גידול לימפוציטים במיקרו-כבידה מדומה באמצעות מערכת תרבית תאים סיבובית
25 באוגוסט 2022
זהו מדריך שלב אחר שלב לשימוש במערכת תרבית תאים סיבובית זמינה מסחרית לתרבית לימפוציטים במיקרו-כבידה מדומה באמצעות כלי תרבית חד-פעמיים מיוחדים. שיטת גידול זו יכולה להיות מיושמת על כל תרבית תאים מסוג תרחיף.
שיטה זו מאפשרת לנו לחקור את ההשפעות של מיקרו-כבידה מדומה על תאי מערכת החיסון כדי לעזור לנו להבין טוב יותר כיצד היבטים של סביבת החלל משפיעים על הפיזיולוגיה האנושית ברמה המולקולרית. טכניקה זו היא כדאית מבחינה כלכלית והיא קלה יחסית להקמה ולתחזוקה בהשוואה לשליחת תרבית תאים לחלל או שיטות אחרות של חשיפת תרבית תאים למיקרו-כבידה מדומה על כדור הארץ. מומלץ ללכת לאט תוך כדי מילוי הכלים על מנת למנוע הצפה ושפיכה.
לאחר הסרת הבועה הראשונית, ודא כי כלי הדם מלאים לחלוטין באמצעות מזרקים. זה ימזער את הסיכויים להיווצרות בועות גדולות במהלך הטיפול. התחילו בהוצאת כלי התרבות מאריזות הפלסטיק.
תייגו כל כלי על השפה בהתאם לסוג התא או הקו בו נעשה שימוש, בין אם הוא נמצא בבקרה או בטיפול וכל מידע רלוונטי אחר. ייצב את הכלי ופתח את פתח המילוי בזהירות מבלי לגעת ביתד מכסה פתח המילוי או בטבעת O. הניחו את הפקק על כרית אתנול כאשר היתד או טבעת ה-O פונות כלפי מעלה בזמן שהכלי מלא.
אין להסיר את הפקקים מיציאות המזרק. לטעון את הכלי עם 10 מ"ל של מדיה מלאה המתאימה עבור תרבית התא באמצעות פיפט סרולוגי סטרילי, בזהירות להניח את המכסה על יציאת המילוי. ודא שמכסי יציאות המזרק ויציאת המילוי סגורים היטב.
לאחר מכן, הניחו את הכלים המלאים באינקובטור תוך ביצוע השלבים הבאים כדי לכוון את הכלים לתרבית תאים. שלפו את כלי השיט הדרוכים מהאינקובטור. לבקרת בקבוק, טען בקבוק תרבית תרחיף T25 עם 10 מ"ל של תרבית תאים מהמלאי שהוכן לעיל.
הוסף 10 מ"ל של תרבית תאי מלאי לצינור חרוטי נפרד של 15 מ"ל, שישמש לטעינת המזרקים. פתח את הברגת מכסי יציאת המזרק כדי להסיר אותם מהכלי ולוודא שהפקקים נמצאים במצב פתוח. ייצב את הכלי ופתח את פתח המילוי בזהירות מבלי לגעת ביתד מכסה פתח המילוי או בטבעת O.
הניחו את הפקק על כרית אתנול כאשר היתד או טבעת ה-O פונות כלפי מעלה בזמן מילוי הכלי. ודא כי stopcocks נמצאים במצב פתוח. ניתן לרוקן את הכלי על ידי שפיכת המדיה מהכלי למיכל פסולת באמצעות פיפטה סרולוגית.
לחלופין, שאפו את המדיה באמצעות זכוכית סטרילית מעבר לפיפטה שלכם המחוברת למערכת ואקום. בעת השימוש בפיפט או במערכת הוואקום, הקפד לא לגעת בקרום החמצון מכיוון שהדבר עלול לפגוע בו, ולהפוך את הכלי לבלתי שמיש. סגור היטב את הצינור החרוטי 50 מ"ל המכיל את תרבית תאי המלאי מוכן ולהפוך אותו בעדינות כמה פעמים כדי לערבב את התוכן ביסודיות.
צייר 10 מ"ל של מלאי תרבית תאים מצינור 50 מ"ל עם פיפט סרולוגי סטרילי טרי. הרימו את הכלי והטו אותו, כך שיציאת המילוי תהיה כלפי מעלה. לאחר מכן הוציאו בזהירות את מלאי תרבית התאים לתוך הספינה דרך יציאת המילוי.
