שימוש במיקרוסקופיה של 2-פוטונים כדי לכמת את ההשפעות של חסימת שופכה חד-צדדית כרונית על תהליכים גלומרולריים
4 במרץ 2022
כאן אנו מציגים פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופיה של 2 פוטונים בחולדות Wistar Fromter במינכן עם גלומרולי פני השטח כדי לכמת את ההשפעות של חסימת שופכה ממושכת על הדינמיקה והתפקוד של גלומרולרי.
הנתונים שהוצגו במחקר זה מראים את ההשפעות הדרמטיות של חסימת שופכה חד צדדית על תפקוד הכליות, דלקת ופיברוזיס. זה עוזר לנו להבין את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של חסימת שופכה חד צדדית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לחקור אינטראקציות בין תאים, אירועים תת-תאיים, ולקשר מבנה ותפקוד באופן דינמי בתוך כליה מתפקדת.
הדגמת הליך השופכה תיעשה על ידי ד"ר סילביה קמפוס-בילדרבק שהיא מנתחת במעבדתנו. כדי להתחיל, להרדים את החולדה, ולאחר מכן לבצע חתך לאורך קו האמצע ולאתר את הכליה השמאלית כדי להפריד אותה מאיברי הצפק שמסביב. לאחר איתור פדיקל הכליה, הכולל את עורק הכליה, וריד הכליה והשופכן, מפרידים את השופכן מבלי לפגוע במבנה העדין.
השתמש מלקחיים כדי לולאה ולקשור תפר 3-0 סביב השופכן, ולאחר מכן לקשור קשר כמה מילימטרים משני צדי הקשר הראשון כדי להבטיח חסימה מוחלטת. ברגע שהשופכן קשור, סגור בזהירות את שכבות השרירים העוקבות, ולאחר מכן סגור את הבטן לחלוטין. סגור את העור החיצוני עם סיכות כירורגיות.
להכנה כירורגית, הניחו את החולדה המורדמת עם קו גישה ורידי שוכן בצד כאשר האגף השמאלי המגולח פונה כלפי מעלה שטוח וישר על השולחן. ודאו שהכפות הקדמיות של החולדה נוגעות זו בזו וכך גם הכפות האחוריות. לאחר מיקום החולדה, מישוש את האגף השמאלי ממש מתחת לצלעות כדי להרגיש את הכליה ולקבוע את המיקום הטבעי בבטן, ולאחר מכן צייר קו באמצעות סמן קבוע לאורך האזור המגולח, חוצה את מרכז הכליה בכיוון האף אל הזנב.
השתמש בזוג מלקחיים משוננים כדי לתפוס ולהרים את העור כלפי מעלה ולצבוט את קו הסימון הקבוע עם זוג המוסטאטים כדי לרסק את כלי הדם שמתחת ולמנוע דימום. חזור על ההליך עבור שכבת השריר החיצוני הדק כדי למזער את הדימום. כדי לבצע את החתך הסופי של שכבת שריר הבטן הפנימית הדקה, למשש את הכליה כדי להעריך את הגודל והמיקום ולהרים את שכבת השריר הפנימית עם זוג מלקחיים, ולאחר מכן למחוץ קו החוצה את העור מעל הכליה עם hemostats כי הוא בערך 1/3 את הגודל המשוער של הכליה.
תוך שמירה על האחיזה בשכבת השריר עם המלקחיים, בצע את החתך הסופי. לאחר מכן, השתמש במלקחיים בכל יד כדי לאחוז ולהחזיק את שומן הכליות בקוטב התחתון של הכליה בטכניקת יד ביד הפועלת כלפי מטה. לאחר אחיזה איתנה על השומן ביד אחת, למשוך את השומן בעדינות רבה לסחוט את הכליה דרך החתך.
אם הכליה לא עוברת, בקלות להרחיב את החתך. כדי לזהות את תאי הדם הלבנים או ה-WBCs שנתקעו בלולאות הנימיות, יש לתת את הכתם הגרעיני של Hoechst 33342 ב-8 מיקרוגרם לקילוגרם של משקל חולדה דרך קו גישה ורידי שוכן. במיקרוסקופ, מניחים את הכליה החשופה על קצה המנה בסיבוב קל כך שצד הבטן של הכליה יוצר מגע עם החלק המכסה והצד הגבי פונה הרחק מהקצה.
