qPCR מוכן לשימוש לזיהוי דנ"א מטריפנוזומה קרוזי או אורגניזמים פתוגניים אחרים

פרוטוקול הג'לציה מייצר תגובות qPCR מוכנות לשימוש המפחיתות את הזמן והשלבים הדרושים להתחלת ריצה. פרוטוקול זה מאפשר לייצר ולשלוט בתגובות qPCR עבור איכות וכמויות גדולות בבת אחת, ובכך להקטין את הסיכוי לטעות מפעיל במהלך חישובי מתכונים או aliquoting לתוך בארות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל qPCR כי הוא כבר אופטימיזציה מלאה בפורמט קפוא קונבנציונאלי.

הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה מכיוון ששניים משלבי בקרת האיכות העיקריים הם חזותיים. כדי להכין את תמיסת המליזיטוז, שקלו ארבעה גרם של מלזיטוז בצינור פלסטיק של 15 מיליליטר, הוסיפו שישה מיליליטרים של מים נטולי נוקלאז, ומערבבים במהירות המרבית עד שהאבקה מסיסה. הכינו את הנפח הסופי ל-10 מיליליטר עם מים נטולי נוקלאזים, ולאחר מכן תייגו ואחסנו את התמיסה בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים.

כדי להכין את תמיסת הטרהלוז, שוקלים ארבעה גרם של טרהלוז בצינור פלסטיק של 15 מיליליטר, מוסיפים שישה מיליליטר של מים נטולי נוקלאז ומערבבים במהירות המרבית עד שהאבקה מסיסה. לאחר מכן להמציא את הנפח ל 10 מיליליטר עם מים ללא נוקלאז ולסנן את הפתרון דרך מסנן 0.2 מיקרון. תייג ואחסן את התמיסה בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים.

כדי להכין את תמיסת הגליקוגן, שקלו שני גרם גליקוגן בצינור של 15 מיליליטר, הוסיפו שישה מיליליטרים של מים נטולי נוקלאזים, ומערבלו עד שהאבקה מתפרקת. שמור את התמיסה על שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס במשך שמונה עד 12 שעות מכיוון שסולוביזציה של גליקוגן מייצרת הרבה בועות. למחרת, הסרת התמיסה מן הדגירה, לפצות את הנפח ל 10 מיליליטר עם מים ללא נוקלאז ולאחסן את הפתרון המסומן בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס במשך עד שישה חודשים.

כדי להכין את תמיסת הליזין, שקלו 7.5 מיליגרם ליזין בצינור של 15 מיליליטר, הוסיפו שישה מיליליטר מים נטולי נוקלאזים, ומערבבים עד שהאבקה מסיסה. להמציא את נפח ל 10 מיליליטר עם מים ללא נוקלאז. סנן את התמיסה דרך מסנן של 0.2 מיקרון ואחסן בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים.

כדי להכין את תערובת ג'ליפיקציה, לערבב את הכמויות המתאימות של פתרונות מלאי בצינור פלסטיק 50 מיליליטר. ערבבו את הריאגנטים על ידי היפוך הצינור 10 פעמים ואחסנו את התמיסה המסומנת בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים. כדי להכין את תערובת המאסטר qPCR לג'לציה, הפשירו את הריאגנטים במיכל מקורר.

לאחר מכן ערבבו נפחים מתאימים של הריאגנטים בצינור של 1.5 מיליליטר כדי להכין מספיק תערובת מאסטר לרצועת שמונה צינורות או צלחת באר 96. הבא פיפטה 18.5 מיקרוליטר של מאסטר ג'ליפיקציה לערבב על כל תגובה היטב ומניחים את הצינורות או הצלחת בתמיכת מוליך חום בתוך תנור ואקום. אם אתם משתמשים ב-96 צלחות באר, הניחו שקית חימר בנטוניט אחת בתנור על כל שתי צלחות באר 96 לספיגת מים.

כאשר המחזור הושלם, בדוק את הצינורות או הצלחות לג'לציה נכונה של הריאגנטים על ידי כך שתוודא שהנפח מופחת באופן ניכר לכחמישה מיקרוליטרים והנוזלים אינם זזים בעת הקשה על הצינורות או הצלחות באצבעות. אטמו ואחסנו את הצינורות או הצלחות בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס למשך שמונה עד 12 שעות לפני השימוש. כדי להשתמש ב- qPCR הג'ל, הסר את רצועת הצינור או הצלחת מהמקרר ופתח אותה בתחנת עבודה למניפולציה לדוגמה.

הוסף 15 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז וחמישה מיקרוליטרים של דגימת DNA לכל כלי תגובה. אוטמים את הצינורות או הצלחות, מפעילים את הניסוי הרצוי ומבצעים ניתוח נתונים קבוע. בפרוטוקול הנוכחי, הטמפרטורה בתוך התא נשמרת קבועה ב -30 מעלות צלזיוס, בעוד הלחץ משתנה בין 910 ל 930 מיליבר ליד ואקום.

לאחר מחזור הוואקום, תערובת האב בתוך הצינור פוחתת בנפחה, הופכת לג'לציה בתחתית ואינה מתיזה על הקירות כאשר מקישים על הצינורות. אם הג'ליפיקציה אינה שלמה, הנוזל ניתז על דפנות הצינור בעת הקשה על הצינורות. זיהוי טריפנוסומה קרוזי-דנ"א באמצעות רצפי אוליגונוקלאוטידים שפורסמו מוצג כאן.

זיהוי של אותה דגימה כאשר הג'ליפיקציה לא בוצעה כראוי, הביא לאובדן רגישות. השלב הקריטי ביותר הוא חישוב נפח הריאגנטים לפני ג'ליפיקציה. על המפעיל לזכור לא להוסיף מים, שכן הוא יוסר במהלך התהליך.

אם עוקבים מקרוב אחר שלבי הפרוטוקול, מפעילים בעלי כישורי מעבדה וביולוגיה מולקולרית בסיסיים לא יתקשו לבצע את תהליך הג'ליפיקציה.