רישום של סידן חולף בצומת נוירומוסקולרי עכבר עם רזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית
1 בדצמבר 2021
הפרוטוקול מתאר את השיטה של העמסת צבע סידן פלואורסצנטי דרך העצב החתוך לתוך מסופי העצבים המוטוריים של העכבר. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לרישום ארעי סידן מהירים בקצות העצבים ההיקפיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
הערכה של רמת סידן קדם-סינפטית היא משימה מרכזית בחקר ההעברה הסינפטית. חקר איתות הסידן חשוב גם למציאת דרכים לטיפול במחלות נוירודגנרטיביות. היתרון העיקרי של טכניקת הטעינה המוצגת הוא שהכתמים בוצעו רק עבור תאי העניין.
השיטה שלנו לרישום עקשנות סידן מספקת רזולוציה מרחבית-טמפורלית טובה ביותר. שיטת הרישום המוצגת יכולה להועיל לנוירופיזיולוגים שצריכים לרשום תהליכים תקופתיים מהירים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. השלב הקשה ביותר בטכניקת הטעינה הוא החזקת העצב בתוך הפיפטה.
הקוטר של פיפטה חייב להיות בכושר מושלם, אז לעשות כמה כמה. לדעת את כל השלבים בפרוטוקול הם מסובכים להפגין כל אחד מהם יעזור הרבה. מתחילים בקיבוע רקמת השריר של הלבטור auris longus בצורה מעט מתוחה בצלחת פטרי המצופה אלסטומר עם סיכות הנירוסטה העדינות ומוסיפים את התמיסה של רינגר לצלחת עד לכיסוי מלא של השריר.
לאחר מכן, השתמש במושך מיקרופיפטה כדי להכין מיקרופיפטה עם קצה חד עדין להקלטות התוך-תאיות. השתמש נימים ללא חוטים פנימיים. לאחר ניקוד המחדד עם שוחקים, נתקו את קצה המיקרופיפטה, והשאירו קצה פתוח לקוטר של כ-100 מיקרומטר.
לאחר מכן, להבריק את הקצה עד שהקוטר הפנימי מתכווץ מ-80 מיקרומטר ל-12 מיקרומטר. בסיום, חברו צינור סיליקון לצד אחד ומזרק ללא מחט לצד השני של פיפטה המילוי. תחת מיקרוסקופ סטריאו, מצא היכן גזע העצבים הופך לענפי עצב נפרדים.
מניחים את פיפטה המילוי על צלחת פטרי באמצעות שעווה ולאחר מכן להזיז את קצה פיפטה עד שהוא עומד מעל העצב. חותכים את העצב קרוב לסיבי השריר במספריים עדינים, ומשאירים חתיכה קטנה מגדם העצב, באורך של כמילימטר אחד. לאחר מכן, שאפו את גדם העצבים עם תמיסה כלשהי של רינגר לתוך קצה פיפטה המילוי, מבלי לצבוט את העצב.
לאחר שתסיים, הסר את צינור הסיליקון מהפיפטה המלית. מאוחר יותר, השתמש מזרק עם נימה ארוכה כדי לצייר את פתרון העמסת צבע. לאחר מכן, הכנס את קצה החוט עם תמיסת ההעמסה לתוך פיפטה מילוי ולשחרר את התערובת על גדם העצב, ולאחר מכן דגירה של הכנת העצב בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות.
לאחר הדגירה, שוטפים את ההכנה העצבית בתמיסה טרייה של רינגר לפני שמטפלים בה ב-50 מיליליטר של תמיסה של רינגר בכוס זכוכית בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. עבור המיקרוסקופיה הקונפוקלית, הרכיבו את ההכנה העצבית לתוך תא ניסוי מצופה סיליקון אלסטומר וקבעו אותו, מתוח מעט, עם סט של מיקרונידלים מפלדה. לאחר מכן, יש לשטוף את התכשיר באופן נרחב עם תמיסת הצלצול.
