אנקפסולציה מהירה של שלד ציטוסקי משוחזר בתוך בועיות יונילאמלריות ענקיות

בשנים האחרונות, אנקפסולציה בתוך שלפוחית דו-שכבתית של שומנים בגודל תא הוכיחה את עצמה כשיטה שימושית לניסויים במבחנה. השיטה שאנו מציגים תסייע מאוד בשיקום שלד ציטוסקלטון במחקר תאים סינתטיים. בשיטה זו, אנו יכולים ליצור שלפוחית חד-שכבתית ענקית בגודל הטרוגני עם תפוקה גבוהה.

זמן יצירת השלפוחית מצטמצם באופן משמעותי בהשוואה לטכניקת cDICE הקונבנציונלית. אנו יכולים לתמצת מערכות תרגום-שעתוק ללא תאים המבודדות מתהליכים תאיים מורכבים המתרחשים בו-זמנית כדי לבחון מסלולים מולקולריים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להרכיב פרוטו-תאים מינימליים ליצירת תאים סינתטיים פונקציונליים.

התחילו להכין תערובת שומנים-שומנים על-ידי העברת דיולאויל-פוספוצולין, כולסטרול ורודמין PE לבקבוקון זכוכית של 15 מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף 0.5 מיליליטרים של כלורופורם בבקבוקון. פיפט 7.2 מיליליטרים של שמן סיליקון ו-1.8 מיליליטר של שמן מינרלי בצינור נפרד של 15 מיליליטר ומערבבים את השמנים על ידי מערבולת במהירות של 3, 200 סיבובים לדקה למשך 10 שניות.

לאחר מכן, מוסיפים את תערובת השמן לבקבוקון המכיל את תערובת השומנים והכלורופורמים ומסובבים את התערובת במהירות של 3, 200 סיבובים לדקה למשך 10 עד 15 שניות עד שתערובת השומנים בשמן המתקבלת מעט עכורה, מכיוון שהשומנים אינם מומסים במלואם בשמן. לאחר מכן, sonicate השומנים בפיזור שמן ב- sonicator אמבטיה עם הספק קולי של 80 וואט ותדר הפעלה של 40 קילוהרץ במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. אם לא נעשה שימוש מיידי, יש לאחסן את תערובת שמן השומנים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

כדי ליצור את הבועיות, השתמש במכלול עם פיר מודפס בתלת-ממד העשוי משרף שחור המותקן על לוח ההסקה של הספסל במהירות של 1, 200 סיבובים לדקה. לאחר מכן, הרכיבו את ממשק הטיפות הרציף שהודפס בתלת-ממד על חציית אנקפסולציה, או תא cDICE, העשוי מהשרף השקוף שעל פיר השרף השחור. הכינו תמיסת אקטין של 1 עד 10 מיקרומולריים במאגר אקטין כדורי, או מאגר G, כולל 10%ATO 488 אקטין.

כדי להתחיל בפולימריזציה של אקטין, הוסיפו חיץ פילמור אקטין נימה, או חיץ F, בתמיסת אקטין על קרח ולאחר מכן שמרו את התמיסות על הקרח כדי להאט את פילמור האקטין לפני הוספת קרוסלינקר. כדי להכין את החלבונים הקושרים אקטין, או ABPs, מ-1.75 מיליגרם למיליליטר של מלאי פאסין, אליקוט 1.57 מיקרוליטרים של פאסין במיקרו-צינורית נפרדת. לאחר מכן, הוסף 7.5% ממדיום שיפוע הצפיפות לתמיסת האקטין כדי ליצור שיפוע צפיפות בין הפאזה החיצונית והפנימית מימית ולהקל על בועיות או GUVs חד-מימיות ענקיות, שקיעה.

לאחר מכן, מחלקים 700 מיקרוליטרים של גלוקוז 200 מילימולרי כתמיסה החיצונית לתוך התא. מוסיפים מספיק תערובת שומנים-שמן לתוך החדר עד 60% עד 80% מהתא מתמלא. ייווצר ממשק בין תערובת השומנים-שמן לבין התמיסה החיצונית.

הכינו תערובת אקטין-ABP על ידי העברת ABPs לתמיסת האקטין. לאחר מכן, השתמש בפיפטה רגילה של 100 עד 1, 000 מיקרוליטר כדי להעביר את 700 המיקרוליטרים של תערובת שמן השומנים לתערובת אקטין-ABP. פיפטה למעלה ולמטה שמונה פעמים כדי ליצור טיפות תחליב חד-שכבתיות בגודל תא בקוטר של 7 עד 100 מיקרון.

השתמש באותה פיפטה של 100 עד 1, 000 מיקרוליטר כדי לחלק את כל האמולסיה לתא המסתובב. הטיפות ירכשו עלון שני של שומנים על ידי חציית חד שכבת השומנים בממשק הפתרון החיצוני של השמן, ובכך ייצרו GUVs. בסיום, מוציאים את התא מצלחת הערבוב ומשליכים את רוב תערובת השומנים-שמן על ידי הטיית התא במיכל הפסולת.

על ידי החזקת החדר עם המכסה שלו פונה פנימה, לפתוח את מכסה החדר ולהטות מעט את החדר פנימה. הממשק בין התמיסה החיצונית המכילה GUVs לבין תערובת השומנים-שמן יהיה גלוי מפתח התא שבו נמצא המכסה. השתמש בפיפטה כדי לאסוף מספיק תמיסה חיצונית המכילה GUVs ולחלק 50 עד 300 מיקרוליטרים של הפתרון החיצוני לצלחת של 96 בארות כדי להשיג צפיפות מתאימה של GUVs.

לצורך הדמיית ה-GUVs, הציבו את לוחית הקידוח 96 על הבמה של מיקרוסקופ הפוך המצויד בעדשת מטרה 60X טבילת שמן. פתח רצף תמונות בעל עניין בתוכנת עיבוד תמונה, ImageJ Fiji, וזהה את התמונה בעוצמה הגבוהה ביותר. החזק את Control Shift C כדי לפתוח את חלון הבהירות והניגודיות ולחץ על הכרטיסיה איפוס.

בתפריט ImageJ Fiji, עבור אל הכרטיסיות ניתוח והגדר קנה מידה כדי להזין את המרחק הפיזי והיחידה הידועים עבור כל פיקסל תמונה. לאחר שתסיים, עבור אל הלחצנים Image, Stacks ולאחר מכן 3D Project כדי לשחזר תמונה תלת-ממדית ממחסנית Z. הגדר את שיטת ההקרנה כנקודת בהירות, פרוס ריווח של פרוסה כ- 0.5 מיקרומטרים ולאחר מכן סמן את התיבה אינטרפולציה.

השתמש באפשרויות ברירת המחדל עבור שאר ההגדרות וצילם תמונות. התמונה הייצוגית מציגה תמונה קונפוקלית של GUVs בעלי תווית PE של רודמין עם צרורות פאסין-אקטין עטופים. העברת החלבונים הקושרים אקטין לתמיסת האקטין, ולאחר מכן הוספת תערובת שמן שומנים ויצירה של טיפות חד-שכבתיות שומניות אמורות להתרחש תוך מספר שניות כדי למנוע היווצרות של רשתות אקטין לפני האנקפסולציה.

השתמשנו בטכניקת cDICE שונה זו כדי לבחון את התפקידים של מקשרים צולבים שונים ברשת אקטין בארגון רשתות אקטין. אנו מצפים ששיטה זו תסייע לחוקרים אחרים לחקור את הרגולציה של חלבוני שלד ציטוסקלטון אחרים.