מלאו את הכלי עד קצה פתח המילוי, תוך הטיית הכלי חזרה כלפי מטה כדי למנוע שפיכה. היזהר לא לגעת בקרום החמצון עם פיפטה כפי שהוא שביר מאוד. לאחר העמסת הכלי, הניחו בזהירות את מכסה פתח המילוי בחזרה מבלי לגעת בטבעת ה-O.
הסר את מזרק 3 מ"ל הראשון מן החבילה שלה לשאוב אותו כמה פעמים כדי לשחרר אותו. לאחר מכן חבר את המזרק לאחת מיציאות המזרק, וודא שהמזרק מדוכא לחלוטין. סגור היטב את הצינור החרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של תרבית תאי aliquot, ולהפוך אותו בעדינות כמה פעמים כדי לערבב את התוכן ביסודיות.
באופן דומה, להסיר את מזרק 3 מ"ל השני מן החבילה שלה לשאוב אותו כמה פעמים. ואז בזהירות חצי שקוע מזרק זה בתרבית התא מן הצינור החרוטי 15 מ"ל ולצייר קצת תרבית. מזערו את בועות האוויר על ידי הוצאה מוחלטת של המזרק בחזרה לתוך הצינור והפקת 3 מ"ל של תרבית.
חברו את המזרק המלא ליציאת המזרק הנותרת, וחטאו בזהירות את המזרקים ומסביב לשקע המילוי בעזרת פד אתנול. אין לקבל אתנול על קרום החמצון. חזור על התהליך עבור הכלים הנותרים.
אם נותרה תרבית תאים מעט לא מספקת בצינור החרוטי של 50 מ"ל עבור הכלי האחרון, לשחזר את הכמות הנותרת מהצינור החרוטי 15 מ"ל המשמש לטעינת המזרקים. ודא כי פקקי יציאת המזרק סגורים כדי להגביל את נדידת התאים והבועות מהמזרקים לתוך כלי הדם. הפוך את הכלי והכה אותו בצד כמה פעמים כדי לאסוף את הבועות הראשוניות.
הפוך במהירות את הכלי לאחור כדי לפנות כלפי מעלה, ולאחר מכן בזווית קלה פונה החוצה, כך שכל הבועות צפות לצד למעלה של הכלי. תמרנו את הבועות מתחת לנמל עם המזרק הריק, וצפו בהן מתחילות להיכנס לנמל. פתח את שני פקקי יציאת המזרק.
הכו בעדינות בכלי כדי לעודד את הבועות לצוף מעלה לתוך המזרק הריק. לאט לאט למצוץ את הבועות הגדולות עם מזרק ריק תוך לחיצה בזהירות על המזרק המלא כדי לשמור על הלחץ בכלי, כך קרום חמצון לא להתפוצץ. חזור על תהליך זה מספר פעמים כדי להבטיח שכל הבועות יוסרו.
לאחר הסרת הבועות ביעילות, סגור את פקקי יציאת המזרק. שמור את המזרקים דולקים במהלך הטיפול כדי לאפשר הסרת בועות לאחר מכן, להבטיח כי נפח בשני מזרקים הוא שווה בקירוב. נגב בזהירות את פני השטח של הבסיס המסתובב וכבל הסרט עם 70% אתנול.
ודא שכבל רצועת הכלים מחובר לספק הכוח. מניחים את הבסיס המסתובב באינקובטור, ומחברים את כבל הסרט לבסיס. מקם את ספק הכוח ליד, אך מחוץ לאינקובטור.
חבר את כלי הטיפול SMG על ידי יישור חוטי הכלי ליתד המסתובבת וסיבוב עדין של היתד המסתובבת על הבסיס נגד כיוון השעון. ודא שכלי השיט מחובר היטב. שמור על האינקובטור בלחות של כ -100% על ידי מילוי מגש המים במי RO autoclave.
התאימו את מהירות הסיבוב של האינקובטור כך שתתאים למהירות השקיעה של התאים, כך שהתאים לא יפלו דרך המדיה. ביום הראשון לקביעת הטיפול, יש לבדוק היווצרות בועות כל כמה שעות כמתואר בכתב היד של הטקסט. הסירו את הבועות לפחות פעם ביום עד לסיום משך הטיפול הרצוי.
לאחר שחלף אורך הטיפול המתוכנן, עצרו את הסיבוב ופרקו את המנגנון. הסר את כלי הטיפול על ידי החזקת כלי הדם בעדינות במצב נייח תוך סיבוב היתד המסתובבת של המכשיר בכיוון השעון. הכניסו את צלוחית הבקרה, הבקרה וכלי הטיפול לארון בטיחות ביולוגי סטרילי.
