שימוש במיקרוסקופיה של 2-פוטונים כדי לכמת את ההשפעות של חסימת שופכה חד-צדדית כרונית על תהליכים גלומרולריים
March 4th, 2022
כאן אנו מציגים פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופיה של 2 פוטונים בחולדות Wistar Fromter במינכן עם גלומרולי פני השטח כדי לכמת את ההשפעות של חסימת שופכה ממושכת על הדינמיקה והתפקוד של גלומרולרי.
הנתונים שהוצגו במחקר זה מראים את ההשפעות הדרמטיות של חסימת שופכה חד צדדית על תפקוד הכליות, דלקת ופיברוזיס. זה עוזר לנו להבין את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של חסימת שופכה חד צדדית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לחקור אינטראקציות בין תאים, אירועים תת-תאיים, ולקשר מבנה ותפקוד באופן דינמי בתוך כליה מתפקדת.
הדגמת הליך השופכה תיעשה על ידי ד"ר סילביה קמפוס-בילדרבק שהיא מנתחת במעבדתנו. כדי להתחיל, להרדים את החולדה, ולאחר מכן לבצע חתך לאורך קו האמצע ולאתר את הכליה השמאלית כדי להפריד אותה מאיברי הצפק שמסביב. לאחר איתור פדיקל הכליה, הכולל את עורק הכליה, וריד הכליה והשופכן, מפרידים את השופכן מבלי לפגוע במבנה העדין.
השתמש מלקחיים כדי לולאה ולקשור תפר 3-0 סביב השופכן, ולאחר מכן לקשור קשר כמה מילימטרים משני צדי הקשר הראשון כדי להבטיח חסימה מוחלטת. ברגע שהשופכן קשור, סגור בזהירות את שכבות השרירים העוקבות, ולאחר מכן סגור את הבטן לחלוטין. סגור את העור החיצוני עם סיכות כירורגיות.
להכנה כירורגית, הניחו את החולדה המורדמת עם קו גישה ורידי שוכן בצד כאשר האגף השמאלי המגולח פונה כלפי מעלה שטוח וישר על השולחן. ודאו שהכפות הקדמיות של החולדה נוגעות זו בזו וכך גם הכפות האחוריות. לאחר מיקום החולדה, מישוש את האגף השמאלי ממש מתחת לצלעות כדי להרגיש את הכליה ולקבוע את המיקום הטבעי בבטן, ולאחר מכן צייר קו באמצעות סמן קבוע לאורך האזור המגולח, חוצה את מרכז הכליה בכיוון האף אל הזנב.
השתמש בזוג מלקחיים משוננים כדי לתפוס ולהרים את העור כלפי מעלה ולצבוט את קו הסימון הקבוע עם זוג המוסטאטים כדי לרסק את כלי הדם שמתחת ולמנוע דימום. חזור על ההליך עבור שכבת השריר החיצוני הדק כדי למזער את הדימום. כדי לבצע את החתך הסופי של שכבת שריר הבטן הפנימית הדקה, למשש את הכליה כדי להעריך את הגודל והמיקום ולהרים את שכבת השריר הפנימית עם זוג מלקחיים, ולאחר מכן למחוץ קו החוצה את העור מעל הכליה עם hemostats כי הוא בערך 1/3 את הגודל המשוער של הכליה.
תוך שמירה על האחיזה בשכבת השריר עם המלקחיים, בצע את החתך הסופי. לאחר מכן, השתמש במלקחיים בכל יד כדי לאחוז ולהחזיק את שומן הכליות בקוטב התחתון של הכליה בטכניקת יד ביד הפועלת כלפי מטה. לאחר אחיזה איתנה על השומן ביד אחת, למשוך את השומן בעדינות רבה לסחוט את הכליה דרך החתך.
