מדידה במשקל, קיצור של המעי הגס וחדירת תאי מערכת החיסון לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר סריקה של אימונומודולטורים באמצעות נקודות קצה רלוונטיות קלינית, כגון שחיקת רירית ופרופילי ציטוקינים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: משקף מאפיינים היסטופתולוגיים מרכזיים של IBD בבני אדם, כולל אובדן תאי גובלט, היפרפלזיה אפיתליאלית ודלקת סוב-מוקוזית.
- ערך תפעולי: תומך בניטור אורך של חומרת המחלה באמצעות מעקב אחר משקל, אורך המעי הגס ודירוג היסטולוגי לצורך התאמה פתמקוקינטית/פתמודינמית.
- ערך אסטרטגי: מקל על קבלת החלטות קידום מותאמות סיכון על ידי מידול קוליטיס כרונית המונעת מתאי T, הרלוונטית לפתופיזיולוגיה של מחלת קרוהן.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
המודל משתלב בתהליכי עבודה משלב הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני על ידי אספקת גשר מכניסטי מהפעלה של תאי T ספציפיים לאנטיגן ועד לפתולוגיה ברמת הרקמה, ובכך מאפשר בדיקת השערות ואופטימיזציה של מועמדים תרופתיים (lead optimization) ב-IBD.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבחינת היפותזות לגבי אנטיגנים של מיקרוביוטת המעי וספציפיות של קולטני תאי T בהנעת דלקת במעיים.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים וסטנדרטיים, כולל ציוני היסטופתולוגיה ורמות ציטוקינים לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של רמות ציטוקינים במועון באמצעות ELISA ו-qPCR כדי לקשר בין הפעלת מערכת החיסון לתגובה טיפולית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פנוטיפים של תאי T בעכברים למנגנוני IBD רלוונטיים לבני אדם באמצעות פתולוגיה חיסונית ספציפית לאנטיגן.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה רב-פעמית לבדיקות איטרטיביות של מועמדים לאימונומודולציה המתמקדים במסלולי תאי T מונעי אנטיגן.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות השראה של קוליטיס על ידי תאי T ספציפיים לאנטיגן.
- ערך תפעולי: פרוטוקולי השראה והערכה סטנדרטיים מבטיחים הדירות בין מעבדות ומחקרים.
- ערך אסטרטגי: מפחית סיכונים ביולוגים על ידי תיקוף מטרות במודל דלקת רלוונטי פיזיולוגית המונחה על ידי אנטיגן.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בקבלת החלטות המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי קישור בין מודולציה של המטרה לתוצאות היסטופתולוגיות וקליניות דומות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד תאי T, מיון מגנטי וטכניקות של העברה אדופטיבית (adoptive transfer).
- תלוי בגישה לעכברי TCR טרנסגניים מסוג CBir1 ולמקבלים חסרי Rag1 לצורך נאמנות המודל.
- מחייב דירוג היסטולוגי סטנדרטי ועיבוד רקמות לצורך הערכה עקבית של הדלקת.
- כולל הליכים כירורגיים ופרופוזיה הדורשים טכניקה אספטית ודיוק אנטומי.
- מוגבל למחקרים מכניסטיים של תגובות ספציפיות לאנטיגן; אינו מדמה את מורכבות המיקרוביום או תפקוד לקוי של מחסום הגוף כשלעצמם.
