מערכת מיקרופיזיולוגית לחקר אינטראקציה תאי לויקוציטים-אנדותל במהלך דלקת

אינטראקציות תאי לויקוציט-אנדותל ממלאות תפקיד חשוב במחלות דלקתיות כגון אלח דם. דיסרגציה דלקת לעתים קרובות גורם שונה תפקוד מחסום אנדותל כלי דם וסקולרי וסחר לויקוציט מוגזם, אשר יכול לגרום נזק לאיברים. הבדיקה המיקרופלואידית הביומימטית, מה שאנו מכנים bMFA, משחזרת טופוגרפיה ותנאי זרימה של רשתות מיקרו-וסקולריות in-vivo ומאפשרת הערכה בזמן אמת של הידבקות מתגלגלת ומוצקה, התפשטות ונדידה של נויטרופילים לתא הרקמות.

כוחה של הבדיקה המיקרופלואידית הביומימטית היא היכולת להשתמש בתאים אנושיים ראשוניים ובדגימות מטופלים רלוונטיות מבחינה קלינית כדי להגביר את התרגום הקליני ולסנן במהירות טיפולים פוטנציאליים פוטנציאליים. מי שידגים את הנהלים יהיה מר צ'ינגליאנג יאנג, עוזר מחקר לתואר שני מהמעבדה שלי. התחל להכניס את הצינור באורך של כ-2.5 ס"מ בתוך היציאות באמצעות מלקחיים עדינים, למעט יציאת כניסה אחת.

בעזרת מלחצי לסתות, הידקו את שתי יציאות השקע ואת תא הרקמות יחד. לדלל את פתרון מלאי פיברונקטין ל 100 מיקרוגרם למיליליטר עם PBS. טען מזרק מיליליטר אחד מחובר מחט קהה 24 מד עם פתרון פיברונקטין מדולל ולחבר את המזרק לצינור באורך ארבעה סנטימטרים.

הכנס את הצינורות ליציאת הכניסה הפתוחה, ולאחר מכן דחף את הבוכנה עד פיברונקטין אנושי משתחרר מיציאת כניסה אחרת ומהדק אותו. חזור על התהליך עבור היציאות הנותרות עד שכל הערוצים, תא הרקמות והצנרת יתמלאו בתמיסת הפיברונקטין האנושית. הסר את המחט אך שמור את הצינורות באורך 15 ס"מ מוכנסים ולא מסומנים.

כדי לבצע הסרת גזים, חבר את הצינורות הלא מסומנים לפריימר הפנאומטי המחובר למיכל חנקן דחוס בלחץ של 5 פאונד לאינץ 'מרובע במשך 15 דקות. תחת המיקרוסקופ, ודא כי אין בועות אוויר לכודים בתוך הערוץ או תא הרקמה ולחבר מחדש את המכשיר אם בועות האוויר קיימות. הסר את המכשיר מהפריימר הפנאומטי ודגר אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.

באמצעות מדיה של תרבית תאי אנדותל מיקרו-וסקולרית של הריאה האנושית שחוממה מראש, יש לשטוף את כל הערוצים ותא הרקמות. לאחר קצירת תאי האנדותל כמתואר בכתב היד של הטקסט, גלה את התאים על ידי צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 150 פעמים G.In משאבת מזרק לתכנות, להרכיב מזרק מיליליטר אחד ולחבר את הצינורות למחט קהה. צייר כ -20 מיקרוליטרים של ההשעיה התא לתוך הצינורות מבלי לתת לו לתוך חבית המזרק.

הסר את המהדק מיציאת היציאה של ההתקן. חבר את הצינורות ליציאת הכניסה מבלי להכניס בועת אוויר לתעלה. עצרו את המשאבה עם קצב זרימה של 4 עד 8 מיקרוליטרים לדקה והתבוננו מתחת למיקרוסקופ.

עצור את המשאבה כאשר הערוצים מלאים בתאים. מהדקים את השקע וחותכים את צינורות הכניסה. מניחים את המכשיר באינקובטור במשך ארבע שעות ב 5% פחמן דו חמצני ו 37 מעלות צלזיוס.