התקן אלקטרודת יניקה על התא. לאחר הרכבת תא ההכנה על במת המיקרוסקופ, הכניסו את אביזרי הכניסה והיציאה לתא. הפעל מערכת מונעת זרימת כבידה כדי להסיר את התמיסה העודפת מההכנה.
לאחר שתסיים, חבר את אלקטרודת היניקה הממריצה לממריץ חשמלי וודא כי התכווצויות השרירים מתרחשות לאחר גירויים. לאחר מכן, מלאו את מערכת הזלוף בתמיסה של רינגר המכילה 10 מיקרומולר d-טובוקוררין והפעילו את משאבת היניקה כדי להתחיל בזליפה. במיקרוסקופ הקונפוקלי לסריקת לייזר, או בתוכנת LSCM, בחר אלקטרופיזיולוגיה ומצב רכישה כדי להגדיר פרמטרים של הדמיה.
בהגדרות תפריט העבודה, בחר את הגדרות ההדק כדי להפעיל את הגירוי באמצעות פולס הסנכרון של המיקרוסקופ והגדר את ההדק בשדה המסגרת לערוץ OUT 1. העבר את מצב הסריקה ל- XYT בתדירות סריקה של 1, 400 הרץ. מקדם הזום צריך להיות 6.1 כאשר חור הסיכה פתוח במלואו.
ודא שמצב X רציף, מעבר, דו-כיווני מופעל, ולאחר מכן, הגדר את הזמן המינימלי ליצירת מסגרת ב- 52 אלפיות השנייה ואסוף מסגרות בסרטון גולמי ב- 20 מסגרות. הגדר את אורך גל העירור של לייזר הארגון ב-488 ננומטר עם 8% מעוצמת היציאה. כאשר הפרמטרים מוגדרים, לחץ על לחצן מצב חי כדי לקבל תצוגה מקדימה חיה של מסופי העצבים הטעונים בצבע.
במצב חי, חפש את אזור העניין, או החזר ההשקעה, כדי להשיג את המיקוד הטוב ביותר. לאחר מכן, הזז את ההשהיה על הגירוי בשתי אלפיות השנייה פחות ביחס לערך הקודם והפעל את תוכנת רכישת הנתונים כדי לרכוש 26 רצפים על ידי הזזת כל רצף שתי אלפיות השנייה מהקודם. כדי לעבד את הסרטונים שצולמו, הפעל את Leica Application Suite X, או את תוכנת LAS X, ופתח את הפרויקט שנוצר.
לאחר מכן, לחץ על ייצוא ושמור בשם כדי לשמור מסגרות בפורמט TIF בתיקיית היעד. לאחר מכן, הפעל את תוכנת ImageJ ולחץ על קובץ, ייבוא ורצף תמונות. בחלון רצף התמונות הפתוח, בחרו בתיקיית היעד ופתחו את המסגרת הראשונה.
מתוך אפשרויות הרצף, עבור לשדה התמונה ההתחלתי והגדר את מספר המסגרת לאחד עבור המסגרת הראשונה. לאחר מכן, בשדה ההפרש הקבוע, הגדר את הערך השווה למספר המסגרות בהקלטת האות הראשונית לפני לחיצה על אישור. כדי לשמור את הקובץ שנוצר של מסגרות ראשונות תפורות בתיקייה נפרדת, לחץ על כרטיסיות הקובץ, השמירה והתיקייה לפי הסדר.
חזור על ההליכים עבור 19 מסגרות על-ידי הגדרת מספר המסגרת המתאים בשדה התמונה הפותח. כשכל התמונות מתקבלות, לחצו על קובץ, ייבוא ורצף תמונות כדי לבחור אחת מהן בשדות התמונה ההתחלתית וההפרש הקבוע. ניתן לראות את הסרטון הסופי עם כל הפריימים תפורים יחד ברזולוציה זמנית מוגברת.
לאחר מכן, שמור את קובץ הווידאו בפורמט TIF. כדי לנתח את הסרטון התפור, לחץ על תמונה, ערימות, כלים וסדרן ערימה. לאחר מכן, עבור אל ניתוח, כלים ומנהל ROI.