קח כל כלי למעט בקבוק הבקרה והפוך אותו, כך שהוא פונה כלפי מטה. לאחר מכן הכה אותו בעדינות כדי להביא את כל התאים להשעיה. לאחר מכן סובב את הכלי על צדו עם פתח המילוי לכיוון התחתית, והכה בו שוב כדי להנחות את התאים לכיוון פתח המילוי לשאיפה יעילה.
טפל בכל כלי בנפרד. שחררו את המזרקים משתי היציאות ושחררו אותם לפסולת המסוכנת ביולוגית. פתח את הסטופקוקים ביציאות המזרק.
בזהירות להסיר את מכסה יציאת מילוי ולצייר את התוכן באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית 10 מ"ל, להטות את הכלי כפי שהוא מרוקן. יש לחלק את התוכן של כל קבוצות הבקרה והטיפול לתוך צינורות חרוטיים 15 מ"ל המסומנים בנפרד. סגרו כל צינור והפכו אותו בעדינות כמה פעמים כדי לוודא שהוא מעורבב כראוי.
השתמש בשיטה המועדפת לקביעת הריכוז והכדאיות של תרבית התאים המתקבלת כדי להתכונן לבדיקות הניסוי הבאות. הכדאיות ההתחלתית של קו התאים NK-92 וצפיפויות הישיבה הושוו לכדאיות הסופית ולריכוזי הקצה המתקבלים. לאחר טיפול SMG של 72 שעות, הושוו שני מקרים של תוצאות שליליות וחיוביות.
לשם השוואה, טווח הריכוז האופטימלי של קו התאים NK-92 שבו נעשה שימוש היה בין 0.3 ל-1.2 מיליון תאים למיליליטר עם זמן הכפלה של כיומיים-שלושה. ההתפשטות בקבוצת הטיפול ב-SMG הייתה שווה בקירוב בין קבוצות הביקורת והטיפול. פרמטרים אלה היו חיוניים להצלחת הניסוי במורד הזרם, והתאים שהתקבלו משתי קבוצות הביקורת תפקדו באופן דומה במבחני ניסוי במורד הזרם.
חשוב מאוד לעקוב ולהסביר את היווצרות הבועות במהלך הטיפול, במיוחד בתרבית התא הנתונה למיקרו-כבידה מדומה. היווצרות בועות גדולות עלולה לגרום להפרעה לדינמיקת הנוזלים בתוך כלי השיט, וזה למעשה ישלול את מצב המיקרו-כבידה המדומה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מספק מדריך שלב-אחר-שלב לגידול לימפוציטים בתנאי מיקרו-גרביטציה מדומית באמצעות מערכת לתרבית תאים סיבובית. שיטה זו נועדה להעמיק את ההבנה לגבי האופן שבו מיקרו-גרביטציה משפיעה על התנהגות תאי מערכת החיסון.
מרכיבי המחקר המרכזיים
תחום המדע
- טכניקות לתרבית תאים
- השפעות של מיקרו-כבידה על תאים
- אימונולוגיה
רקע
- הבנת התגובה החיסונית בחלל היא קריטית עבור משימות ארוכות טווח.
- ניתן להשיג סימולציה של מיקרו-כבידה על פני כדור הארץ, המהווה חלופה חסכונית לניסויים בחלל.
- תאי מערכת החיסון, כגון לימפוציטים, חיוניים לחקר שינויים פיזיולוגיים בתנאי מיקרו-גרוויטציה (כבידה אפסית).
- שיטה זו מאפשרת ניסויים מבוקרים ללא המורכבויות הכרוכות בנסיעות לחלל.
מטרת המחקר
- לבחון את ההשפעות של מיקרו-כבידה מדומית על התנהגות לימפוציטים.
- לפתח שיטה מהימנה לחקר תגובות חיסוניות בסביבת מיקרו-כבידה.
- לספק לחוקרים גישה מעשית לסימולציה של תנאי חלל על פני כדור הארץ.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במערכת תרבית תאים סיבובית.
- כלי תרבית חד-פעמיים ייעודיים לצמיחת לימפוציטים.
- מילוי זהיר של הכלים למניעת גלישה והיווצרות בועות.
- הסרה ראשונית של בועות והבטחת מילוי מלא של הכלים.