כדי למזער עוד יותר את התנועה, לארוז שתי רפידות גזה סטריליות 2 על 2 רטוב עם מלוחים נגד הצד הגבי של הכליה מחזק את המגע של הצד הבטן של הכליה לקצה. כאשר הדגימה ממוקמת, התבונן דרך עינית המיקרוסקופ תחת תאורת אפיפלואורסצנציה באמצעות קוביית רודמין FITC בעלת מעבר כפול. אם מזוהה תנועה במצב הדגימה, בצע התאמות קלות על ידי התאמת הגזה כדי להבטיח שהיא לא תדחוף מתחת לכליה.
מגלגלים מעט את החולדה כך שבית החזה יהיה רחוק יותר מהמנה. סרוק את פני הכליה באמצעות תאורת אפיפלואורסצנציה וסמן את מיקומי הגלומרולי באמצעות התוכנה המשויכת לבקר הבמה הממונע. עבור כל ערוץ צבע תחת תאורת 2 פוטונים, צלם נפח תלת-ממדי רדוד של החלק העליון של כל גלומרולוס מסומן כדי לשמש כתמונת הרקע.
באפשרות התצוגה של תוכנת ההדמיה, השתמש בלוח צבעים פסאודו כדי לדמיין את העוצמות הקלושות של פלואורסצנטיות הרקע של הלולאות הנימיות הגלומרוליות. באמצעות כלי דם שטחי כנקודת המוקד, להחדיר באיטיות את אלבומין סרום טקסס רד ראפ או TRRSA תוך התבוננות בעלייתה ונפילתה של פלואורסצנציה עקב ההתפלגות המערכתית עד שעוצמה בכלי הדם הפריטובולאריים ולולאות נימי היא ממש מתחת לרוויה. לאחר 10 דקות, רכשו נפחים תלת-ממדיים עבור כל הגלומרולי המסומנים והמצולמים במרווחים של 1 מיקרומטר.
מצאו כלי מתאים, לולאה נימית או כלי פריטובולרי, ולאחר מכן סובבו את התמונה באמצעות פונקציית הסיבוב, שכן פונקציית סריקת הקו בתוכנת רכישת התמונה דורשת שהכלי יהיה בניצב. לאחר סיבוב הספינה ושכיבה שטוחה, בחר את פונקציית XT בתפריט רכישה והגדר אותה לסריקה של 4, 000 שורות. מניחים את הקו לרוחב הכלי כדי להיבדק עם מישור המוקד בקוטר המרבי של המקטע.
לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על התמונה ללא הפרדות צבע ובחר בכרטיסייה צלם תמונה כדי ליצור תמונת הפניה של האזור שבו צולמה סריקת הקו. לחץ מיד על התחלה כפתור כדי ללכוד את סריקת הקו של הספינה. מאוחר יותר, ייבא את סריקות הקווים לתוכנת עיבוד התמונה כדי לקבוע את קצב הזרימה של RBC.
תחת התפריט הנפתח מדידה, פתח את תיבת הדו-שיח הצג סטטיסטיקה של אזור ובחר בכלי ציור קו בודד כדי לצייר קו התואם לשיפוע של צללי RBC. לאחר ציון הרוחב והגובה של הקו, השתמש במשוואה כדי לחשב את המהירות, ולאחר מכן קבל ממוצע של חמישה חישובים כדי לדווח על המהירות עבור כל סריקת שורה. מרכזו גלומרולוס בתחום ההדמיה וקחו סט נתונים תלת-ממדי המתחיל במשטח הגלומרולרי ומסתיים ב-30 עד 35 מיקרומטר.
השתמש בגודל צעד של 1 מיקרומטר בכיוון Z. זהה את ה- WBCs על ידי השוואת ערוץ Hoechst הכחול עם ערוץ האלבומין האדום של טקסס על ידי חיפוש הרחקה של צבע אדום בלולאה הנימית וכתם גרעיני מתאים. אם ה- WBC נראה סטטי על פני שלושה מקטעים אופטיים, הגדר את התאים כדבוקים, ולאחר מכן דווח על הערכים כמופע לכל 10 מקטעים אופטיים מראש הגלומרולוס שצולמו במרווחים של 1 מיקרומטר.
מספר הגלומרולרים לכל שדה בחולדות Wistar Fromter או MWF במינכן הוגדל בקבוצת UUO במשך 5 שבועות מאשר בחולדות שלא טופלו. חולדות ספראג-דאולי, או חולדות SD, עברו ממצב ללא גלומרולי משטח ל-2.02 לכל שדה לאחר חמישה שבועות של חסימת שופכה חד-צדדית. תמונות משוחזרות תלת מימדיות נצפו כדי להציג את פני הכליה.