גרור ושחרר את קובץ ה- TIF שנשמר בעבר בחלון ImageJ ולאחר מכן הרחב את התמונה לתצוגה טובה יותר. כדי לשפר את הדמיית התמונה, לחץ על התמונה, התאם, כדי להפוך את ניגודיות הבהירות לאוטומטית. הגדר את הרקע קרוב למסוף העצבים על ידי משיכת ROI והוספת ערך למנהל ההחזר על ההשקעה.
לאחר מכן, חשב את הרקע על ידי לחיצה על עוד ורב מדידה. העתק ערכים ממוצעים להדבקה בתוכנית הגיליון האלקטרוני. לאחר מכן, חשב את הערך הממוצע.
לאחר מכן, הפחת את הערך הממוצע המחושב מהערימות על ידי לחיצה על תהליך, ראשי וחיסור. הזן את הערך המתקבל וצייר ROI סביב מסוף עצבים באמצעות קו מצולע לפני הוספתו למנהל החזר ההשקעה. מדוד את העוצמה החולפת של מסוף העצבים על ידי לחיצה על כרטיסיות נוספות ורב-מדידות.
לאחר מכן, העתק את ערכי העוצמה הממוצעת והדבק אותם בתוכנית הגיליון האלקטרוני כדי לחשב את ההסטה הממוצעת של אותות. חלק את ערכי האות בערך ההסטה הממוצע. מהערך המתקבל, הפחת אחד ולאחר מכן הכפל ב- 100% ואחריו התוויית גרף ארעי סידן כדי לקבוע את המשרעת.
לאחר טעינת ההכנה העצבית עם צבע, רוב הסינפסה ממוקמת קרוב לגדם העצב, הצביע על רמה מספקת של פלואורסצנציה. לאחר עיבוד התמונה התקבלו ארעיות סידן ברזולוציה המרחבית והזמנית הרצויה. אחד השלבים החשובים ביותר בפרוטוקול זה הוא שיש למקם את גדם העצב בתמיסה המכילה צבע בדקות הראשונות לאחר חיתוך העצב.
שיטה זו יכולה לשמש כדי לטעון צבעים שונים ותרופות לתוך נוירונים מוטוריים. פרוטוקול הרישום יכול להיות שימושי להערכת סידן בדנדריטים ובעמוד השדרה בהכנות CNS. הטכניקה שלנו מאפשרת לרשום אות סידן ברזולוציה מרחבית וזמנית טובה.
חקר ארעיות סידן הוא כלי רב עוצמה בוויסות מחקרי של שחרור מוליך עצבי ופלסטיות סינפטית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להחדרת צבע פלואורסצנטי לסידן אל תוך סיומות של עצבי תנועה בעכברים, וטכניקה ייחודית להקלטה של מעברים מהירים של סידן בסיומות של עצבים פריפריאליים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. המחקר מתמקד בהערכת רמות הסידן הפרסינפטיים כדי לשפר את ההבנה של התמסורת הסינפטית, החיונית לפיתוח טיפולים למחלות ניווניות של מערכת העצבים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- נוירופיזיולוגיה
- איתות סידסיום
- העברה סינפטית
רקע
- הצורך להעריך רמות סידן פרה-סינפטיות במחקרי תמסורת סינפטית.
- תפקידו של סיגנל הסידן בטיפול במחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- האתגר בביצוע רישומים תוך-תאיים מדויקים מקצות עצבים מוטוריים של עכבר.
מטרת המחקר
- להדגמת שיטה יעילה להחדרה תוך-תאית של צבע סידן לסיומי עצב.
- להצגת טכניקה להקלטת תנודות סידן ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפלטפורמה העיקרית המשמשת להקלטת נתוני הדמיה היא מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- המודל הביולוגי התמקד בעצות עצב מוטוריות של עכבר.
- טכניקות מיקרופיפטה, הכוללות ייצור מדויק ותמרון סביב העצב, הן שלבים קריטיים.
- הכנת העצב כוללת נהלי טיפול ספציפיים, הכוללים מתן תמיסת Ringer ודגירה.