לאחר ארבע שעות של דגירה, הכינו מזרק נוסף ומלאו אותו במדיה טרייה של תרבית התאים. הר את המזרק במשאבת מזרק וחבר אותו ליציאת הכניסה. הסר את המלחציים מיציאת השקע.

העבירו את המדיה הטרייה דרך המכשיר למשך כחמש דקות בארבע עד שמונה מיקרוליטרים לדקה כדי להסיר את התאים הצפים או הלא מחוברים. הכן מזרק על-ידי מילויו במדיה רעננה של תרבית תאים. התקן את המזרק במשאבת מזרק וחבר אותו ליציאת כניסה אחת תוך שמירה על יציאת המוצא פתוחה.

מניחים את המכשיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% דו תחמוצת הפחמן. לתכנת את משאבת המזרק עבור culturing תאי אנדותל תחת זרימה כמתואר בכתב היד של הטקסט. באמצעות מיקרוסקופ, בדוק את bMFA לאחר 48 שעות של תרבות תחת זרימה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית הצביעה על כך שכל המשטחים של ערוצי כלי הדם כוסו על ידי תאי אנדותל, ויצרו לומן תלת-ממדי שלם ב- bMFA. לאחר הכנת שלושה התקני bMFA שונים, טען שלושה מזרקים של מיליליטר אחד עם מדיה של תרבית תאים או TNF-אלפא או TNF-אלפא בשילוב עם מעכב דלתא PKC בהתאמה, שם TNF-אלפא וציטוקינים דלקתיים משמשים להמרצת תאי אנדותל ונויטרופילים. מעכב דלתא PKC הוא מעכב אנטי דלקתי חדשני.

חבר את שלושת המזרקים שנטענו לשלושה התקני bMFA. באמצעות חוצץ TNF-אלפא או TNF-אלפא עם מעכב נוסף, לטפל בתאי אנדותל מיקרווסקולריים ריאות אנושיות במשך ארבע שעות ב 0.1 microliters לדקה. לאחר בידוד הנויטרופילים האנושיים כמתואר בכתב היד של הטקסט, resuspend הנויטרופילים ב 999 מיקרוליטרים של חיץ HEPES ולהוסיף מיקרוליטר אחד של 10 מילימולרי CFDA SE פתרון מלאי צבע להשעיה, וכתוצאה מכך פתרון עבודה 10 מיקרומולרי של CFDA SE ודגר אותו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לשטוף את התאים פעמיים עם מאגר HEPES על ידי צנטריפוגת הפתרון במשך חמש דקות ב 315 פעמים G.לאחר ספירת התאים, resuspend ב 2 מיליון נויטרופילים למיליליטר במדיה תרבית התא או TNF-אלפא או TNF-אלפא הוסיף עם מעכב דלתא PKC ודגר בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. מלא את המזרק במיקרומולר אחד של מושך כימותרפיה, fMLP, שהוכן במדיה של תרבית התאים. פתח כניסה אחת ויציאת שקע אחת של bMFA.

הסר את צינורות היציאה מתא הרקמה והכנס את צינורות fMLP. הזרקו כ-20 מיקרוליטרים של fMLP לתא הרקמות עבור כל ה-bMFA, והותירו את זה שטופל במדיה של תרבית התאים. חותכים את הצינורות ומהדקים אותם.

גדוש את המזרק בכ -200 מיקרוליטרים של השעיית נויטרופיל ולהרכיב את המזרק על משאבת המזרק. לאחר הנחת ההתקן על במת מיקרוסקופ הפוכה, הגדר את קצב הזרימה במיקרוליטר אחד לדקה והפעל את המשאבה. המתינו עד שטיפה קטנה של מתלי הנויטרופיל תצא מהצינורות ותכניסו את הצינורות ליציאת הכניסה.