אם הכליה לא עוברת, בקלות להרחיב את החתך. כדי לזהות את תאי הדם הלבנים או ה-WBCs שנתקעו בלולאות הנימיות, יש לתת את הכתם הגרעיני של Hoechst 33342 ב-8 מיקרוגרם לקילוגרם של משקל חולדה דרך קו גישה ורידי שוכן. במיקרוסקופ, מניחים את הכליה החשופה על קצה המנה בסיבוב קל כך שצד הבטן של הכליה יוצר מגע עם החלק המכסה והצד הגבי פונה הרחק מהקצה.
כדי למזער עוד יותר את התנועה, לארוז שתי רפידות גזה סטריליות 2 על 2 רטוב עם מלוחים נגד הצד הגבי של הכליה מחזק את המגע של הצד הבטן של הכליה לקצה. כאשר הדגימה ממוקמת, התבונן דרך עינית המיקרוסקופ תחת תאורת אפיפלואורסצנציה באמצעות קוביית רודמין FITC בעלת מעבר כפול. אם מזוהה תנועה במצב הדגימה, בצע התאמות קלות על ידי התאמת הגזה כדי להבטיח שהיא לא תדחוף מתחת לכליה.
מגלגלים מעט את החולדה כך שבית החזה יהיה רחוק יותר מהמנה. סרוק את פני הכליה באמצעות תאורת אפיפלואורסצנציה וסמן את מיקומי הגלומרולי באמצעות התוכנה המשויכת לבקר הבמה הממונע. עבור כל ערוץ צבע תחת תאורת 2 פוטונים, צלם נפח תלת-ממדי רדוד של החלק העליון של כל גלומרולוס מסומן כדי לשמש כתמונת הרקע.
באפשרות התצוגה של תוכנת ההדמיה, השתמש בלוח צבעים פסאודו כדי לדמיין את העוצמות הקלושות של פלואורסצנטיות הרקע של הלולאות הנימיות הגלומרוליות. באמצעות כלי דם שטחי כנקודת המוקד, להחדיר באיטיות את אלבומין סרום טקסס רד ראפ או TRRSA תוך התבוננות בעלייתה ונפילתה של פלואורסצנציה עקב ההתפלגות המערכתית עד שעוצמה בכלי הדם הפריטובולאריים ולולאות נימי היא ממש מתחת לרוויה. לאחר 10 דקות, רכשו נפחים תלת-ממדיים עבור כל הגלומרולי המסומנים והמצולמים במרווחים של 1 מיקרומטר.
מצאו כלי מתאים, לולאה נימית או כלי פריטובולרי, ולאחר מכן סובבו את התמונה באמצעות פונקציית הסיבוב, שכן פונקציית סריקת הקו בתוכנת רכישת התמונה דורשת שהכלי יהיה בניצב. לאחר סיבוב הספינה ושכיבה שטוחה, בחר את פונקציית XT בתפריט רכישה והגדר אותה לסריקה של 4, 000 שורות. מניחים את הקו לרוחב הכלי כדי להיבדק עם מישור המוקד בקוטר המרבי של המקטע.
לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על התמונה ללא הפרדות צבע ובחר בכרטיסייה צלם תמונה כדי ליצור תמונת הפניה של האזור שבו צולמה סריקת הקו. לחץ מיד על התחלה כפתור כדי ללכוד את סריקת הקו של הספינה. מאוחר יותר, ייבא את סריקות הקווים לתוכנת עיבוד התמונה כדי לקבוע את קצב הזרימה של RBC.
תחת התפריט הנפתח מדידה, פתח את תיבת הדו-שיח הצג סטטיסטיקה של אזור ובחר בכלי ציור קו בודד כדי לצייר קו התואם לשיפוע של צללי RBC. לאחר ציון הרוחב והגובה של הקו, השתמש במשוואה כדי לחשב את המהירות, ולאחר מכן קבל ממוצע של חמישה חישובים כדי לדווח על המהירות עבור כל סריקת שורה. מרכזו גלומרולוס בתחום ההדמיה וקחו סט נתונים תלת-ממדי המתחיל במשטח הגלומרולרי ומסתיים ב-30 עד 35 מיקרומטר.