תוצאות עיקריות
- טכניקת הטעינה מאפשרת צביעה יעילה רק בתאי המטרה.
- הושגה רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה בהקלטת מעברי סידן מקצות עצביים.
- השיטה מדגימה פוטנציאל לרישום תהליכים מחזוריים מהירים הרלוונטיים לנוירופיזיולוגיה.
מסקנות
- מחקר זה מדגים פרוטוקול בעל ערך להבנת הדינמיקה של סידן לפני-סינפטי.
- לממצאים יש השלכות על מנגנונים עצביים, והם מציעים תובנות חדשות לגבי תהליכי העברה סינפטית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
רישום ברזולוציה גבוהה של תנודות סידן פרה-סינפטיות בצומת העצבי-שרירי מאפשר בחינה מדויקת של מנגנוני ההעברה הסינפטית, ותומך בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים של מחקר בביולוגיה של מערכת העצבים. יכולת זו מגבירה את רמת הביטחון החיזויית בניתוח מסלולים ומספקת בסיס לקבלת החלטות מותאמות סיכון עבור תיקי מחקר של מחלות ניווניות של מערכת העצבים. הנאמנות המרחבית-זמנית של השיטה ממצבת אותה כנכס רב-פעמי להפחתת סיכונים מכניסטיים ולהמשכיות תרגומית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה כמותית של דינמיקת הסידן הפרהסינפטית, החיונית לתיקוף של מטרות ניתוב מוליכים עצביים.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי הבהרת הרצף הזמני של אירועים סינפטים תלויי סידן.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מדידה ישירה של זרימת סידן המעוררת על ידי גירוי.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק מערכת מוכחת להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנודות סידן (calcium transients) באוכלוסיות נוירונליות מוגדרות.
- מאפשר כימות בר-שחזור של תגובות סידן, התומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובזרימות עבודה של סריקות המשך.
- מספק פלטים כמותיים המתאימים לניתוח השוואתי של הפרעות פרמקולוגיות או גנטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מודלים רלוונטיים למחלה על ידי התאמת הערכה של מנגנוני פלסטיקות סינפטית המעורבים בניוון עצבי.
- תומך בפיתוח של ביומרקרים תרגומיים באמצעות מדידה ישירה של נקודות קצה סינפטיות תפקודיות.
- מסייע ברציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות אספקת תוצאים כמותיים ורובסטיים.
שילוב זרימת עבודה ותהליכי עיבוד (Pipeline)
שיטת דיוור calcium המבוססת על מיקרוסקופיה קונפוקלית זו משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשרת בין מחקרים מכניסטיים למחקר תרגומי בנוירוביולוגיה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ויסות סידן פרה-סינפטי ומנגנוני שחרור מתווכי שליח עצביים.
- סריקה: מספקת דימיון הניתן לשחזור של תנודות סידן, המוכנה לבדיקה (assay), לצורך סריקה גנטית או סריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת חילוץ כמותי של אמפליטודה, קינטיקה ורמות סידן בסיסיות לצורך השוואה סטטיסטית איתנה.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ממצאים מכניסטיים למודלים של תפקוד סינפטי לקוי הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה זרימת עבודה סטנדרטית הניתנת להתאמה להכנות נוירונליות שונות ולשאלות ניסיוניות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות סינפטיות ובמחקרים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה של דימות סטנדרטיות, הניתנות לשחזור ובעלות יכולת הרחבה לאימוץ על ידי צוותים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתיקי פיתוח למחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מטרות ומסלולים סינפטיים לצורך קידום.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית ובטכניקות מדויקות לטיפול בעצבים.
- נדרשת גישה לפלטפורמות דימוי במהירות גבוהה ותוכנות מתקדמות לניתוח תמונות.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין הצוותים בכל הנוגע לטעינת הצבע ולפרמטרי הדימוי.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול למערכות נוירונליות אחרות באמצעות אופטימיזציה של התאימות לרקמה ולצבע.
- התהליך תלוי בשמירה על חיוניות העצב ובתזמון מדויק במהלך יישום הצבע והדימוי.