נויטרופילים בעלי תווית פלואורסצנטית זורמים לערוצי כלי הדם ומקיימים אינטראקציה עם תאי אנדותל ותנאי הזרימה הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. לאחר 10 דקות מתחילת הניסוי, פתחו את תוכנת ניתוח התמונה, החליפו את העדשה האובייקטיבית ל-10x והשתמשו בג'ויסטיק הבמה כדי למרכז את המכשיר מתחת למיקרוסקופ. כדי להשיג את מפת ההדבקה, עבור אל רכוש, לחץ על סרוק תמונה גדולה.

חלון חדש צץ. בחר עדשת 10x Objective והגדר את אפשרות השדה, לדוגמה, 5 על 3. לחץ על סריקה, לחץ על קובץ ושמור את מפת ההדבקה.

כדי להשיג את מפת ההעברה לניתוח העברה, מרכז את ההתקן מתחת למיקרוסקופ באמצעות ג'ויסטיק הבמה. לחץ על תצוגה, פקדי רכישה, רכישת ND. חלון חדש צץ.

הגדר את הנתיב לשמירת הקובץ והקלד את שם הקובץ. בדוק פונקציית תמונה גדולה, הגדר אזור סריקה, לדוגמה, 5 על 3. בדוק את הפונקציה Time, הגדר את מרווח הזמן כחמש דקות ואת משך הזמן כ- 60 דקות.

קח תמונות לשגות זמן של תא הרקמה, עם תמונה אחת שצולמה כל חמש דקות במהלך השעה הבאה. סימולציית CFD מציגה את דפוס הזרימה למינארית בתעלות כלי הדם, למעט אזורי bifurcation שבהם דפוס הזרימה מופרע. לאחר ביצוע בדיקת מיקרופלואידים ביומימטיים, תמונות ניגוד פאזה חשפו כי המשטחים של ערוצי כלי הדם היו מכוסים בתאי אנדותל, ומיושרים לכיוון זרימת הגזירה לאחר 48 שעות של תרבות.

הדמיית פלואורסצנטיות בוצעה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, המציינת כי תאי האנדותל יוצרים לומן תלת מימדי מלא ב- bMFA הושגה מפת הידבקות נויטרופיל, אשר חשפה כי יש הידבקות משמעותית של נויטרופילים לתאי אנדותל ב- bMFA. מפת נדידת נויטרופילים ב- bMFA חשפה כי עם הפעלת TNF-אלפא, נדידה ניכרת של נויטרופילים מתרחשת בתוך תא הרקמה, בעוד שלא נצפתה הגירה כזו ללא הפעלת TNF-אלפא. מפת הידבקות התואמת את ההתפלגות המרחבית של נויטרופילים עם קצב הגזירה הראתה כי הידבקות נויטרופיל התרחשה באופן מועדף בכלי שיט עם קצב גזירה נמוך ובסמוך לאזורי ביפורציה.

יתר על כן, טיפול TNF-אלפא מגביר באופן משמעותי הידבקות, אשר היה מעוכב עם מעכב הדלתא PKC. ניתוח תמונות לשגות זמן הצביע על כך שהפעלת TNF של תאי אנדותל מגבירה את נדידת הנויטרופילים בתגובה ל- fMLP, ואילו הטיפול במעכב הדלתא של PKC הפחית את ההגירה בהשוואה לתאים שטופלו ב- TNF-alpha. לכן, bMFA יכול לשמש כדי לבדוק את היעילות של טיפול חדשני לטיפול במחלות דלקתיות.

bMFA יכול לשמש גם כדי ללמוד את שלמות האנדותל על ידי מדידת משתנים כגון חדירות והתנגדות חשמלית טרנס אנדותל, מה שנקרא TEER, וביטוי מולקולת הידבקות במהלך דלקת. הבדיקה המיקרופלואידית הביומימטית יכולה לחקות את המיקרו-סביבה של איברים שונים ואינה מוגבלת לסוגי תאים או מינים בודדים, ויכולה גם לדגמן תקשורת תאים/תאים קריטית לתפקוד האיברים ולמידול מחלות שונות.