חסימת השופכה החד-צדדית בת 5 שבועות בחולדות SD לא גרמה לאזורים הדומים לאפיתליה צינורית רגילה כפי שניתן לראות בחולדות MWF, לא מטופלות, ובחלקן בחולדות UUO MWF בנות 5 שבועות. במחקר של הדינמיקה הכלית של כלי הדם, זרימת הדם הכלייתית הופחתה באופן משמעותי בקבוצות UUO MWF ו-SD במשך 5 שבועות, בהשוואה לחולדות שלא טופלו. מהירות ה-RBC בתוך הלולאות הנימיות הגלומרולריות ירדה משמעותית בחולדות UUO MWF ו-SD במשך 5 שבועות, בהשוואה לחולדות MWF שלא טופלו.
בנוסף, לחולדות MWF שלא טופלו היו פחות WBC לכל 10 מקטעים אופטיים מלמעלה, בעוד שהמספר גדל בחולדות UUO MWF של 5 שבועות וחולדות UUO SD של 5 שבועות. עם חסימת שופכה חד צדדית, נצפתה עלייה בחדירות אלבומין. הצטברות אלבומין בחלל באומן הייתה אינטנסיבית לאחר חסימת שופכה חד צדדית.
מקטע S1 אנדוציטוזה כמויות גדולות של אלבומין כפי שנצפה עם מצבים פיזיולוגיים בחולדות MWF שלא טופלו. לא ניתן היה לראות את אותה קליטה בחולדות MWF או SD לאחר 5 שבועות של חסימת שופכה חד צדדית. שיטות רבות ושונות כגון הדמיה חוזרת כדי לחקור תהליך לאורך זמן, קיבוע של אזור מסוים להדמיה, ולאחר מכן ניצול של הרקמה הקבועה כדי לבצע מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יותר יכול להיעשות בשילוב עם טכניקה זו.
הטכניקה נחשבת לטכנולוגיה משבשת. הוא מאפשר לחוקרים לענות על שאלות חדשות רבות. בכך סופקו תובנות חדשות והתקבלו נתונים משנים פרדיגמה.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופיית 2-פוטונים לבחינת ההשפעות של חסימה שתןית ממושכת על הדינמיקה והתפקוד הגלומרולרי בחולדות Munich Wistar Fromter. טכניקה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תאיות ועל תפקוד הכליות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- פיזיולוגיה של הכליות
רקע
- חסימה חד-צדדית של השופכן משפיעה באופן משמעותי על תפקוד הכליות.
- הבנת המנגנונים הפתופיזיולוגיים היא חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
- מיקרוסקופיה דו-פוטונית מספקת תובנות לגבי דינמיקה תאית בתוך הכליה.
- המחקר מתמקד בתפקוד הגלומרולרי ובדלקת.
מטרת המחקר
- לכימות ההשפעות של חסימה שופכנית ממושכת על תפקוד הכליות.
- לבחינת הדינמיקה של תפקוד הגלומרול באורגניזם חי.
- לשיפור ההבנה של הפתופיזיולוגיה של הכליה באמצעות טכניקות דימות מתקדמות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרוסקופיית פוטונים כפולה (2-photon microscopy) להדמיית גלומרולים.
- השראה של חסימה חד-צדדית של השופכן בחולדות.
- מתן Hoechst 33342 לזיהוי תאי דם לבנים.
- ניתוח קצבי זרימה של תאי דם אדומים באמצעות סריקות קו (line scans).
תוצאות עיקריות
- הדגימה שינויים משמעותיים בתפקוד הכליות לאחר חסימה.
- זיהתה אינטראקציות תאיות ותגובות דלקתיות בגלומרולים.
- סיפקה נתונים כמותיים על דינמיקת הגלומרולים.
- חשפה תובנות לגבי מנגנוני הפגיעה והתיקון הכליתיים.
מסקנות
- המחקר ממחיש בהצלחה את השפעת חסימת השופכן על תפקוד הכליות.
- מיקרוסקופיית 2-פוטונים היא כלי בעל ערך לחקר הפתופיזיולוגיה של הכליות.