השתמש בגודל צעד של 1 מיקרומטר בכיוון Z. זהה את ה- WBCs על ידי השוואת ערוץ Hoechst הכחול עם ערוץ האלבומין האדום של טקסס על ידי חיפוש הרחקה של צבע אדום בלולאה הנימית וכתם גרעיני מתאים. אם ה- WBC נראה סטטי על פני שלושה מקטעים אופטיים, הגדר את התאים כדבוקים, ולאחר מכן דווח על הערכים כמופע לכל 10 מקטעים אופטיים מראש הגלומרולוס שצולמו במרווחים של 1 מיקרומטר.
מספר הגלומרולרים לכל שדה בחולדות Wistar Fromter או MWF במינכן הוגדל בקבוצת UUO במשך 5 שבועות מאשר בחולדות שלא טופלו. חולדות ספראג-דאולי, או חולדות SD, עברו ממצב ללא גלומרולי משטח ל-2.02 לכל שדה לאחר חמישה שבועות של חסימת שופכה חד-צדדית. תמונות משוחזרות תלת מימדיות נצפו כדי להציג את פני הכליה.
חסימת השופכה החד-צדדית בת 5 שבועות בחולדות SD לא גרמה לאזורים הדומים לאפיתליה צינורית רגילה כפי שניתן לראות בחולדות MWF, לא מטופלות, ובחלקן בחולדות UUO MWF בנות 5 שבועות. במחקר של הדינמיקה הכלית של כלי הדם, זרימת הדם הכלייתית הופחתה באופן משמעותי בקבוצות UUO MWF ו-SD במשך 5 שבועות, בהשוואה לחולדות שלא טופלו. מהירות ה-RBC בתוך הלולאות הנימיות הגלומרולריות ירדה משמעותית בחולדות UUO MWF ו-SD במשך 5 שבועות, בהשוואה לחולדות MWF שלא טופלו.
בנוסף, לחולדות MWF שלא טופלו היו פחות WBC לכל 10 מקטעים אופטיים מלמעלה, בעוד שהמספר גדל בחולדות UUO MWF של 5 שבועות וחולדות UUO SD של 5 שבועות. עם חסימת שופכה חד צדדית, נצפתה עלייה בחדירות אלבומין. הצטברות אלבומין בחלל באומן הייתה אינטנסיבית לאחר חסימת שופכה חד צדדית.
מקטע S1 אנדוציטוזה כמויות גדולות של אלבומין כפי שנצפה עם מצבים פיזיולוגיים בחולדות MWF שלא טופלו. לא ניתן היה לראות את אותה קליטה בחולדות MWF או SD לאחר 5 שבועות של חסימת שופכה חד צדדית. שיטות רבות ושונות כגון הדמיה חוזרת כדי לחקור תהליך לאורך זמן, קיבוע של אזור מסוים להדמיה, ולאחר מכן ניצול של הרקמה הקבועה כדי לבצע מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יותר יכול להיעשות בשילוב עם טכניקה זו.
הטכניקה נחשבת לטכנולוגיה משבשת. הוא מאפשר לחוקרים לענות על שאלות חדשות רבות. בכך סופקו תובנות חדשות והתקבלו נתונים משנים פרדיגמה.
סקירה כללית
המחקר הנוכחי מציג פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופיה דו-פוטונית כדי לחקור את ההשפעות של חסימה ממושכת של השופכן על הדינמיקה והתפקוד הגלומרולרי בחולדות מסוג Munich Wistar Fromter. הטכניקה מאפשרת תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תאיים ותפקוד הכליה.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביולוגיה
- פיזיולוגיה של הכליה
רקע
- חסימה חד-צדדית של השופכן משפיעה משמעותית על תפקוד הכליה.
- הבנת המנגנונים הפתופיזיולוגיים חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
- מיקרוסקופיה דו-פוטונית מספקת תובנות לגבי הדינמיקה התאית בתוך הכליה.
- המחקר מתמקד בתפקוד גלומרולרי ודלקת.
מטרת המחקר
- להעריך את ההשפעות של חסימה ממושכת של השופכן על תפקוד הכליה.