תוצאות עיקריות
- תרבית מוצלחת של לימפוציטים בתנאי מיקרו-גרביטציה מדמה.
- תובנות לגבי התנהגות תאי מערכת החיסון בתנאי מיקרו-גרביטציה.
- הדגמה של היתכנותה של שיטת תרבית זו.
- יישומים פוטנציאליים למחקרי ביולוגיה של החלל בעתיד.
מסקנות
- שיטה זו מספקת כלי בעל ערך לחקר ההשפעות של מיקרו-כבידה על תאי מערכת החיסון.
- זוהי חלופה חסכונית לביצוע ניסויים בחלל.
- מחקרים נוספים יכולים להרחיב את ההבנה של הפיזיולוגיה האנושית בסביבות חלליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תרבית של לימפוציטים בתנאי מיקרו-גרביטציה סימולטיבית באמצעות מערכת תרבית תאים מסתובבת מאפשרת חקירה מבוקרת של תפקודי תאי מערכת החיסון תחת תנאים דמויי חלל, ובכך היא ממלאת פער קריטי במחקרים אימונולוגיים קרקעיים. יכולת זו תומכת בביטחון חיזוי בהבנת המודולציה של מערכת החיסון הרלוונטית הן לטיסות בחלל והן למודלים של מחלות על פני כדור הארץ. השחזוריות והיכולת להרחבה של השיטה ממצבות אותה כנכס אסטרטגי למסלולי גילוי מוקדם ומחקר טרנסלציונלי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של איתות ותפקוד של תאי מערכת החיסון תחת כבידה משתנה, ובכך מבהיר תגובות של מסלולים ביולוגיים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מידול גורמי סטרס סביבתיים הרלוונטיים לפיזיולוגיה האנושית.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות עבור אסטרטגיות למודולציה של מערכת החיסון.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין תרביות לימפוציטים שעברו תיקוף עבור בדיקות תפקודיות ופנוטיפיות המשך.
- מסטנדט את תנאי התרבית כדי להבטיח הדירות ותוצר כמותי לאורך הניסויים.
- מאפשר הערכה מהימנה של הפרעות גנטיות או תרופתיות בתנאי מיקרו-כבידה סימולטורית.
מחקר תרגומי ו-Preclinical
- מתואם עם מודלים הרלוונטיים למחלות של הפרות בוויסות החיסוני ומחקרי הסתגלות למתח.
- תומך ברצף החומרי מהשלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני של התערבויות מווסתות חיסון.
- מספק הפחתת סיכונים חזויה (de-risking) לפיתוח סממנים ביולוגיים תרגומיים בהקשרים של כבידה משתנה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו לתרבית מסובבת משלבת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני, ומאפשרת מחקרים מונחי-השערה על הסתגלות ותפקוד של תאי מערכת החיסון.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי איתות של תאי מערכת החיסון והסתגלות למעגש סביבתי.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך פיתוח בדיקות המשך.
- אנליזה: מספקת מדדי חיוניות תאים, שגשוג ותוצרי תפקוד לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאי הגילוי למודלים פרה-קליניים של הפרעה בתפקוד מערכת החיסון.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר למחקרים מגוונים על תאי מערכת החיסון ומעגש סביבתי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במידול תגובה של תאי מערכת החיסון ובתיקוף יעדים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה והרחבה של תרביות תאי מערכת החיסון תחת סימולציה של מיקרו-כבידה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או עצירה (go/no-go) עבור נכסים מווסתי-חיסון תחת דחק סביבתי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעודים מותאמי סיכון של תוכניות גילוי ותרגום הקשורות למערכת החיסון.
שיקולים ביישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים סטריליות ובהפעלת כלי סיבוב (rotary vessel).
- נחושה גישה למערכות תרביות תאים מסתובבות ואינקובטורים תואמים.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין הצוותים לטיפול בכלי הסיבוב ולניהול בועות.
- ניתן להתאמה לסוגים שונים של תאי תליה באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- היווצרות בועות ותקינות הכלי הן מגבלות מעשיות קריטיות שיש לנטר.
שאלות נפוצות בביופרמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Preparation of Vessels for Cell Culture
1:43
Loading Vessels with Stock Cell Culture
4:42
Removing Bubbles from the Vessels
5:47
Attaching the Vessel to the Rotating Base
6:36
Treatment and Harvesting Cells from the Vessels
8:06
Results: Application of the Rotary Cell Culture System to Study the Effects of Simulated Microgravity on Lymphocytes
8:55
Conclusion