- הממצאים תורמים להבנת המנגנונים של מחלות כליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מיקרוסקופיה כמותית של 2-פוטונים של תהליכים גלומרולריים במודלים של חסימה חד-צדדית כרונית של השופכן (UUO) מאפשרת מדידה ישירה של דינמיקה מיקרו-וסקולרית ותאית כלייתית in vivo. גישה זו מספקת ביטחון חזוי להפחתת סיכונים מכניסטיים ולתיקוף מטרות במחקר של מחלות כליות, ותומכת ברציפות תרגומית משלב הגילוי ועד להערכה פרה-קלינית. יכולתה של השיטה להבחין בשינויים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים דינמיים בתפקוד הגלומרולרי היא רלוונטית מאוד לתיקי מו"פ של ביו-פארמה המתמקדים במכניזמים של מחלות כליות ובבחינת היפותזות טיפוליות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של תגובות מיקרו-וסקולריות ותאיות גלומרולריות לפגיעה ולהתערבות פרמקולוגית.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות דלקת, חדירות ושינויים בזרימת הדם במודלים רלוונטיים למחלה.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי קישור שינויים מולקולריים לתוצאות פיזיולוגיות in vivo.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק קריאות כמותיות ומאומתות של זרימת דם גלומרולרית ופרי-טובולרית ושל חדירות אלבומין לצורך פיתוח בדיקות.
- מאפשר מדידה הדירה של כיווץ כלי דם (vasoconstriction), הרחבת כלי דם (vasodilation) ואינטראקציות תאיות המושרות על ידי תרופות בזמן אמת.
- תומך בסטנדרטיזציה של נקודות סיום הרלוונטיות למחלה לצורך סריקת תרכובות במודלים כלייתיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים למנגנוני מחלות בבני אדם באמצעות כימות של ביומרקרים תרגומיים כגון חדירות albumin והיצמדות WBC.
- מאפשרת קבלת החלטות על קידום מבוסס התאמה לסיכון על ידי אספקת תובנה מכניסטית לתהליכי פגיעה ושיקום כלייתיים.
- תומכת ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות שילוב של דימות דינמי עם גישות של ביומרקרים מולקולריים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקת השערות, הפחתת סיכונים מכניסטיים והערכה כמותית של תפקוד הכליות in vivo.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמתת את זרימת הדם הגלומרולרית, את החדירות ואת הדלקת כדי להבהיר מסלולי מחלה ולתקף מטרות טיפוליות.
- סקרים (Screening): מספקת נקודות קצה כמותיות הניתנות לשחזור להערכת השפעות של תרכובות על המיקרו-וסקולטורה הרנלית ועל דינמיקה תאית.
- אנליטיקה: מספקת מדידות ברזולוציה גבוהה של זרימת RBC, היצמדות של WBC ומקדמי סינון של אלבומין לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר טרנסלציונלי: מתאימה תוצאות של מודלים בבעלי חיים לסממנים ביולוגיים של מחלות בבני אדם, ובכך תומכת ברלוונטיות טרנסלציונלית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמת דימוי וכימות הניתנת לשימוש חוזר למגוון מחקרי מחלות כלייתיות והתערבויות טיפוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של מחלות כליות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי דימות וכבידה כמותיים לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון באמצעות אספקת נתונים מכניסטיים חסונים.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תעדוף של מטרות בכליות ומועמדים טיפוליים בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות תוך-חי (intravital imaging), בניתוחים בבעלי חיים ובניתוח כמותי של תמונות.
- דורש גישה למיקרוסקופיית 2-פוטון מתקדמת ולתשתית לעיבוד תמונות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הדימות ושל פרשנות הנתונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מודלים שונים של בעלי חיים או הקשרי מחלה שונים.
- פרשנות התוצאות עשויה להיות מוגבלת בשל שינויים ספציפיים למודל, כגון גלומרולוסי פנישאיים מושרים.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:55
Preparing the Munich Wistar Frmter or SD Rat for Unilateral Ureteral Obstruction (UUO) Surgery
1:53
Surgical Preparation for Intravital 2-Photon Imaging
4:04
Positioning the Rat for Imaging and Image Acquisition for Quantitative Analysis
6:16
Calculating Red Blood Cell Flow in Surface Glomerular Capillary Loops and Renal Vasculature Using a Linescan Function
7:45
Calculating White Blood Cell (WBC) Occlusion in Glomerular Capillary Loops
8:38
Results: Quantification of Glomerular Processes in the Unilateral Ureteral Obstruction (UUO) Model of Rats
10:56
Conclusion