- לחקור את הדינמיקה של תפקוד גלומרולרי באורגניזם חי.
- לשפר את ההבנה של הפתופיזיולוגיה של הכליה באמצעות טכניקות הדמיה מתקדמות.
שיטות ששימשו
- מיקרוסקופיה דו-פוטונית להדמיית גלומרולי.
- גרימה לחסימה חד-צדדית של השופכן בחולדות.
- מתן Hoechst 33342 לזיהוי תאי דם לבנים.
- ניתוח שיעורי זרימת תאי דם אדומים באמצעות סריקות קו.
תוצאות עיקריות
- הוכחו שינויים משמעותיים בתפקוד הכליה לאחר החסימה.
- זוהו אינטראקציות תאיות ותגובות דלקתיות בגלומרולי.
- סופקו נתונים כמותיים על הדינמיקה הגלומרולרית.
- נחשפו תובנות לגבי מנגנוני הפציעה והתיקון של הכליה.
מסקנות
- המחקר ממחיש בהצלחה את ההשפעה של חסימת השופכן על תפקוד הכליה.
- מיקרוסקופיה דו-פוטונית היא כלי חשוב לחקר הפתופיזיולוגיה של הכליה.
- הממצאים תורמים להבנת מנגנוני מחלות הכליה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative 2-photon microscopy of glomerular processes in chronic unilateral ureteral obstruction (UUO) models enables direct measurement of renal microvascular and cellular dynamics in vivo. This approach provides predictive confidence for mechanistic de-risking and target validation in renal disease research, supporting translational continuity from discovery through preclinical assessment. The method's ability to resolve dynamic physiological and pathophysiological changes in glomerular function is highly relevant for biopharma R&D portfolios focused on kidney disease mechanisms and therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of glomerular microvascular and cellular responses to injury and pharmacological intervention.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying inflammation, permeability, and blood flow changes in disease-relevant models.
- Facilitates functional target validation by linking molecular alterations to physiological outcomes in vivo.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative readouts of glomerular and peritubular blood flow and albumin permeability for assay development.
- Enables reproducible measurement of drug-induced vasoconstriction, vasodilation, and cellular interactions in real time.
- Supports standardization of disease-relevant endpoints for compound screening in renal models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease mechanisms by quantifying translational biomarkers such as albumin permeability and WBC adherence.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insight into renal injury and repair processes.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by integrating dynamic imaging with molecular biomarker approaches.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, mechanistic de-risking, and quantitative assessment of renal function in vivo.
- Discovery Biology: Quantifies glomerular blood flow, permeability, and inflammation to clarify disease pathways and validate targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative endpoints for evaluating compound effects on renal microvasculature and cellular dynamics.
- Analytics: Delivers high-resolution measurements of RBC flow, WBC adherence, and albumin sieving coefficients for comparative analysis.
- Translational Research: Aligns animal model outputs with human disease biomarkers, supporting translational relevance.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and quantification platform for diverse renal disease and intervention studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in renal disease research.
- Operational Value: Standardizes quantitative imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust mechanistic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of renal targets and therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intravital imaging, animal surgery, and quantitative image analysis.
- Demands access to advanced 2-photon microscopy and image processing infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data interpretation.
- Adaptation may be needed for different animal models or disease contexts.
- Interpretation of results may be limited by model-specific alterations such as induced surface glomeruli.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:55
Preparing the Munich Wistar Frmter or SD Rat for Unilateral Ureteral Obstruction (UUO) Surgery
1:53
Surgical Preparation for Intravital 2-Photon Imaging
4:04
Positioning the Rat for Imaging and Image Acquisition for Quantitative Analysis
6:16
Calculating Red Blood Cell Flow in Surface Glomerular Capillary Loops and Renal Vasculature Using a Linescan Function
7:45
Calculating White Blood Cell (WBC) Occlusion in Glomerular Capillary Loops
8:38
Results: Quantification of Glomerular Processes in the Unilateral Ureteral Obstruction (UUO) Model of Rats
10:56
Conclusion
