כימות של מינים חמצן תגובתי באמצעות 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate בדיקה וזרימה-Cytometry בתאי גליה מולר
13 במאי 2022
כאן, אנו מציעים פרוטוקול שיטתי, נגיש, לשחזור כדי לזהות מינים חמצן תגובתי תאית (ROS) באמצעות 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate בדיקה (DCFH-DA) בתאי גליה מולר (MGCs). שיטה זו מכמתת את סך רמות ה- ROS התאיות עם ציטומטר זרימה. פרוטוקול זה קל מאוד לשימוש, מתאים וניתן לשחזור.
ישנן מספר שיטות למדידת ייצור ROS, או עקה חמצונית בתאים. בין אלה, 2'7'dichlorofluorescein דיאקאט בדיקה היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר למדידה ישירה של מצב redox. בדיקה זו היא ליפופילית ולא פלואורסצנטית. דיפוזיה של בדיקה זו על פני קרום התא מאפשרת את מחשוף אסטראזות תאיות בשני קשרי אסתר, לייצר מוצר קוטבי יחסית קרום התא אטום. מולקולות לא פלואורסצנטיות אלה מצטברות באופן תאי, והחמצון שלאחר מכן על ידי ROS מניב את המוצר הפלואורסצנטי ביותר דיכלורופלואורסצ'ין. החמצון של הגשוש הוא תוצר של פעולה של סוגים מרובים של ROS. אשר ניתן לזהות על ידי ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופיה קונפוקלית. במאמר זה, השתמשנו בדיקה dichlorofluorescein diacetate כדי למדוד ולכמת ROS על ידי cytometry זרימה. מעבירים צלחות של 6 בארות למכסה מנוע לזרימה למינארית מהחממה. שאפו את הסופר-נאנט. ולשטוף את התאים פעם אחת עם PBS. יש להוסיף 2 מ"ל של DMEM בסרום נמוך לבאר. ולדגור את צלחת 6-well במשך שעתיים באינקובטור. לטפל בתאים עם נוגד חמצון במשך שש שעות. לטפל בתאים עם ממריץ ROS, A או B, במשך 30 דקות. שאפו את הסופר-נאנט. ולשטוף את התא שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את כל הגירויים. כבה את האור של מכסה המנוע לזרימה למינארית ועבוד בחושך. הוסף 1 מ"ל של dichlorofluorescein דיאקטט בדיקה ב DMEM ללא אדום פנול. הוסף 1 מ"ל של DMEM ללא אדום פנול לתאי בקרת בקרת הזרימה האוטומטית של הבקרה. לדגור על צלחת 6-well במשך 30 דקות באינקובטור. העבר את הצלחות על קרח למעבדה. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של PBS קר לכל באר. הוסיפו 0.5 מ"ל של חיץ ניתוק קר לכל באר. לקצור את התאים על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה באמצעות פיפטה P1000. לאסוף אותם בצינור 1.5 מ"ל שכותרתו. וצנטריפוגה אותם ב 600 x g במשך חמש דקות ב 4 C. להשליך את supernatant בזהירות, בעדינות לנתק את הכדור עם הקשה. הוסף 1 מ"ל של מאגר FACS כדי לשטוף את התאים לכל צינור שכותרתו. אם יש צורך, להשתמש במערבולת בעוצמה הנמוכה ביותר עבור ניתוק מלא של הכדור. צנטריפוגה אותם ב 600 x g במשך חמש דקות ב 4 C.חזור על שלב זה פעמיים יותר. שלוש כביסות בסך הכל. Resuspend כדורי תאים ב 200 L של מאגר FACS. בעדינות לנתק לחלוטין את הכדור בכל צינור באמצעות מערבולת. ולהעביר ל-5 מ"ל מסומנים לצינורות ציטומטר זרימה. שמור את הצינורות על קרח עד לנתח על cytometer זרימה. באמצעות תוכנת ציטומטריית הזרימה, צור ניסוי חדש. לחץ על הדגימה ויפתח רשימה של צינורות. לחץ פעמיים ושנה את שמם. מניחים את צינור בקרת הזרימה האוטומטית על זרוע השאיפה, ומזיזים את הבסיס בזהירות רק שמאלה. לחץ על רכש נתונים ולאחר מכן רשום נתונים ובחר את תנאי העצירה הרצוי. צייר שער סביב התאים המעניינים, למעט תאים מתים ופסולת. הסר את הצינור. לחץ על הצינור הבא והפעל את דוגמת הבקרה הבסיסית. לחץ על רכש נתונים ולאחר מכן ב- Record Data.Open את התוכנה. הוסף את הדוגמאות באמצעות לחצן הפעולה הוסף דוגמאות. לחץ על הוסף דוגמה.בחר את התיקיה תאריך ניסיוני ולחץ על Choose.Double לחץ פעמיים על המדגם הראשון בסביבת העבודה שלך, פקד זרימה אוטומטית במקרה זה. צייר שער מצולע כדי לבודד את תא העניין, למעט תאים מתים ופסולת. שנה את העלילה להיסטוגרמה. לחץ פעמיים בתוך ה- M
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לזיהוי רמות של מיני חמצן רבטיביים (ROS) תאיים באמצעות הגשושית 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) בתאי גליאל מילר (MGCs). השיטה תוכננה להיות נגישה, ניתנת לשחזור, ומכמתת ROS באמצעות ציטומטריית זרימה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה תאית
- עקה חמצונית
- מדעי המוח
רקע
- מיני חמצן רהאקטיביים (ROS) ממלאים תפקיד קריטי בתהליכים תאיים שונים.
- מדידה של ROS חיונית להבנת עקה חמצונית בתאים.
- הגשושית DCFH-DA היא שיטה נפוצה לזיהוי ROS.
- הפרוטוקול שם דגש על הדירות וקלות שימוש.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול ברור לזיהוי ROS בתאי גליאל מסוג Müller.
- מתן אפשרות לכימות של עקה חמצונית בתאי עצב.
- סיוע במחקר על תפקידם של ROS בתפקוד גליאלי ובנוירוביולוגיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ביצעו תרבית תאים של תאי גליאל מולר (Müller glial cells) כדי ליצור את המודל הביולוגי.
- התאים טופלו בנוגדי חמצון ובמשרה ROS כדי להעריך את רמות ה-ROS.
- הסממן DCFH-DA שימש לזיהוי ROS ונמדד באמצעות ציטומטריה של זרימה.
- שלבים קריטיים כללו שטיפת תאים ב-PBS ובקרה על החשיפה לאור במהלך הבדיקות.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מדד ביעילות את רמות ה-ROS התאיות בתאי גליאל מסוג Müller.
- ציטומטריה של זרימה סיפקה ניתוח כמותי של הצטברות ה-ROS.
- התוצאות אישרו את ההיתכנות של שימוש בגשושית DCFH-DA תחת התנאים המפורטים.
מסקנות
- מחקר זה מבסס שיטה מהימנה להערכת עקה חמצונית בתאי גליה.
- הפרוטוקול מפשט את מדידת ה-ROS, ובכך משפר את הנגישות עבור חוקרים.
- לממצאים יש השלכות על הבנת עקה חמצונית בנוירוביולוגיה ועל מטרות טיפוליות פוטנציאליות.
שאלות נשאלות שכיחt
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה כמותית של מיני חמצן רהאקטיביים (ROS) בתאי גליא של מילר באמצעות DCFH-DA וציטומטריה של זרימה מאפשרת הערכה רבדית של מנגנוני עקה חמצונית הרלוונטיים למודלים של מחלות ניווניות של מערכת העצבים והרשתית. יכולת זו תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מנגנוניים עבור מודולציה של מסלולים נוגדי חמצון. כימות מהימן של ROS מסייע בקבלת החלטות לגבי תיק המולקולות המועמדות המכוונות להומאוסטזיס של חמצון-חיזור במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של הפעלת מסלולים נוגדי חמצון ו modulate של מצב החמצון-חיזור (redox) במודלים של תאי גליה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות המעורבות בסטרס חמצוני ובמנגנוני הגנה תאיים.
- מספק הפחתת סיכונים מנגנונית עבור התערבויות מועמדות המשפיעות על רמות ROS.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מסייע בהכנת מערכות תאיים שעברו תיקוף לצורך סריקת תרכובות מול מדדי קצה של עקה חמצונית.
- מספק קריאות כמותיות וסטנדרטיות של ROS המתאימות לשחזור של הבדיקה ולהשוואה בין מחקרים.
- מאפשר הערכה מהימנה של השפעות של תרכובות נוגדות חמצון או מחמצנות בפורמט ניתן להרחבה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלות של פתולוגיות רשתית המערבות עקה חמצונית, כגון רטינופתיה סוכרתית.
- תומך ברציפות תרגומית על ידי קישור בין מודולציה של ROS in vitro לבין אסטרטגיות של סממנים ביולוגיים פרה-קליניים.
- מספק מידע לקידום מותאם-סיכון של מועמדים לנוגדי חמצון בהתבסס על תוצאות תאיות כמותיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
סבב עבודה זה לכימות ROS ממוקם בשלב הגילוי המוקדם עד לזיהוי מוביל (lead identification), ותומך הן בבדיקת השערות והן בשילוב עם סריקות המשך.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת ראיות כמותיות למעורבות של מסלולי חמצון-חיזור ותגובה תאית לנזקים חמצוניים.
- סריקה: מספקת מדידות ROS הניתנות לשחזור המבוססות על ציטומטריית זרימה לצורך מיון תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של רמות ROS בין תנאים ניסיוניים שונים באמצעות עוצמת פלואורסצנציה בממוצע גיאומטרי.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מודולציה של עקה חמצונית in vitro לבין נקודות סיום רלוונטיות למחלה במודלים של הרשתית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת בדיקת ROS סטנדרטית הניתנת להתאמה לסוגי תאים שונים ולחומרים מווסתים של חמצון-חיזור.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בגילויים ממוקדי חמצון-חיזור ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: מספק כימות ROS סטנדרטי, ניתן להרחבה וניתן לשחזור עבור תהליכי עבודה בין-צוותיים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go עבור מודולטורים של מסלולי נוגדי חמצון ומשפר את יעילות ההון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים המכוונים למנגנוני עקה חמצונית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתפעול ציטומטריה של זרימה ובניתוח נתונים.
- נדרשת גישה למכשור לציטומטריה של זרימה ולתוכנת ניתוח תואמת.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי gating וכימות פלואורסצנציה.
- ניתן להתאימה למודלים תאיים אחרים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול לטעינת גששים ובקרות.
- תלוי בטיפול קפדני בדגימות כדי למזער שונות במבחן וארטיפקטים מושרי אור.
